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方法文章

聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法检测糖胺聚糖

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DOI：

10.3791/62319

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2021年2月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

本文内容

摘要

本报告描述了从生物样品中分离和纯化硫酸化糖胺聚糖（GAGs）的技术，以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳估算其分子大小的方法。GAGs 通过与蛋白质的静电相互作用参与组织结构的构建，并影响信号传导过程。GAG 聚合物的长度影响其与相应配体的结合亲和力。

摘要

硫酸化糖胺聚糖（GAGs），如硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS），广泛存在于生物体中，在多种基本的生物结构和生理过程中发挥着关键作用。作为多聚物，GAGs 以多分散性混合物的形式存在，包含的多糖链分子量范围从 4000 Da 到超过 40,000 Da 不等。这些多糖链中含有硫酸化结构域，形成负电荷分布模式，从而促进其与相应蛋白配体中的正电荷残基相互作用。GAGs 的硫酸化结构域必须达到足够的长度，才能实现此类静电相互作用。为了理解 GAGs 在生物组织中的功能，研究人员必须能够分离、纯化并测定 GAGs 的大小。本报告介绍了一种实用且通用的基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，可用于分辨从多种生物组织类型中分离得到的 GAGs 在大小上的相对微小差异。

引言

糖胺聚糖（GAGs）是 一类普遍存在于生物体内的线性多糖家族，参与多种基本生理过程1糖胺聚糖（GAGs）如硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）可在多糖链的不同位置发生硫酸化修饰，形成具有负电荷的区域结构域。当这些GAGs共价连接于细胞表面被称为蛋白聚糖的蛋白质时，会延伸至细胞外空间，并与相应的配体结合，从而调控顺式（配体位于同一细胞上）和反式（配体位于邻近细胞上）信号传导过程。2此外，糖胺聚糖（GAGs）还在组织中作为结构成分发挥关键作用，例如肾小球基底膜3，血管内皮糖萼4 肺上皮糖萼5，以及软骨等结缔组织中6.

糖胺聚糖（GAG）多糖链的长度因其生物学背景不同而存在显著差异，并可通过一个高度复杂的酶调控系统进行动态延长、切割和修饰7。重要的是，GAG聚合物链的长度显著影响其与配体的结合亲和力，进而影响其生物学功能8,9。因此，要确定内源性GAG的功能，必须了解其分子大小。然而，与蛋白质和核酸不同，目前可用于检测和定量GAG的技术非常有限，这在历史上导致对该类多样性多糖家族生物学作用的研究相对不足。

本文介绍了如何从大多数生物组织中分离和纯化糖胺聚糖（GAGs），并描述了如何利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以较高的特异性评估所分离聚合物的长度。与其他高度复杂（且常基于质谱）的糖组学方法相比，该方法可使用常规实验室设备和技术进行。因此，这种实用的方法可能有助于拓展研究人员确定天然GAGs的生物学功能及其与特定背景下重要配体相互作用的能力。

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方案

本方案中分析的所有生物样本均来自小鼠，实验方案经科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 肝素硫酸盐的分离

  1. 组织样本的去脂化
    注意：脱脂是富含脂肪组织的可选步骤。
    1. 将甲醇与二氯甲烷按1:1比例混合。每份样品准备约500 μL；较大的组织块可能需要多达1 mL。
    2. 将每个组织样本放入带盖的小型玻璃容器中，用于脱脂。
      注意：样品质量可能因目标组织和实验需求而异。通常50 mg或更少的样品即可获得足够的糖胺聚糖产量，但最终用户可能需要进行一些优化。 
    3. 向每个玻璃容器中加入500 μL甲醇:二氯甲烷溶液并混匀。确保所有固体组织样本完全浸没在溶剂中。
      注意：使用血清移液管或塑料锥形管混合和处理甲醇/二氯甲烷溶液；其他塑料材料可能溶解。
    4. 将样品置于化学通风橱内的固定摇床架上，轻轻振荡1小时。
    5.  振荡样品以充分混匀，然后在17,000 x g 4 °C下离心5分钟。
    6. 小心吸取有机溶剂层（上清液）。此为脂质组分，不含糖胺聚糖（GAGs），可弃去。
      注意：尽量不要搅动组织，以免小块组织丢失。宁可将部分有机层保留在样本容器中，也不要因追求去除有机层而造成样本损失。
    7. 将玻璃容器的盖子保持打开状态，在通风橱中过夜蒸发。下一步更换试管，因为之前的那些 试管将无法承受后续处理。
    8. 一旦溶剂混合物完全蒸发，继续进行机械解聚（如果仍有残留样品） >50 mg）或蛋白酶E消化（< 50 mg 
  2. 固体组织的机械解离（可选；适用于较大的组织样本）
    注意：大多数较小的固体组织块（约50 mg或更少）应在消化步骤中完全溶解。然而，较大的样本需要进行机械解离。
    1. 将待处理的样品放入大小合适的聚丙烯管中，盖紧管盖后浸入液氮中进行速冻。待样品完全冻结至固态。
    2. 使用洁净的研钵和研杵将冷冻样品研磨成粉末状。
    3. 直接进行Actinase E消化（步骤1.4）。
  3. 样品脱盐与浓缩
    注意：此步骤为可选步骤，仅针对稀释的液体组织样本（如支气管肺泡灌洗液（BALF）或血浆）需要执行。
    1. 将液体样本按适当的实验分组进行合并（例如，按生物学重复或实验组别）
    2. 将全部样品体积加入分子量截留值（MWCO）为3,000 Da的500 μL离心过滤柱中。
    3. 离心30分钟，14,000 x g 室温下操作。若所需样品体积超过离心滤柱的容量，可根据需要重复操作。
    4. 用400 μL去离子过滤水洗涤每个柱子3次，弃去流出液。
    5. 倒置滤膜，以2,000 x g离心1分钟 g 置于新鲜且正确标记的收集管中。于 -80 °C 冻存或直接进行下一步操作。
  4. Actinase E 消化
    注意：此步骤旨在消化并最终去除样品中的蛋白质污染物。
    1. 将样品与重组Actinase E按1:1比例混合，使终浓度达到10 mg/mL。加入适量的10倍浓缩消化缓冲液。目标终浓度为：0.005 M醋酸钙和0.01 M醋酸钠，pH 7.5。例如：190 μL液体样品，190 μL 20 mg/mL Actinase E，20 μL 0.05 M醋酸钙，0.1 M醋酸钠。
    2. 轻轻振荡样品以混匀，然后在 55 °C 下消化 48–72 小时（完整组织可长达 7 天）。
    3. 80 °C 加热 15–20 分钟以热灭活 Actinase E。 
    4. 将样品在 -80 °C 冰箱中冷冻，或继续进行步骤 1.5。
  5. 样品脱盐与浓缩
    注意： 如果预期生物样本中目标糖胺聚糖（GAG）的质量较低，或希望节约耗材试剂（如离心过滤柱），可将样本合并，为每个实验组制备单一浓缩液 组（例如，按生物学重复或实验组）
    1. 将全部样品体积加入分子截留量（MWCO）为3,000 Da的500 μL离心过滤柱中。
    2. 以 14,000 x 加速旋转 30 分钟 g 在室温下进行。若所需样品体积超过离心滤柱的容量，可根据需要重复操作。
    3. 用 400 μL 去离子过滤水洗涤每个柱子 3 次，弃去流出液。
    4. 倒置滤膜并以 2,000 x g 离心 1 分钟 g 置于新鲜且正确标记的收集管中（通常随离心滤柱一同提供）。于 -80 °C 冻存，或直接进行下一步操作。
  6. 干燥处理
    1. 将步骤1.5.5中溶解的样品置于旋转真空浓缩仪中过夜，或按以下说明进行冻干处理。
    2. 将样品在 -80 °C 冰箱中冷冻过夜，或浸入液氮中，确保充分冻结。
    3. 用18号针头刺穿样品管盖，并将其放入冻干机腔室中。根据需要添加纸巾进行填充。
    4. 将冻干机腔室连接至冻干机，于-40 °C、0.135 Torr条件下冷冻干燥过夜
  7. 阳离子交换柱
    1. 将干燥样品重悬于最多 400 μL 的 8 M 尿素、2% CHAPS 溶液中（若合并样品，则重悬体积最大为 (400/n) μL，其中 n 为所需合并的样品数量）。尽量使用少量去垢剂溶液。
    2. 用 400 μL 的 8 M 尿素、2% CHAPS 溶液平衡阳离子交换（IEX）柱，在 2,000 x g 下离心 5 分钟 g 在室温下
    3. 将400 μL样品或混合样品加入IEX柱中。在2,000 x g条件下离心5分钟。 g.
    4. 用 400 μL 的 8 M 尿素、2% CHAPS 溶液洗涤 3 次，每次在 2,000 × g 下离心 5 分钟。 g 每次
    5. 用 400 μL 的 0.2 M NaCl 洗脱 3 次。在 2,000 x g 条件下离心 5 分钟。 g 每份。这是低亲和力组分——如有需要，可保留用于质量控制。
    6. 用 400 μL 的 2.7 M（16%）NaCl 洗脱 3 次。在 2,000 x g 条件下离心 5 分钟 g 每份均含有目标分离的糖胺聚糖——请全部保留！
    7. 为使每份洗脱组分脱盐，加入甲醇至终体积的80%，并在4 °C孵育过夜。将每个样品在2,000 x g下离心5分钟 g回收固体残留物，此即为干燥脱盐后的糖胺聚糖。
      注意：或者，可跳过此步骤，直接进入步骤 1.8，对洗脱液进行脱盐处理（无需使用甲醇）。
  8. 样品脱盐与浓缩
    1. 如有需要，将洗脱组分（来自1.7.6）按适当的实验分组（例如，按生物学重复或实验组）合并。
    2. 将全部样品体积加入分子截留量（MWCO）为3,000 Da的500 μL离心过滤柱中。
    3. 离心30分钟，14,000 x g 在室温下进行。若所需样品体积超过离心过滤柱的容量，可按需重复操作。
    4. 用400 μL去离子过滤水洗涤每个柱子3次，弃去流出液。立即进入步骤1.9。
  9. 软骨素消化
    注意：此步骤的目的是去除对最终用户无关注的糖胺聚糖（GAGs）。在此情况下，使用软骨素酶去除软骨素。在用于生成的组织中 代表性结果 （支气管肺泡灌洗液和全肺组织）中，消化去除硫酸软骨素后，硫酸乙酰肝素成为主要残留的糖胺聚糖。最终使用者可能需要根据实验目的增加额外的消化步骤。 
    1. 将350 µL消化缓冲液（50 mM醋酸铵，含2 mM氯化钙，调至pH 7.0）加入离心过滤柱中，注意勿接触滤膜。
    2. 加入5 µL重组软骨素酶ABC。
    3. 将样品管放入37 °C的烘箱中孵育1小时。
    4. 将柱子倒置并放入相应标记的收集管中。以2000 x g离心1分钟。 g.
    5. 将样品在 80 °C 加热 15–20 分钟，以灭活软骨素酶 ABC。
  10. 样品脱盐与浓缩
    1. 如有需要，将步骤1.9.5中经软骨素消化的样品按适当的实验分组（例如，按生物学重复或实验组）合并。
    2. 将全部样品体积加入分子截留量（MWCO）为 3,000 Da 的 500 μL 离心过滤柱中。
    3. 离心30分钟，14,000 x g 室温下操作。若所需样品体积超过离心滤柱的容量，可根据需要重复操作。
    4. 用 400 μL 去离子过滤水洗涤每个柱子 3 次，弃去流出液。
    5. 倒置滤芯，以2,000 x g离心1分钟 g 置于新鲜且正确标记的收集管中。于 -80 °C 冻存或进行下一步操作。
  11. 干燥处理
    注意：此步骤中，干燥是必要的，以便样品能够用尽可能少的溶液重新悬浮。 水和运行缓冲液的量
    1. 将步骤1.10.5中经软骨素消化的样品直接置于旋转真空浓缩仪中过夜，或按如下方法进行冻干：
    2. 将样品在 -80 °C 冰箱中过夜或浸入液氮中，彻底冷冻。
    3. 用18 G针头刺穿样品瓶盖，并将其放入冻干机腔室中。根据需要添加纸巾进行填充。
    4. 将冻干机腔室连接至冻干机，于-40 °C、0.135 Torr条件下冷冻干燥过夜

2. 分离纯化糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1. 提前配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所需的各种溶液（表1）。
    注意：根据样品中预期的糖胺聚糖大小选择分离胶溶液的丙烯酰胺百分比。建议使用15%的凝胶分离较大的片段（长度大于30个二糖亚基）；使用22%的凝胶分离较小的片段（<20个二糖亚基）。
  2. 将空胶板放入PAGE电泳槽中。按以下步骤制备分离胶：在15 mL离心管中，加入10 mL分离胶溶液、60 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和10 μL TEMED（最后加入TEMED）。轻轻倒置混匀2–3次。使用移液器迅速将上述10 mL溶液加入胶板中，然后在上层覆盖2 mL去离子过滤水，静置30分钟使分离胶充分聚合。
    注意：以下PAGE操作流程已针对使用13.3 × 8.7 cm（宽×长）、厚度1.0 mm、总体积约12 mL的制胶胶板的垂直PAGE系统进行优化。其他胶板系统也可使用，但可能需要用户自行优化条件。
  3. 待分离胶完全聚合后，弃去上层覆盖的水，按以下步骤制备浓缩胶：在15 mL离心管中，加入3 mL浓缩胶溶液、90 μL 10%过硫酸铵（必须新鲜配制）和3 μL TEMED（最后加入TEMED）。
  4. 轻轻倒置混匀2–3次。使用移液器迅速将浓缩胶溶液加至已固化的分离胶上方，加至胶板满溢。将配套的梳子完全插入。静置30分钟，使浓缩胶充分聚合。
  5. 待凝胶完全聚合后，确保已从胶板底部移除底部密封条，并将胶板重新安装至PAGE电泳槽组件中。
  6. 分别向上、下电泳槽中加入上槽缓冲液和下槽缓冲液。
  7. 将步骤1.11.4中干燥的样品溶解于最小必要体积的去离子过滤水中（最多不超过PAGE凝胶加样孔体积的50%）。按1:1比例与上样缓冲液混合。将样品及HS寡糖"分子量标准品"（见表1）上样至凝胶孔中。
  8. 以100 V预电泳5分钟，随后以200 V进行电泳：对于15%聚丙烯酰胺分离胶，电泳时间为20–25分钟；对于18%聚丙烯酰胺分离胶，为40–50分钟；对于22%聚丙烯酰胺分离胶，为90–100分钟。
    注意：200 V下的电泳时间可能需要适当优化。酚红的迁移位置位于长度为2个聚合亚基（即聚合度2，dp2）的肝素寡糖之前；溴酚蓝的迁移位置位于dp10–dp14片段之前。当施加电压使酚红条带迁移至接近但尚未到达凝胶底部时，可获得最佳分离效果。请据此调整电泳时间。

3. 银染色实验方案

  1. 提前准备好银染所需的所有溶液（表2）。
    注意：在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶完成染色、显影并放入终止液之前，请勿直接用手接触胶。应使用洁净的塑料或玻璃工具操作胶。直接用手接触会导致染色后胶上出现指纹干扰及其他可见的人工假象。 
  2. 电泳结束后，拆卸胶板，将胶转移至一个洁净的中等偏大的容器中，容器内装有去离子过滤水。
    注意：为避免直接接触胶，可在水中使用移液枪头或其他塑料工具轻轻将胶从玻璃板上剥离。胶体可能较脆弱，请小心操作。
    1. 弃去水，将胶在阿尔新蓝染色液中染色5分钟。
    2. 弃去阿尔新蓝染色液，用去离子过滤水快速漂洗/洗涤2-3次，直至大部分染色液被去除。
    3. 将胶置于去离子过滤水中，在摇床中脱色过夜。确保使用足量的去离子过滤水，以保证残留染料在过夜过程中被彻底洗去。
    4. 用50%甲醇洗涤胶（共40分钟，期间更换溶液2-3次）。
    5. 用去离子过滤水洗涤胶30分钟，弃去水，重复此步骤3次，总计2小时，每次均更换新水。
    6. 在新的洁净容器中，将胶置于硝酸银染色液中染色30分钟。
    7. 用去离子过滤水快速漂洗/洗涤2-3次，彻底去除硝酸银染色液。
    8. 用去离子过滤水洗涤30分钟，弃去水，重复此步骤2次，总计90分钟，每次均更换水浴。
    9. 弃去水，加入显影液。
    10. 加入显影液后，仔细观察胶，注意条带的出现。显影时间可能从几秒到数分钟不等，具体取决于染色质量和上样量。
    11. 一旦观察到所需条带，立即弃去显影液，并用终止液短暂洗涤。
    12. 弃去终止液洗涤液，更换为新鲜的终止液，置于摇床或振荡器中浸泡1小时。
    13. 在去离子过滤水中洗涤过夜（但胶在终止液洗涤后即可进行成像）。

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结果

阿利新蓝用于染色硫酸化糖胺聚糖（GAGs）10；后续使用银染可增强该信号11。图1直观展示了银染显色的发育过程。如图所示，随着显影剂渗入聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后的GAGs所显示的阿利新蓝信号被放大。通常情况下，显影过程会以密度依赖的方式还原银染和阿利新蓝染色的GAGs，每条条带的边缘区域首先被还原，而中心染色较深的区域则最后着色。

文献中报道的基于PAGE方法检测糖胺聚糖（GAGs）的检测限范围为0.5–1 µg12,13。为确定本方法的检测限，将不同聚合度的硫酸乙酰肝素寡糖（未分级肝素、dp20、dp10、dp6）分别以1.0 µg和0.5 µg两种质量重复上样至22%聚丙烯酰胺凝胶中，随后按照前述方法进行电泳和染色。结果表明，本技术可清晰检测到0.5 µg纯化的GAG。

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讨论

糖胺聚糖（GAGs）在许多不同的生物学过程中起着核心作用。硫酸化GAGs（如HS和CS）的主要功能之一是与配体相互作用并结合，从而改变下游信号传导功能。GAG与其对应配体结合亲和力的一个重要决定因素是GAG聚合物链的长度8,9,14。因此，研究人员能够以合理的精确度确定从目标生物样本中分离出的GAG链的大小显得尤为重要。为了具备实用性，该技术应能够使用常见的实验室设备和试剂完成。

本方案描述了一种从生物样品中分离和纯化糖胺聚糖（GAGs）的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子大小进行分离，并利用阿利新蓝和银染技术对其进行可视化检测。尽管存在多种按大小分离糖胺聚糖的方法，但本方法在生命科学实验室的应用中具有若干独特优势。首先，该技术对GAGs的检测限可达0.5 µg，具有很高的灵敏度。根据我们的经验，即使是GAGs浓度相对较低的样品（例如支气管肺泡灌洗液样品），也能够通过本方法检测到足够量...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由 F31 HL143873-01（WBL）和 R01 HL125371（RJL 和 EPS）资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accuspin Micro17 台式微量离心机thermoFisher Scientific13-100-675任何能够达到 14000 ×g 的台式微量离心机/转子组合均可使用
丙烯酰胺（固体）thermoFisher ScientificBP170-100电泳级
Actinase ESigma AldrichP5147来自 S. griseus 的蛋白酶混合物
阿利新蓝 8GX（固体）thermoFisher ScientificAC400460100
乙酸铵（固体）thermoFisher ScientificA639-500分子生物学级
氢氧化铵（液体）thermoFisher ScientificA669S-500符合 ACS 认证标准
过硫酸铵（固体）thermoFisher ScientificBP179-25电泳级
Barnstead GenPure Pro 水纯化系统ThermoFisher Scientific10-451-217PKG任何去离子/纯化水系统均可作为替代
硼酸（固体）thermoFisher ScientificA73-500分子生物学级
溴酚蓝（固体）thermoFisher ScientificB392-5
乙酸钙（固体）ThermoFisher Scientific18-609-432分子生物学级
氯化钙（固体）ThermoFisher ScientificAC349610250分子生物学级
CHAPS 去垢剂（3-((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐）ThermoFisher Scientific28299
软骨素酶 ABCSigma AldrichC3667
Criterion 空 PAGE 胶盒（1.0 mm 厚，12+2 孔）Bio-Rad3459901任何 1.0 mm 厚的 PAGE 制胶胶盒系统均可满足要求
Criterion PAGE 电泳系统（电泳槽及电源）Bio-Rad1656019任何类似的垂直凝胶 PAGE 系统均可使用
二氯甲烷（液体）thermoFisher ScientificAC610931000符合 ACS 认证标准
乙二胺四乙酸二钠盐（固体）thermoFisher Scientific02-002-786分子生物学级
冰乙酸（液体）thermoFisher ScientificA35-500符合 ACS 认证标准
甘氨酸（固体）thermoFisher ScientificG48-500电泳级
肝素酶 I/IIISigma AldrichH3917来源于 Flavobacterium heparinum
来源于肝素的十糖（dp10）galen scientificHO10
来源于肝素的六糖（dp6）Galen scientificHO06
来源于肝素的寡糖（dp20）galen scientificHO20
盐酸（液体）thermoFisher ScientificA466-250
冷冻干燥机Labconco7752020任何能够达到 -40°C 和 0.135 Torr 的冷冻干燥机均可使用；也可用旋转式真空浓缩仪替代
甲醇（液体）thermoFisher ScientificA412-500符合 ACS 认证标准
Molecular Imager Gel Doc XR 凝胶成像系统Bio-Rad170-8170任何类似的凝胶成像系统均可作为替代
N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（固体）thermoFisher ScientificBP171-25电泳级
酚红（固体）thermoFisher ScientificP74-10游离酸形式
Q Mini H 离子交换柱VivapureVS-IX01QH24离子交换柱的最小上样体积应为 0.4 mL，工作 pH 范围为 2–12，且对 pKa 为 11 的离子基团具有选择性
硝酸银（固体）thermoFisher ScientificS181-25符合 ACS 认证标准
乙酸钠（固体）ThermoFisher ScientificS210-500分子生物学级
氯化钠（固体）thermoFisher ScientificS271-500分子生物学级
氢氧化钠（固体）thermoFisher ScientificS392-212
蔗糖（固体）thermoFisher ScientificBP220-1分子生物学级
TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）thermoFisher ScientificBP150-20电泳级
Tris 碱（固体）thermoFisher ScientificBP152-500分子生物学级
超滤离心管，0.5 mL，截留分子量 3000 DaAmiconUFC500324可根据样品体积选用更大容量的滤膜装置。 
尿素（固体）ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001任何旋转式真空浓缩仪均可使用；也可用冷冻干燥机替代
真空滤器，一次性使用，孔径 0.22 µm，聚醚砜（PES）膜，容量 500 mLthermoFisher Scientific569-0020其他容量和滤膜材料亦可接受

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