使用大鼠模型研究短时低温诱导的临床相关性与机制

摘要

本文介绍了两种在大鼠中进行全身短时低温诱导的方法。第一种为快速诱导法，采用风扇和乙醇喷雾进行主动降温，以实现体温的迅速下降。第二种方法为逐步降温法，通过联合使用异氟烷麻醉和降低恒温加热垫的温度设定，实现核心体温的逐步下降，无需使用任何外部降温设备。 

摘要

治疗性低温（TH）是一种强大的神经保护策略，在神经系统疾病的临床前研究中已提供了强有力的神经保护证据。尽管临床前证据充分，但在大多数神经系统疾病的临床试验中，治疗性低温并未显示出疗效。迄今为止，唯一取得成功的临床试验仅限于成人心脏骤停和新生儿缺氧缺血性损伤。因此，有必要进一步研究其应用参数，并对临床前研究与临床研究之间的研究设计进行比较分析。本文展示了两种短时程低温诱导方法。第一种方法通过乙醇喷雾结合风扇实现大鼠的快速低温诱导，其原理是通过皮肤降温，该方法在临床试验中较少使用，可能具有不同的生理效应。由于表面积与体积比的差异，该技术的降温速度远快于人类患者所能达到的程度。此外，本文还介绍第二种方法，可实现临床上可行的降温速率，适用于短时程低温治疗。该方法易于实施、可重复性强，且无需主动进行皮肤降温。

引言

亚低温治疗（TH）是指通过降低机体或脑部温度，以保护器官/系统的活力和功能^1,2。关于低温在神经保护中的作用已有广泛研究，在多种神经系统疾病的临床前模型中均显示出益处，例如脑卒中³、蛛网膜下腔出血⁴和创伤性脑损伤⁵。在临床应用方面，亚低温治疗在心脏骤停后患者以及新生儿缺氧缺血性脑损伤中已证实具有疗效⁶。

诱导低温（TH）可通过体表降温或血管内降温方法实现。大多数临床前低温研究采用体表降温，通过将水或乙醇涂抹于动物毛发，或使用降温毯来达到目标温度¹。在人类中，系统性体表降温通常使用冰袋和降温毯实现^7,8。研究表明，采用血管内方法可实现更快的降温速度，该方法结合通过静脉或动脉导管输注冷盐水诱导降温，并在下腔静脉内置入血管内降温装置^9,10。例如，在患者中，采用血管内降温可在1.5小时内达到33 °C的中等目标温度，而体表降温则需3至4小时¹¹。近年来，血管内降温方法也日益普及，因其被报道可减少系统性体表降温所引起的一些副作用，例如寒战^12,13。欧洲多中心随机III期缺血性卒中低温治疗临床试验（EUROHYP-1）主要采用体表降温¹⁴。该试验近期发表的结果显示，寒战是主要并发症，可能限制了达到目标温度的能力¹⁰。已知寒战反应主要由皮肤温度驱动。尽管已有研究尝试建立大鼠血管内降温模型¹⁵，但该技术相较于人类应用更具侵入性，可能干扰模型所得结果的可靠性。

体温是调节机体生物过程的关键因素，并由稳态机制进行严密调控。因此，任何对体温的干预都可能带来相关风险。降温持续时间可能是限制低温疗法临床试验成功的一个因素。这些试验采用长时间降温方法，许多研究将低温状态维持24至72小时¹¹。这种延长的降温时间在降温过程中增加了感染风险。肺炎是低温治疗最常见的并发症，影响接受该治疗的40%至50%患者¹³。这与通常在动物低温研究中观察到的情况形成对比，后者采用短时程方案（1–6小时）³。这些临床前动物研究的成功很可能推动短时程低温疗法在今后临床试验中的应用。因此，有必要建立一种短时程低温动物模型，其降温速率应与未来临床试验中的降温速率相接近。有关其他温度参数及短时程低温有效性的更多细节已在多篇综述文章中讨论过^1,16,17,18。

本文展示了一种渐进式降温模型，其降温过程比目前的实验性低温模型更接近临床实际可实现的条件。该新方法的降温速率显著更慢，因此达到目标温度所需的时间更接近于低温治疗临床试验中观察到的范围¹¹。此外，该方法避免了直接的体表降温，而体表降温具有特定的生理效应，因此本方法可能更类似于血管内降温，后者是临床试验中最常用的降温方式^9,12。该模型允许动物在2小时内逐步降温，随后在目标温度维持较短时间。此外，本文还展示了快速降温短时程低温方法¹⁹。快速降温法可在低温开始后迅速达到目标温度。尽管该方法在临床相关性上不如渐进式降温法，但对于旨在探索低温神经保护机制的研究具有重要价值，有助于通过药物模拟其强大的神经保护效应。该方法在神经科学以外的领域也具有潜在应用价值，可适用于多种临床前研究。与其它方法相比，这两种方法的另一优势在于成本低廉，且无需专用设备。最后，本方案还演示了温度数据记录仪的植入操作，因为术后复温及其监测至关重要，可防止意外的术后低温，避免对研究结果造成干扰²⁰。

方案

所有实验操作均遵循《澳大利亚科研用途动物护理与使用规范》，并经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准（A-2013-343 和 A-2020-003）。除下文所述的低温诱导方法外，以下操作通常与低温处理联合进行：股动脉插管以监测血压和心率²¹，以及实验性脑卒中模型²²。

1. 数据记录仪植入

注意：本方案中使用的数据记录仪设备无法实时读取体温数据。只有在将数据记录仪从动物体内取出并重新连接至计算机后，才能进行数据读取。因此，在降温与复温过程中，需使用直肠温度探针来提供实时温度信息。此外，直肠探针在本方法中也至关重要，因为在手术过程中，动物所放置的加热垫的温度调控依赖于直肠探针系统。数据记录仪同样具有重要价值，可提供自由活动、清醒状态大鼠的体温数据，对于确保复温后维持正常体温具有重要意义。因此，这两种温度监测设备在本方案中均不可或缺。

1. 使用异氟烷（诱导浓度5%，维持浓度2-2.5%）与50% N₂和50% O₂混合气体，对10至12周龄雄性远交系Wistar大鼠进行麻醉。
2. 麻醉后，将大鼠俯卧位放置于手术加热垫上。
3. 调整大鼠位置，使其鼻部置于鼻罩内，并用手术胶带固定鼻部，确保无气体泄漏。
4. 剃除右下腹部毛发，并在皮下注射0.2 mL、0.05%的布比卡因局部麻醉剂。
5. 对 freshly 剃除毛发的区域涂抹消毒液。
6. 使用灭菌外科器械，在右侧腹部区域沿右大腿近端做一条长约2 cm的纵向切口，切口深度应足以暴露腹股沟区域的皮下间隙。
7. 使用止血钳和镊子在皮下分离出一个足够容纳设备的“囊袋”。
8. 将温度监测数据记录仪植入该囊袋中，并使用5-0丝线缝合肌肉层和皮肤。此处所述的皮下植入方法优于腹腔内植入法，因其侵入性更小，术后恢复更佳。
9. 确保数据记录仪与直肠探头在温度监测方面已进行交叉校准（见讨论部分）。
10. 植入后应确保数据记录仪未接触动物所处的加热垫，以免影响温度读数。

图 1：数据记录仪的植入。（A）从左至右的图示显示在大鼠下腹部右侧做一个约 2 cm 的切口。（B）将温度监测数据记录仪插入皮下切口形成的囊袋中。（C）使用尼龙缝线关闭切口。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 用于机制研究的主动（快速）低温诱导

1. 准备低温处理装置（参见 图2）。在大鼠身体两侧各放置一个带夹子的铁架台。
2. 将一个60 mm、12 V/130 mA的风扇固定在每个铁架台上，确保风扇朝向大鼠的下背部。夹子与大鼠之间的距离约为20 cm。所用风扇必须具有4,000 rpm的转速。
3. 准备一盏动物用加热灯，可置于侧面或安装在第三个铁架台上。
4. 通过调节动物加热垫至目标温度来开始诱导低温。本示例中目标温度为32.5 °C（温度控制单元上显示为3.75）。
5. 打开两个风扇，并在大鼠下背部喷洒三到四次70%乙醇（使用标准塑料喷雾瓶）。喷洒时拨动动物毛发以加快冷却诱导。
   注意：乙醇优于水，因其蒸发速率更快，因而可实现更迅速的低温诱导。
6. 注意不要过度浸湿毛发，以免导致体温低于目标温度。
   注意：风扇将加速乙醇蒸发并加快冷却过程。
7. 在每次喷洒乙醇之间留出短暂间隔，同时密切监测大鼠的直肠温度。
8. 当直肠温度接近目标温度1 °C范围内时，停止进一步喷洒乙醇。
9. 当温度达到目标温度0.5 °C范围内时（本例中为33 °C），关闭两个风扇。
   ​注意：在达到目标温度前关闭风扇有助于防止大鼠过度冷却。
10. 让体温自然下降至32.5 °C。
    1. 若发生过度冷却，可使用动物加热灯轻微加热动物，使其恢复至目标温度。必要时可开启一个风扇以防止复温过冲。
11. 一旦达到目标温度并保持稳定，继续监测体温。在随后的低温维持期间，体温通常会保持非常稳定，无需进一步喷洒乙醇、使用风扇或加热灯。
12. 在低温处理结束时对动物进行复温，将加热垫温度调回37 °C（本示例所用温度控制单元上为6），并让动物在30分钟内逐步恢复体温。
    ​注意：不同温度控制单元的温度设置可能存在差异，因此有必要针对具体设备确定目标低温和正常体温对应的设置参数。

3. 在无需主动皮肤降温的情况下诱导临床上可实现的渐进性低体温

1. 通过逐步小幅降低恒温加热垫的核心温度，达到所需的靶温度。在图示示例（图3B）中，每30分钟降低1°C。
2. 在所需时间内（如示例中为2小时）将动物冷却至靶温度。达到靶温度后，维持该温度至所需时长。通常情况下，若动物持续置于设定为目标温度的恒温加热垫上，则无需额外干预。
3. 本方案无需外部冷却，因为麻醉会抑制机体对核心体温的正常调节。
   ​注意：随着体温降低，异氟烷的需求量减少。在大多数动物中，起始异氟烷浓度为2%，可每20–30分钟降低0.1%，逐步降至1.5%，以维持稳定的呼吸频率（>50次/分钟）、心率和血压，并持续抑制反射反应。
4. 低温处理后如需复温，调节加热垫，使动物在目标时间内逐渐升温。在本示例中，通过将加热垫一次性调节至37°C（示例中使用的FHC温度控制单元上设定为6），在30分钟内完成复温。
   1. 对于需要动物恢复的长期研究，将动物置于笼中，笼体一半覆盖加热垫，以便动物进行体温调节，并避免术后意外发生低体温。
   2. 可给予直肠用对乙酰氨基酚（250 mg/kg）以促进恢复并提供过夜镇痛。也可皮下注射生理盐水（2 × 1.5 mL），以预防麻醉和手术操作引起的脱水。

结果

图3A 展示了采用快速降温方法时，Wistar 大鼠对低体温的反应过程。通过使用风扇和70%乙醇喷雾实现低体温的诱导，目标体温32.5 °C可在15分钟内达到。在维持目标温度期间，必须谨慎协调风扇/加热灯与乙醇喷雾的使用，以实现精细的温度调控。如图3A所示，可观察到轻微的温度过冲现象，这通常发生在降温未在接近目标温度约0.5 °C时提前停止的情况下。目标温度在30分钟时得以维持并稳定，并于1.5小时开始复温过程。

图3B 显示了逐步降温方案，其中目标温度在2小时时达到33 °C，并维持30分钟，随后在2.5小时时开始复温。在此方案中，温度以逐步递增的方式调节，从而延长了达到目标温度所需的时间。两幅图中的垂直虚线表示降温持续时间。

图3A 和 图3B 来源于数据记录仪设备。实验开始时，预先对数据记录仪进行编程，使其在植入前开始记录。实验结束时，将数据记录仪从动物体内取出，并通过USB端口连接至配套的温度读取器。软件（例如 eTemperature）读取并生成数据，随后可导出至电子表格软件中。

图 2：快速降温方案的设置。（A）在大鼠下背部区域上方放置两个风扇（黑色箭头）。开始诱导低温时，同时开启两个风扇，并向下背部喷洒乙醇。乙醇与风扇的联合作用有助于加快体温下降，从而快速达到目标温度。（B）使用加热灯（白色箭头）以防止体温过低过度下降。一旦达到目标温度，即开启加热灯以防止大鼠核心体温进一步降低。待体温稳定后，关闭加热灯和/或剩余运行的风扇。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：采用主动（A）和渐进（B）方法诱导低温。（A）在上述示例中，通过主动降温过程在15分钟内达到目标温度，并维持60分钟后对动物进行复温。（B）通过渐进降温方法在2小时内达到目标温度，并维持30分钟后对动物进行复温。两个图表中的阴影区域表示目标温度维持的时间段。两个图表中的垂直虚线表示总体降温持续时间。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

此处所述的操作方法简便易行、无创，可实现核心体温可靠且可重复地降低至预期目标温度。

快速降温方法中包含若干关键步骤，如下所述。乙醇喷雾不可过量——必须注意避免将动物浸透在乙醇中，否则会影响实验结果。在诱导低体温期间需密切监测动物——必须密切观察动物对快速诱导低体温的反应。应密切监测直肠温度，以确保温度不低于预设目标值；若发生此类情况，应立即关闭风扇，并开启加热灯，使动物体温缓慢回升至所需目标温度。

两种方法中，生理监测均至关重要，以确保麻醉剂量的适当调整。在长时间降温过程中，麻醉剂量不足可能会延长降温持续时间。此时，可逐步增加异氟烷浓度，直至达到理想的降温速率。另一个关键步骤是温度设备的交叉校准。当实验中同时使用由温度探针调控的加热垫和数据记录仪时，最佳做法是在活体条件下将数据记录仪与直肠探针进行交叉校准，因为两种设备所记录的温度可能存在微小差异。

这些方法适用于希望探索低温治疗作为神经系统疾病潜在疗法的研究。具体研究目的应决定所采用的方法。两种方法均可归类为全身性体表降温，但第二种方法无需主动降温。上述渐进式降温模型在缺血性卒中治疗中应用低温疗法具有重要的潜在价值。长时间低温治疗及其引发的并发症对老年卒中患者构成挑战。此外，寒战反应使得部分患者难以达到目标温度¹⁰。尽管抗寒战药物有助于减轻寒战反应，但短时程的渐进降温可能更有效地缓解这一问题。较短的降温时间还可能降低临床试验中常报告的肺炎发生率。该短时程方法的另一个潜在优势在于，与长时程降温相比，复温速度的重要性可能降低。早期针对大面积梗死卒中患者进行长时程低温治疗的临床研究发现，快速复温会导致颅内压（ICP）显著升高，从而加重病情，且常导致死亡。这促使人们发展了渐进式复温方案，进一步延长了整体降温时间。短时程降温仅在短时间内维持目标温度，可能更不易引起反跳性颅内压升高。以往研究采用与本文所述相似的快速降温和复温方案，针对颅内压升高进行低温治疗，结果显示复温后未出现反跳性颅内压升高^23,24。

低温治疗缺血性卒中的临床试验未能将实验研究中报道的低温益处转化为临床效果。实验模型与患者之间在降温速率和持续时间上的差异，是可能导致这种不一致的重要变量。建立一个更接近临床降温速率的低温实验模型，将有助于更深入地探讨低温作为卒中患者治疗措施的有效性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	用去离子水稀释，配制成70%乙醇
消毒液（氯己定）	David Craig	A2957
麻醉剂（Marcain）	Aspen	PS13977
无刷风扇电机	Sirocco	YX2505	2 × 12 V/130 mA
加热灯	Reptile One	AC220	240 V 50/60 Hz
加热垫	FHC, Inc	40-90-2
直肠探头	FHC, Inc	40-90-5D-02
温度控制器	FHC, Inc	40-90-8D
温度数据记录仪	Maxim	DS1922L-F5