本文展示了一种优化的技术，通过离体人皮肤结合整体染色方法来评估伤口修复。该方法为潜在伤口治疗手段的临床前评价提供了平台。
本文内容
摘要
摘要
慢性难愈合伤口主要影响老年人和糖尿病患者，是临床上尚未满足的重要医疗需求领域。遗憾的是，目前针对慢性伤口的治疗方法仍不充分，而已有的临床前模型难以准确预测新疗法的临床疗效。本文介绍一种高通量的临床前模型，用于评估人类皮肤修复反应的多个方面。在离体人皮肤上制造部分厚度伤口，并在愈合时间过程中进行培养。收集皮肤伤口活检样本，用固定剂处理后进行整体染色。固定后的样本经封闭后与一抗孵育，再通过荧光标记的二抗实现检测。伤口组织经复染后使用共聚焦显微镜成像，并计算每个活检样本的伤口闭合百分比（再上皮化程度）。应用该方案，我们发现健康供体皮肤上制造的2 mm切除性伤口在受伤后第4–5天即可完全再上皮化。相反，糖尿病患者皮肤伤口的闭合速率显著降低，并伴有屏障重建紊乱。将人类皮肤损伤模型与新型整体染色方法相结合，提供了一种快速且可重复的定量分析离体皮肤愈合反应的方法 关键词：慢性伤口，糖尿病足溃疡，皮肤修复，再上皮化，整体染色，共聚焦显微镜，离体模型，伤口闭合率 伤口修复。总体而言，该方案提供了一个有价值的体外人类研究平台，可用于评估潜在伤口治疗手段的有效性，从而推动临床前测试与验证的发展。
引言
慢性难愈性伤口在老年人群和糖尿病患者中高度普遍，是临床上长期被低估的未满足医疗需求领域。这类伤口给患者带来巨大的生理和心理负担，每年用于治疗的医疗支出高达数十亿美元1。尽管对伤口生物学的理解不断深入，且技术持续进步，但在接受最佳标准治疗后，仍有高达40%的慢性伤口无法愈合2。因此，14%至26%的糖尿病足溃疡患者最终需要接受截肢治疗3，而截肢术后5年死亡率约为70%4。因此，迫切需要开发有效的新型疗法，以改善患者生活质量，并减轻难愈性伤口带来的巨大医疗负担。目前，临床前模型预测能力不足仍是开发有效新疗法的重要障碍。
伤口修复是一个动态且多方面的过程，涉及多种细胞类型、多层次的细胞间通讯以及随时间不断重塑的组织微环境。皮肤愈合主要依赖于四个关键修复阶段：止血、炎症、增殖和基质重塑。这些阶段共同作用，以防止失血和感染，闭合伤口表面（该过程称为再上皮化），并使皮肤恢复至未受伤状态5。慢性伤口具有多种病因，并对愈合过程造成广泛干扰6，这进一步增加了治疗靶点识别的复杂性。尽管如此，已有大量模型被开发出来，用于阐明伤口病理的分子与细胞驱动机制，并测试新的治疗方法7。
最常用的伤口修复模型是在小鼠中进行的急性创伤模型。小鼠在机制研究中具有高度可操作性，并且提供了经过验证的衰老和糖尿病模型8。尽管小鼠与人类在伤口愈合过程中表现出总体相似性，但两者在皮肤结构和愈合动态方面仍存在物种间差异。这意味着大多数小鼠伤口研究难以直接转化为临床应用9。因此，人们正致力于发展具有高适用性和可转化性的人体体外和离体系统10,11。
本文提供了在离体人皮肤上进行部分厚度切除伤口的详细实验方案。我们 还 介绍了整体封片染色方法，作为一种高度可重复的评估离体人皮肤愈合过程的技术。我们展示了表皮修复（再上皮化）的过程及随后屏障形成的轨迹，比较了健康人皮肤与糖尿病患者皮肤的伤口闭合速率。最后，我们演示了如何针对多种抗体调整整体封片染色法，以评估愈合反应的不同方面。
方案
人皮肤组织取自英国赫尔市卡斯尔希尔医院和赫尔皇家医院接受重建手术的患者，获取过程均在患者充分知情并签署书面同意书、遵循机构指南并获得伦理批准（LRECs：17/SC/0220 和 19/NE/0150）的条件下进行。非糖尿病皮肤样本取自接受常规手术的患者（平均年龄 = 68 岁）。糖尿病皮肤样本则选自确诊为2型糖尿病且有溃疡病史的供体（平均年龄 = 81 岁）。手术获取的样本置于保存培养基中运输，并在抵达实验室后立即处理。所有使用未固定人组织的实验操作均在二级生物安全水平（BSL-2）条件下，于II级层流生物安全柜中进行。
1. 皮肤培养基和染色试剂的制备
注意：所有试剂和耗材的详细信息均在材料表中提供。确保用于人组织处理和培养的所有试剂和设备均为无菌状态。使用前对器械进行灭菌，并在接触组织后立即用消毒剂去污。废弃物须经1%消毒剂去污后方可丢弃。
- 维持培养基：在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 2 mM L-谷氨酰胺和 4%（v/v）抗生素-抗真菌素溶液。
- 含抗生素的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）：向 HBSS 中加入 4%（v/v）抗生素-抗真菌素溶液。4 °C 保存，直至使用。
- Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）：每升去离子水（dH2O）中溶解 9.6 g DPBS 粉末，高压灭菌后 4 °C 保存，直至使用。
- 人皮肤细胞生长培养基：在高糖 DMEM 中添加 2 mM L-谷氨酰胺、1%（v/v）抗生素-抗真菌素溶液和 10%（v/v）胎牛血清。4 °C 保存，直至使用。
- 皮肤固定液：向 450 mL 去离子水（dH2O）中加入 40 mL 甲醛溶液、10 mL 冰醋酸、4.5 g 氯化钠和 0.25 g 烷基三甲基溴化铵。室温（RT）保存，并在数日内使用。
注意：固定液具有危险性（刺激性且易燃）。操作时需谨慎，并通过适当途径处理。 - 磷酸盐缓冲液（PBS）：通过向 100 mL 磷酸盐缓冲液和 900 mL 去离子水（dH2O）中加入 6 g 氯化钠，制备用于整体染色的 PBS。
- 染色洗涤缓冲液：将 0.5%（v/v）Triton X-100 溶解于 PBS 中。
- 封闭缓冲液：向染色洗涤缓冲液中加入 0.2%（w/v）叠氮化钠和 2%（v/v）动物血清。4 °C 保存，最多可保存两周。
注意：使用与二抗宿主物种相同的血清进行封闭。叠氮化钠可防止孵育过程中细菌生长。 - DAPI 工作液：在二甲基亚砜中配制 5 mg/mL 的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储存液。将储存液用染色洗涤缓冲液按 1:1,000 稀释，得到 5 µg/mL 的 DAPI 工作液。
- 过氧化物酶封闭液：向染色洗涤缓冲液中加入 0.3%（v/v）过氧化氢。4 °C 保存，直至使用。避光保存以防止分解。
- ABC-HRP 试剂盒：
- HRP 标记的二抗：5 mL 染色缓冲液中加入 1 滴生物素化兔抗山羊 IgG。4 °C 保存，最多可保存两周。
注意：所用试剂盒/二抗取决于一抗的宿主物种。 - 亲和素-生物素复合物（ABC）试剂：5 mL 染色洗涤缓冲液中加入 2 滴试剂 A 和 2 滴试剂 B。ABC 试剂应在使用前至少 30 分钟配制。4 °C 保存，最多可保存两周。
- HRP 标记的二抗：5 mL 染色缓冲液中加入 1 滴生物素化兔抗山羊 IgG。4 °C 保存，最多可保存两周。
- 过氧化物酶底物：5 mL 去离子水（dH2O）中加入 3 滴试剂 1、2 滴试剂 2、2 滴试剂 3 和 2 滴过氧化氢。过氧化物酶底物需在使用前立即新鲜配制，不可保存。
2. 伤口处理前的皮肤准备
注意：这些步骤应在II级层流生物安全柜中进行。
- 用保存液收集皮肤组织，并运送至生物安全二级（BSL-2）操作台。
- 将皮肤真皮面朝下置于90 mm无菌培养皿中，使用无菌剪刀去除脂肪组织。
- 将皮肤放入含有25 mL含抗生素的HBSS溶液的50 mL离心管中，室温孵育10分钟。期间间歇性振荡，以去除残留血液和脂肪组织。
- 使用新的50 mL离心管重复步骤2.3。
- 将皮肤放入新的50 mL离心管中，加入25 mL不含抗生素的HBSS溶液，室温孵育10分钟。操作方式同步骤2.3，进行振荡。
- 将皮肤转移至另一新离心管中，加入25 mL DPBS溶液进行最终漂洗。此时皮肤已准备就绪，可用于造伤实验。
3. 创建人皮肤离体伤口
注意：这些步骤应在 II 级层流生物安全柜中进行。
- 在造伤前准备好皮肤培养皿。在60 mm的培养皿中，叠放两层无菌吸水垫，并通过培养皿侧边加入4 mL人皮肤培养基。将无菌尼龙滤膜放置在吸水垫堆上。
注意：皮肤培养基可根据所需的处理条件进行调整。每个吸水垫堆上最多可培养三个伤口外植体。 - 将皮肤的真皮面朝下置于90 mm培养皿中的无菌纱布上，以去除残留的DPBS。
注意：此步骤可防止皮肤在造伤过程中滑动。 - 将皮肤真皮面朝下放置在洁净的90 mm培养皿盖上，并用新的无菌纱布轻拍表皮使其干燥。
注意：在培养皿盖上进行造伤比在培养皿底部更方便。后续操作应迅速完成，以避免皮肤干燥。 - 拉紧皮肤，将2 mm活检打孔器压在皮肤表面并轻轻旋转。不要完全穿透皮肤。
注意：部分厚度伤口的设计目的是穿透表皮并部分进入真皮层。不同供体之间或不同取材部位之间，产生部分厚度伤口所需的力量可能存在差异。 - 使用带齿弯头组织镊夹住2 mm伤口的两侧，并将弯头虹膜剪插入2 mm伤口下方，均匀地将其剪下。
- 使用6 mm活检打孔器围绕中央2 mm伤口进行环形取材，制备出中央带有部分厚度2 mm伤口的6 mm外植体。
注意：可使用6 mm活检打孔器在皮肤表面划痕，标记每个2 mm伤口的位置，但注意不要完全穿透组织。以蜂窝状排列方式制备伤口外植体，以减少组织浪费。 - 将伤口外植体表皮面朝上放置于尼龙滤膜堆（步骤3.1中已准备）上。
注意：处理伤口外植体时，需小心避免损伤中央伤口。使用小型镊子，并从外植体相对两侧夹取。 - 将伤口置于32–37 °C、5% CO2及湿度为90–95%的湿润环境中培养1–7天。每2–3天更换一次培养基。
4. 离体伤口的全组织染色
注意：本节介绍免疫荧光和免疫过氧化物酶染色方法。使用前请充分混匀所有试剂。
- 荧光染色法
- 将伤口外植体收集到含有 500 µL 皮肤固定液的 1.5 mL 微量离心管中，于 4 °C 下孵育过夜。
NOTE: 本方案中使用的固定液适用于所述抗体。若使用其他抗体，则需进行优化。组织固定时间超过 24 小时可能导致过度固定。 - 次日，移除固定液，并替换为 1 mL 染色洗涤缓冲液。活检样本可在染色洗涤缓冲液中于 4 °C 下保存至染色前两周内。
NOTE: 所有洗涤缓冲液步骤中，请使用移液管或移液枪头，注意不要损伤伤口。 - 吸除染色洗涤缓冲液，并用 1 mL 染色洗涤缓冲液再冲洗一次。
- 计算步骤 4.1.5–4.1.6 所需封闭缓冲液的体积（样本数 × 300 µL = 所需封闭缓冲液的 µL 数）。如需要，可额外配制缓冲液。
- 向每个样本中加入 150 µL 封闭缓冲液，于室温孵育 1 小时。在所有染色步骤中，确保每个样本被充分覆盖，且活检伤口表面无气泡。
NOTE: 从本步骤开始，可在 1.5 mL 微量离心管或 48 孔板中进行。若使用 48 孔板，请将伤口朝下孵育于各孔中。 - 用剩余的封闭缓冲液稀释一抗。
NOTE: 将抗小鼠角蛋白 14（K14）以 1:1,000 比例稀释于封闭缓冲液中效果良好。若使用其他抗体或多探针，请优化本步骤。 - 吸除封闭缓冲液，向每孔/微量离心管中加入 150 µL 一抗。将伤口外植体于 4 °C 下孵育过夜。
- 次日，吸除一抗，并用含 0.2% 叠氮化钠的染色洗涤缓冲液于室温下冲洗 1 小时（每样本 500 µL）。
- 使用染色洗涤缓冲液再进行三次冲洗（每次 30 分钟，每样本 500 µL）。
- 将荧光标记的二抗稀释于染色洗涤缓冲液中（例如，羊抗小鼠 488 以 1:400 比例稀释）。
- 计算所需二抗的体积（样本数 × 150 µL = 所需体积 µL 数）。
- 向每孔/微量离心管中加入 150 µL 二抗。于室温孵育 1 小时。步骤 4.1.10–4.1.16 的孵育需在避光条件下进行，因二抗对光敏感。
NOTE: 如需要，本步骤也可于 4 °C 下过夜孵育。需优化二抗浓度，以获得充分信号并减少背景染色。 - 移除二抗，并用染色洗涤缓冲液进行三次 30 分钟冲洗（每样本 500 µL）。
- 弃去剩余洗涤缓冲液，计算所需 DAPI 工作液的体积（参照步骤 4.1.11）。
- 用 150 µL DAPI 工作液对每个外植体复染 10 分钟，于室温进行。
NOTE: DAPI 可将细胞核染成蓝色。Hoechst 染料可作为 DAPI 的替代品。 - 最后用染色洗涤缓冲液进行两次 30 分钟冲洗（每样本 500 µL）。活检样本可在 4 °C 避光条件下保存于染色洗涤缓冲液中至成像前两周内。
- 将伤口外植体收集到含有 500 µL 皮肤固定液的 1.5 mL 微量离心管中，于 4 °C 下孵育过夜。
- 明场染色法。
- 执行步骤 4.1.1–4.1.3。
- 于 4 °C 下用过氧化物酶阻断剂过夜孵育，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
NOTE: 当使用 HRP 标记抗体时，此步骤至关重要，可减少组织中的非特异性背景染色。血管化程度高的组织含有更多的内源性过氧化物酶活性。 - 弃去过氧化物酶阻断剂，并用染色洗涤缓冲液冲洗两次，每次 30 分钟。
- 执行步骤 4.1.4–4.1.8。
NOTE: 步骤 4.1.7 之后的洗涤尤为重要，需彻底去除样本中的叠氮化钠。若叠氮化钠未充分去除，将使 HRP 失活并干扰染色检测。 - 向每孔/微量离心管中加入 150 µL HRP 标记的二抗，于 4 °C 下过夜孵育或于室温孵育 1 小时。
- 移除二抗，并用染色洗涤缓冲液进行三次 30 分钟冲洗。
- 向每孔/微量离心管中加入 150 µL ABC 试剂，于 4 °C 下过夜孵育或于室温孵育 1 小时。
- 吸除 ABC 试剂，并用染色洗涤缓冲液进行三次 30 分钟冲洗。
- 向一个外植体中加入 150 µL 过氧化物酶底物，确定出现明显颜色变化所需的时间。
NOTE: 选择预期染色较强的样本。在此情况下，可见显示迁移表皮（K14）的红色环状结构。3,3'-二氨基联苯胺-4 或其他合适的显色底物可替代该过氧化物酶底物。 - 一旦观察到颜色变化，立即移除过氧化物酶底物，并替换为 1 mL dH2O。
- 对其他外植体重复过氧化物酶底物检测，孵育时间参照步骤 4.2.11 所确定的时间。
- 用 1 mL dH2O 冲洗所有外植体，以去除残留的过氧化物酶底物。尽管外植体可在 4 °C 下保存至成像前一周内，但建议尽快成像，以防止过氧化物酶底物随时间逐渐渗入 dH2O 中。
5. 成像与定量
- 荧光成像
注意：荧光成像使用共聚焦激光扫描显微镜进行。然而，倒置荧光显微镜可能足以获取二维图像以量化伤口闭合速率。选择二抗时，需确保所选荧光染料与可用显微镜设备的激发和发射光谱兼容。- 使用配备2.5倍、10倍和20倍物镜、x-y-z电动载物台、数字相机及图像采集软件的共聚焦激光扫描显微镜。打开透射光探测器（TPMT），以便清晰观察每个活检样本，并可测量总伤口闭合情况。或者，在荧光成像后通过明场显微镜测量每个伤口。
- 将60 mm培养皿底置于成像平台上，并加入一层薄薄的DPBS（约1 mL）。
注意：若DPBS过多，活检样本在成像过程中会移动。若有板架，也可使用48孔板。 - 使用小型组织镊子将伤口外植体从孔板或微量离心管转移至含DPBS的培养皿中。将活检样本伤口面朝下放置于培养皿中。
- 使用目镜和荧光灯定位并聚焦伤口。若视野中样本下方有气泡，用组织镊子夹起伤口并重新定位。
- 设置成像软件，确保各通道的针孔大小一致以获得最佳共焦效果。为此，检查每个通道的一个艾里单位值，并选择最大值。选择扫描速度、图像质量和平均次数。
注意：所用偶联二抗的荧光染料及所选复染剂（如DAPI）将决定所需的成像通道。 - 启动实时采集软件，调节各通道的激光功率和增益至可清晰显示染色的水平。通过提高数字偏移量来降低背景噪声。
- 将伤口置于成像平面中心。
注意：若因使用较低倍物镜或创建较大伤口导致伤口未填满整个图像，可拍摄多幅图像并拼接（手动或使用相应成像软件的拼图功能）。 - 采集伤口活检样本的图像。不同外植体之间应使用相同的成像参数。
注意：更高倍数的图像可评估组织结构以及细胞标志物的表达与定位。 - 对伤口进行连续Z轴扫描，特别是在组织未完全贴附于培养皿底部时。使用分析软件将Z轴序列合并为单个最大强度投影图像。
- 明场成像
注意：免疫过氧化物酶染色活检样本的明场成像可通过多种方式进行。- 倒置显微镜成像：按照步骤5.1.2–5.1.3所述，将伤口外植体置于培养皿或孔板中以准备成像。在配备数字相机的倒置显微镜下，通过明场照明采集数字图像。如需，可拼接多幅图像。
- 无线数字显微镜成像：使用连接至手机或笔记本电脑的无线数字显微镜，以低成本获取高质量图像。将外植体伤口面朝上放置于纸巾上，并去除样本储存液中残留的dH2O（或染色洗涤缓冲液）。将伤口外植体置于显微镜视野中心。使用连接的相机采集图像。
- 定量分析
注意：可使用任何支持自由绘制和测量不规则形状的软件量化伤口闭合百分比。可使用ImageJ按以下步骤进行定量：- 在ImageJ软件中打开待分析的图像。
- 使用自由绘制工具沿再上皮化伤口外缘（即与正常皮肤交界处）描边。按下M键（或选择分析 | 测量）获取“外侧”面积测量值。
注意：再上皮化伤口组织的纹理与正常皮肤不同。此类分析前无需对图像进行比例标定。 - 使用自由绘制工具沿开放伤口区域（即开放伤口与再上皮化组织内缘交界处）描边。按下M键（或选择分析 | 测量）获取“内侧”面积测量值。
- 使用以下公式计算伤口再上皮化/闭合百分比：
% 闭合 = (外侧伤口面积 - 内侧伤口面积) / (外侧伤口面积) × 100
注意：抗体的面积覆盖百分比也可用相同方法计算（如K14），或表示为占总伤口面积的百分比。信号强度百分比亦可提供关于目标标志物组织表达水平的半定量信息，而高倍成像则可呈现细胞水平的表达数据。
结果
本报告中，我们介绍了一种新型的离体皮肤损伤及整体装片染色方法，用于评估影响人类皮肤修复反应的因素。图1A展示了该实验流程的示意图，整个过程可在3至10天内完成，具体时间取决于伤口培养的持续时间。部分厚度伤口在膜堆的气-膜界面处进行培养，随后可用于整体装片染色，或包埋于石蜡或OCT包埋剂中用于常规组织学分析，亦可置于液氮中冷冻以进行生物化学分析（图1B）。我们通常在6 mm的组织块中央制备直径为2 mm的部分厚度伤口，但伤口及其周围组织块的尺寸可根据实际需求进行调整。该整体装片染色方法已成功适用于免疫过氧化物酶染色和免疫荧光染色两种技术（图1C）。
免疫荧光技术可用于多种抗体对组织的检测。为此，我们建议使用来自不同物种的初级抗体，并使用相应物种匹配的荧光标记的二抗，以减少交叉反应性。抗体浓度和孵育时间需要优化。如果出现背景染色，可降低抗体浓度、增加洗涤步骤，并在二抗孵育时加入封闭缓冲液。组织的新鲜活性可通过商业化的活性染料直接评估（见材料表）。我们还表明，在实际条件允许的情况下，可在活性染色后对组织进行固定，并成功成像（图1D）。
图1人类离体伤口模型与整体染色方法 (A) 从皮肤采集到执行的实验流程示意图 离体 损伤，到组织染色及数据分析。B) 示意图展示人类 离体 皮肤伤口组织培养系统，常规对组织进行分析。C整体染色可采用免疫过氧化物酶和免疫荧光技术进行。K14 = 角蛋白14。D活体组织可用商业化的活性染料染色，并在固定后成功成像。比例尺 = 100 µm该染色在非糖尿病皮肤中进行。 请点击此处以查看此图的放大版本。
伤口全组织染色最广泛的应用是通过比组织学切片更可重复的方式确定伤口闭合速率。闭合百分比被量化为伤口表面再上皮化的百分比，如图2A所示。特定标记物的面积覆盖率可从伤口总面积中测量，也可表示为再上皮化区域占伤口面积的百分比。我们对健康（非糖尿病）皮肤与糖尿病皮肤在7天时间过程中的愈合情况进行了表征，于损伤后每一天采集伤口样本（代表性图像见图2B）。健康皮肤伤口随时间逐渐闭合，符合预期，大多数样本在第4至5天时已完全闭合。相反，糖尿病皮肤伤口在为期7天的观察期内未能完全闭合（图2C）。在损伤后各时间点比较健康与糖尿病皮肤伤口的愈合速率时，两者之间的伤口闭合延迟具有显著性差异（第6天前 P < 0.001，第6天 P < 0.05，第7天 P < 0.05 至 P < 0.001）。
在评估整体伤口闭合率后，我们测量了整个伤口区域（图2A中的外侧区域）中可观察到K14阳性细胞的百分比（图2B中的绿色染色）。有趣的是，我们发现，在健康的离体皮肤伤口中，K14染色在第2天达到峰值，随后迅速下降（各时间点与第2天峰值相比具有显著性差异，图2D）。这可能反映了早期表皮屏障的重新形成，阻止了K14抗体穿透分化后的表皮层（见图2E示意图）。在再上皮化过程中，基底层（K14+）角质形成细胞向开放伤口内部迁移，使得靠近伤口外缘的表皮比靠近内缘（迁移前沿）的表皮更早形成。当新形成的表皮前沿持续迁移以闭合剩余的开放伤口时，外侧边缘的表皮则开始分化，重建其他表皮层。因此，在早期愈合阶段，我们预期再上皮化区域的大部分由基底（K14+）细胞构成；而在后期修复阶段，随着表皮从外向内分化，K14染色逐渐消失（见图2E整体染色图像）。因此，图2D中K14染色的减少（向下的箭头）与表皮分化程度的增加相关。有趣的是，可见的K14染色在健康伤口中较早达到峰值（第2天），而在糖尿病伤口中则延迟至第4天，进一步表明糖尿病皮肤伤口中的再上皮化及后续的表皮分化过程均出现延迟。
图2：整体染色显示糖尿病皮肤与健康皮肤的伤口愈合速率存在差异。（A）用于量化伤口闭合率的方法，基于伤口内外边缘的测量值。明场图像显示角蛋白14（K14）染色为红色。比例尺 = 300 µm。（B）健康皮肤与糖尿病皮肤在不同时间点（受伤后天数）的代表性愈合图像。比例尺 = 500 µm。K14 = 绿色。DAPI = 蓝色细胞核。（C）伤口闭合速率（再上皮化百分比）的定量分析显示，来自健康皮肤的离体伤口闭合速度显著快于来自糖尿病皮肤的离体伤口。H = 健康。Db = 糖尿病。（D）K14染色百分比在健康皮肤中比糖尿病皮肤更早达到峰值，随后随着表皮分化程度增加而下降（下箭头所示）。（E）随着表皮分化，K14（基底层表皮细胞）染色逐渐消失。D = 已分化。ND = 未分化。白色虚线表示伤口内侧和外侧边缘。白色箭头 = 迁移方向。n = 每个供体每个时间点6个伤口。均值 ± 标准误。* = P < 0.05，** = P < 0.01，*** = P < 0.001。在C中每个愈合时间点对健康与糖尿病样本进行比较（最不显著比较的P值）。在D中，K14染色随时间变化相对于每位供体的峰值进行比较。请点击此处查看该图的放大版本。
接下来，我们采用整体染色法探究其他与伤口相关的标志物在非糖尿病皮肤中的组织表达与定位（图 3）。所有使用的抗体及其工作浓度均列于材料表中。在开放性伤口中，血管对α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）抗体呈阳性染色，该抗体与K14联合使用，以在低倍图像中界定表皮边缘（图 3A）。真皮基质使用I型胶原（COL 1）和纤连蛋白（Fn）抗体进行染色。其中，胶原表现为丰富而粗大的纤维，而纤连蛋白纤维则稀疏、呈波浪状且较细（图 3A）。我们的整体染色方法还可实现细胞水平的染色分辨率，如K14阳性角质形成细胞所示（图 3B）。
最后，我们发现人皮肤离体伤口中存在常驻免疫细胞，在损伤后第3天，朗格汉斯细胞出现在新生表皮周围（图3C）。事实上，这些结果表明，整体染色法可用于研究伤口愈合反应的关键特征，包括炎症、增殖以及细胞外基质（图4A）。综上所述，我们的数据表明，离体皮肤损伤结合整体染色技术是一种有效的研究健康人皮肤及糖尿病（病理性）人皮肤修复多种特征的方法。
图3：优化整体染色法以适用于其他抗体。 （A）血管使用α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，绿色）和角蛋白14（K14，红色）染色，而基质纤维则使用I型胶原（COL 1，红色）和纤连蛋白（Fn，绿色）染色。（B）整体染色法可实现单细胞水平的定位分辨率（K14，绿色；K1，红色）。（C）在新生表皮中观察到CD1a阳性朗格汉斯细胞（绿色）。DAPI = 蓝色细胞核。标尺 = 100 µm。白色虚线表示伤口内缘和外缘，并区分伤口与表皮。本染色在非糖尿病皮肤中进行。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：整体染色法评估伤口愈合的有效性。（A）示意图展示整体染色技术如何评估与伤口相关的生物学过程。所用抗体 = 红色文字。K14 = 角蛋白14。COL 1 = 胶原蛋白1。Fn = 纤维连接蛋白。（B）与标准组织学分析（红色箭头）相比，整体染色程序（蓝色箭头）在伤口闭合测量中引入的变异性更小。S1 = 切片1。WE = 伤口边缘。标尺 = 300 µm。本染色在非糖尿病皮肤中进行。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在本实验方案中，我们描述了一种利用整体组织染色法评估人离体皮肤伤口闭合的优化方法。该方法为关键性评价潜在伤口治疗手段以及更深入理解人类伤口修复反应提供了重要资源。我们此前已发表过关于人离体皮肤伤口愈合评估的研究12,13，但在这些研究中并未采用整体染色法来测量伤口闭合情况。相比需要石蜡或OCT包埋及切片的标准组织学方法，整体染色操作更为简便，且对技术经验要求较低。此外，整体染色法可减少实验变异性，实现对整个伤口的定量分析，而非仅限于组织内特定位置的单个横截面（参见图4B的对比示意图）。我们完全支持对整个非对称性伤口结构进行定量分析的重要性，这一点在Rhea和Dunnwald针对小鼠急性伤口的研究中已有明确阐述14。这些作者证明了对体内切除性伤口进行连续切片对于可重复且精确测量伤口形态的重要性。连续切片同样可应用于人离体伤口，但若要准确量化伤口闭合和再上皮化过程，高通量的整体染色法应为首选方法。我们指出，本整体染色方案亦可与后续处理（石蜡或OCT包埋）兼容，适用于传统的组织学分析。
整体染色法并非没有缺点。尽管它在伤口愈合实验中具有更高的可重复性，但与标准组织学技术相比，其分析过程需要使用更多的组织。当组织获取受限时，这可能成为一个问题，尤其是在需要检测多种抗体的情况下。另一种替代方法是采用切开式损伤模型，其伤口宽度相对均匀，变异性较小（如在小鼠和人类伤口中所示15,16）。然而，切除性伤口仍更适用于大多数病理性的伤口类型17。
在本研究中，于6 mm皮肤外植体的中心创建了2 mm深的部分厚度伤口。该方法可根据不同皮肤深度的切除性伤口和外植体尺寸进行优化18。此外，产生伤口所需的力度在不同供体之间会有所差异，老化皮肤进行活检时所需力度较小。我们还应避免使用具有明显妊娠纹或其他结构改变的皮肤。我们已验证了一系列抗体，可用于考察离体愈合反应的不同方面。本方案也可与其他皮肤相关抗体联合使用，但需优化抗体浓度和孵育时间。尽管如此，我们认为本方案最适合于对伤口完全闭合进行绝对定量，随后对特定目标蛋白进行空间定位分析。虽然整体染色在免疫定位分辨率上低于对组织切片进行的标准组织学分析，但它提供了标准二维组织学所缺乏的额外三维信息。
体外皮肤模型在评估愈合过程时存在一个局限性，即缺乏全身性反应。伤口修复的一个重要方面是炎症反应及随后的组织肉芽形成，这由来自血管系统的炎性细胞和内皮细胞的浸润所引发。19尽管存在这一局限性，离体皮肤仍比基于细胞的伤口检测更能真实地模拟临床愈合过程。一般的体外实验通常采用单细胞类型的单层培养或在组织培养塑料表面生长的共培养体系，而离体皮肤则提供了探索细胞行为的天然微环境。近年来，已出现多种皮肤替代模型系统，这些系统通过在实验室环境中利用人工基质和分离的皮肤细胞来构建皮肤组织。20,21尽管这些模型比大多数体外方法更能模拟人类皮肤，但仍无法完全再现天然组织环境，且通常过于脆弱，难以进行可重复的损伤处理。此外，我们（及其他研究者）已证实，离体的人类皮肤组织可保留常驻免疫细胞，这些细胞无疑将参与修复过程22,23未来的研究应着重于延长细胞的存活时间和免疫功能 离体 晚期愈合评估模型24一种选择是进一步发展有前景的器官芯片技术，该技术能够延长组织存活性，并在培养中维持天然皮肤结构长达两周25体外模型也开始重视皮肤炎症反应的重要性，通过成功地将中性粒细胞等免疫细胞整合到宿主组织中实现这一点。26 或向宿主组织注射抗体以引发免疫反应27我们预计，这些发现将为未来开发更为精细且具有转化价值的方法铺平道路。
使用离体皮肤测量伤口闭合的一个主要优势在于能够比较健康组织（例如非糖尿病）与病理组织（例如糖尿病或衰老）中的愈合速率。本文表明，与健康离体 伤口相比，糖尿病伤口的再上皮化和屏障形成确实受到损害。这为病理性修复的临床前评估提供了一条途径，其中衰老和糖尿病是形成慢性伤口的主要风险因素1。尽管已存在体外病理模型，例如从衰老或糖尿病组织中分离的细胞，或在高糖培养基中培养以模拟高血糖状态的细胞28,29，但这些细胞一旦脱离体内微环境，其表型可能迅速丧失。外在病理愈合环境的一个重要组分是真皮基质，而该基质在衰老和糖尿病状态下均发生改变30。事实上，这种异常的基质会影响驻留成纤维细胞和 naïve 成纤维细胞的行为31,32。因此，将细胞置于其宿主组织环境中进行研究的重要性不容低估。
总之，我们的实验方案为量化人类伤口再上皮化、探索调控因子以及验证潜在治疗手段的有效性和可行性提供了一个重要平台12,13。尽管临床前测试仍需依赖体内研究方法，但结合使用离体人类组织与体内小鼠伤口模型的综合策略，将有助于优化临床前研究路径，在减少动物使用的同时提高跨物种的可转化性。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Paolo Matteuci 先生和 George Smith 先生提供患者组织样本。同时感谢 Amber Rose Stafford 女士协助组织样本采集，以及 Daisy Appeal 提供实验室设施。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL Falcon 管 | Falcon | 352070 | 用于皮肤清洗 |
| 1.5 ml TubeOne 微量离心管，无色（无菌） | Starlab | S1615-5510 | 用于整体染色 |
| 48 孔 CytoOne 培养板，经组织培养处理 | Starlab | CC7682-7548 | 用于整体染色 |
| 冰醋酸 | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | 固定液组分之一 |
| 烷基三甲基溴化铵 | Sigma-Aldrich | M7635 | 固定液组分之一 |
| 抗 α-平滑肌肌动蛋白抗体 [1A4] | Abcam | ab7817 | 标记血管 |
| 抗胶原蛋白 I 抗体 | Abcam | ab34710 | 标记胶原蛋白 |
| 抗细胞角蛋白 14 抗体 [LL002] | Abcam | ab7800 | 标记表皮 |
| CD1A 抗体 (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | 标记朗格汉斯细胞 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 细胞核复染剂 |
| Falcon 60 mm 培养皿 | Falcon | 353004 | 用于人源离体培养 |
| 纤维连接蛋白抗体 (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | 标记纤维连接蛋白 |
| 甲醛，超纯，37–41% 溶液，SLR 级 | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | 固定液组分之一 |
| 纱布敷料 | Medisave | CS1650 | 用于清洁皮肤 |
| Gibco™ 抗生素-抗真菌溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 用于人源离体培养 |
| Gibco DMEM，高糖，无谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | 用于人源离体培养 |
| Gibco 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | 用于人源离体培养 |
| Gibco HBSS，无钙、无镁 | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | 用于人源离体培养 |
| Gibco L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 用于人源离体培养 |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | 用于免疫过氧化物酶染色 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | N/A | 用于图像分析 |
| Invitrogen IgG (H+L) 交叉吸附山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | 二抗的选择取决于所需荧光染料及一抗 |
| Invitrogen IgG (H+L) 交叉吸附山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594 标记 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | 二抗的选择取决于所需荧光染料及一抗 |
| Invitrogen 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒，适用于哺乳动物细胞 | Thermo Fisher Scientific | L3224 | 用于组织活力评估 |
| 虹膜镊，10 cm，弯曲，1×2 齿 | World Precision Instruments | 15917 | 用于制造伤口 |
| 虹膜剪，11 cm，弯曲，超锐，碳化钨 | World Precision Instruments | 501264 | 用于制造伤口 |
| 虹膜剪，11 cm，直型，超锐，碳化钨 | World Precision Instruments | 501263 | 用于去除脂肪组织 |
| 角蛋白 1 多克隆抗体，纯化 | Biolegend | 905201 | 标记表皮 |
| 角蛋白 14 多克隆抗体，纯化 | Biolegend | 905301 | 标记表皮 |
| LSM 710 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | 已停产 | 用于荧光成像 |
| Merck Millipore 吸水垫 | Merck Millipore | AP10045S0 | 用于人源离体培养 |
| Merck Millipore 尼龙亲水膜滤器 | Merck Millipore | HNWP04700 | 用于人源离体培养 |
| 正常山羊血清溶液 | Vector Laboratories | S-1000-20 | 动物血清的选择取决于二抗 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3619 | 用于洗涤缓冲液 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | 用于封闭缓冲液 |
| 氯化钠 | Fisher Bioreagents | BP358-212 | 固定液组分之一 |
| 灭菌袋 | Medisave | SH3710 | 用于器械灭菌 |
| Stiefel 2 mm 活检打孔器 | Medisave | BI0500 | 用于制造部分厚度伤口 |
| Stiefel 6 mm 活检打孔器 | Medisave | BI2000 | 用于制备外植体 |
| Thermo Scientific Sterilin 标准 90 mm 培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | 用于皮肤样本制备 |
| 曲拉通 X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | 用于洗涤缓冲液 |
| VECTASTAIN Elite ABC-HRP 试剂盒，过氧化物酶（兔 IgG） | Vector Laboratories | PK-6101 | 用于免疫过氧化物酶染色；HRP 试剂盒的选择取决于一抗 |
| Vector NovaRED 底物试剂盒，过氧化物酶（HRP） | Vector Laboratories | SK-4800 | 用于免疫过氧化物酶染色 |
| 无线数字显微镜 | Jiusion | N/A | 用于明场成像 |
参考文献
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