方法文章

通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

DOI：

10.3791/62328

⸱

2021年11月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

本文内容

摘要

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本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫系统的功能基因组学研究需要进行基因操作，包括删除靶基因以及向目标蛋白添加元件。在细胞系模型中鉴定基因功能对于基因发现和细胞内在机制的探索具有重要意义。然而，利用CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术对T细胞和巨噬细胞系等免疫细胞进行遗传操作较为困难，主要原因是这些细胞的转染效率较低，尤其是在静息状态下。为了对免疫细胞进行基因修饰，通常需要使用药物抗性筛选和病毒载体来富集表达CRISPR/Cas9系统的细胞，但这不可避免地会对细胞造成非预期的干扰。在之前的研究中，我们设计了与CRISPR/Cas9偶联的双荧光报告系统，该系统在电穿孔后瞬时表达，这一技术方案可实现免疫细胞中基因的快速删除；然而，在T细胞和巨噬细胞等免疫细胞中实现无需药物抗性筛选或病毒载体的基因敲入则更具挑战性。本文中，我们证明，通过流式细胞分选辅助筛选瞬时表达靶向Rosa26位点的CRISPR/Cas9载体并同时导入供体质粒的细胞，可在T细胞和巨噬细胞中实现无需药物抗性富集的基因敲入。作为示例，我们展示了如何通过基因敲入实验在RAW264.7巨噬细胞中表达SARS-CoV-2（导致当前新冠大流行的病毒）的受体人源ACE2。此类基因敲入细胞可广泛应用于机制研究。

引言

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免疫细胞在抵御病原体方面至关重要。先天免疫和适应性免疫均参与清除感染物并维持组织稳态1,2细胞系模型是理解哺乳动物免疫系统分子基础的重要工具，被广泛应用于 体外 功能分析，例如模拟人类T细胞活化的实验，以及确定遗传因子在激活或抑制免疫反应中的功能3,4值得注意的是，哺乳动物的免疫系统具有极大的异质性，同样重要的是，大量分子调控着特定细胞类型的分化、迁移和功能5,6.

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9基因组编辑工具可实现对特定细胞类型的遗传操作，从而以精确的方式对基因进行功能注释7,8。已有多种已发表的实验方案描述了以Cas9-向导RNA复合物（即核糖核蛋白，RNP）形式将CRISPR/Cas9递送至HEK293细胞、Jurkat细胞系、原代T细胞9,10、巨噬细胞11,12,13、干细胞14以及其他细胞类型15,16。在这些方案中，基因标记通常通过将荧光标签与内源性蛋白融合来实现17,18。然而，目前较少尝试使用适用于单细胞分选的双荧光报告系统来促进基因敲入实验19,20，尤其是在免疫细胞中。

为了深入理解一种新型遗传因子在免疫细胞中的功能，通常需要进行细胞类型特异性的基因敲除、遗传拯救实验，并理想地鉴定其相互作用分子。尽管已有文献报道了优化免疫细胞中基因敲除的方法9,15,21，但关于如何在免疫细胞中引入具有多种功能的基因敲入等位基因以研究免疫应答的方法仍鲜有报道。因此，本实验方案旨在详细描述一种高效且高度可重复的技术流程，用于在人和小鼠免疫细胞系中于安全港位点Rosa26表达目的蛋白（POI）。我们设计了一种双色报告系统，通过表达CRISPR/Cas9的质粒（DsRed2）和重组DNA模板（EBFP2）来富集转染细胞，并可通过细胞分选进行分离。按照本方案操作，我们成功获得了多个基因敲入细胞系，包括人T细胞系Jurkat和小鼠巨噬细胞系RAW264.7，可用于功能尚未充分研究的蛋白质的深入分析。

作为示例，本方案展示了如何获得稳定表达人源ACE2（SARS-Cov-2的受体）的敲入型RAW264.7巨噬细胞22。由于先天免疫细胞参与了新型冠状病毒病（Covid-19）的发病机制23,24，而人源ACE2被认为是病毒进入细胞并在细胞内复制所需的主要受体，因此携带人源ACE2基因敲入的巨噬细胞可作为研究病毒在巨噬细胞内增殖机制的有用工具。同时，我们还展示了在人源ROSA26基因座敲入基因以表达RASGRP1蛋白的示例，该蛋白在其氨基末端融合了亲和性Twin-Strep标签（OST）。T细胞是免疫治疗中的关键靶细胞，越来越多的研究聚焦于调控其对癌症的响应能力25,26。由于Rasgrp1已被证实是T细胞受体及其相互作用分子信号通路下游的关键信号分子，但其相互作用分子尚未被充分阐明27，因此OST-RASGRP1敲入模型为鉴定调控T细胞对肿瘤和感染反应的相互作用分子奠定了基础。综上所述，这些工具可用于新型冠状病毒病（Covid-19）相关研究以及发现与Rasgrp1相互作用的新分子。

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方案

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1. 靶向 Rosa26 位点的sgRNA设计与质粒构建

  1. 在目标插入位点周围设计引导RNA
    1. 确保小鼠的插入位点 Rosa26 （以下称为 mRosa26）基因敲入实验位于第一个内含子中 mRosa26；该位点已在先前的研究中使用过28,29对于人类细胞中的敲入实验，确保插入位点位于人类基因组中 ROSA26 位点（下文简称 hROSA26），已被确认为人源同源基因 mRosa2630.
    2. 使用从小鼠基因组信息学数据库（Mouse Genome Informatics，http://www.informatics.jax.org/）和 Ensembl 基因组浏览器（http://www.ensembl.org/index.html）分别获取的小鼠和人类物种的基因组序列。复制目标基因上游 50 个碱基对（bp）的基因组序列 mRosa26 或 hROSA26 位于目标插入位点两侧的位点。
    3. 使用在线网络工具 CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）设计向导 RNA31粘贴1.1.2中的100 bp输入序列。选择特异性评分高、效率评分高且脱靶活性低的两条向导RNA。此外，优先选择Doench评分较高的RNA向导，避免标注为“Inefficient”的序列。32.
      注意：其他CRISPR设计工具同样具有重要价值且可公开获取，例如Benchling CRISPR设计工具（https://benchling.com/crispr）。为提高CRISPR/Cas9介导的基因敲入突变细胞的频率，应尽可能选择两个靠近目标插入位点的向导RNA33.
    4. 对于 mRosa26 位点，使用两个相邻的引导RNA，分别命名为mR26-sg1（5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3'）和mR26-sg2（5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3'）（图1A）。对于 hROSA26 位点，使用两个相邻的引导RNA，即hR26-sg1（5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3'）和hR26-sg2（5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3'）（图1B).
      注意：mR26-sg1 和 mR26-sg2 的基因组编辑活性分别在 RAW264.7 细胞中进行评估，而 hR26-sg1 和 hR26-sg2 的活性则分别在 Jurkat 细胞中进行评估（参见 补充文件, 图 S1).
  2. 克隆含有靶向sgRNA的CRISPR表达载体 Rosa26 位点
    1. 合成一条向导RNA的正向与反向寡核苷酸（参见 补充文件).
      注意：建议在向导序列的起始位置添加一个“G”核苷酸，这有助于由U6启动子驱动的表达。例如，要克隆上述mR26-sg1，正向寡核苷酸序列为CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT，反向寡核苷酸为AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC正向引物中的额外 G 及其在反向引物中的互补碱基以粗体标出。
    2. 将对应于向导RNA的合成寡核苷酸克隆到我们先前工作中构建的多功能CRISPR表达载体pX458-DsRed2中21 (图1C) 使用张锋实验室开发的gRNA克隆通用方案（https://www.addgene.org/crispr/zhang/）；但跳过胶回收步骤，使用PCR纯化试剂盒纯化酶切后的载体（参见 材料表).
      ​注意：在以往的实验方案中，需对经 BbsI 消化后的载体进行凝胶纯化；然而，该步骤耗时较长。在本方案中，消化产物直接使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，并用于后续连接反应，通常可获得与传统方法相当的阳性克隆效率。
    3. 将10 µL连接产物（步骤1.2.2）转化至50 µL大肠杆菌 根据制造商说明，使用DH5α感受态细胞。从含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上随机挑取三个菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，过夜培养。
    4. 使用1 mL过夜培养的细菌菌液进行Sanger测序，其余菌液保存于4 °C，直至确认构建正确：pDsR-mR26-sg1和pDsR-mR26-sg2 mRosa26 基因座敲入，以及 pDsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2 用于 hROSA26 位点
    5. 使用质粒大量提取试剂盒制备高浓度质粒DNA（约2 µg/µL），用于转染级质粒的纯化（参见 材料表).

2. 作为同源重组模板的靶向载体的设计与构建

  1. 设计同源定向修复模板
    1. 设计一个靶向载体，利用先前研究中优化的表达盒组成型表达目的蛋白（POI）29，该表达盒包含CAG杂合启动子、一个可用于克隆POI cDNA的AscI限制性酶切位点、一个IRES-EBFP2报告基因，以及牛生长激素多聚腺苷酸化（bGH-polyA）信号（图1B 和 补充文件）。
    2. 设计与小鼠mRosa26或人hROSA26基因座基因组序列具有同源性的同源臂（HAs）。在表达盒左侧插入约1 kb的5'同源臂，对应于目标插入位点上游的基因组序列；同样，在表达盒右侧插入约1 kb的3'同源臂，对应于插入位点下游的基因组序列。
      注意：表达盒应尽可能靠近CRISPR/Cas9切割位点插入34。为避免CRISPR/Cas9对已靶向等位基因的重复切割，需在靶向载体的原间隔序列邻近基序（PAM）序列（5'-NGG-3'）中引入核苷酸突变34,35。
    3. 为实现靶向载体的线性化，在5'同源臂的上游紧邻处插入一个独特的EcoRI位点，在3'同源臂的下游紧邻处插入一个独特的BamHI位点。
    4. 委托商业公司合成靶向载体，并分别命名为用于mRosa26和hROSA26基因敲入的pKR26-iBFP和pKhR26-iBFP。
  2. 构建作为同源定向修复模板的靶向载体
    1. 为表达目的蛋白（POI），从Ensembl基因组浏览器获取cDNA序列（编码序列），并选择编码最长蛋白序列的转录本。例如，人ACE2基因的cDNA为ACE2-202 ENST00000427411.2，人RASGRP1基因的cDNA为RASGRP1 ENSG00000172575。
    2. 通过商业公司合成POI的cDNA，也可通过PCR扩增进行克隆（本文未描述）。在cDNA的ATG起始密码子前立即放置序列GGCGCGCCACC（5' - 3'），该序列包含一个AscI限制性酶切位点（斜体加粗）和Kozak共有序列翻译起始位点（下划线），并在cDNA的终止密码子后添加另一个AscI限制性酶切位点（5'- GGCGCGCC -3'）。
    3. 使用AscI对合成的序列进行酶切，并按照制造商说明，使用专为限制性酶切后DNA片段纯化设计的PCR纯化试剂盒进行纯化（见材料表）。
    4. 按照制造商说明，使用T4 DNA连接酶将纯化的cDNA插入片段连接至经AscI线性化的骨架载体pKR26-iBFP或pKhR26-iBFP中。
    5. 通过测序验证最终的靶向载体pKR26-POI-iBFP或pKhR26-POI-iBFP。按照制造商方案，使用质粒大提试剂盒（maxiprep）纯化验证后的构建体。
    6. 使用EcoRI或BamHI酶切靶向载体，并按照制造商说明使用PCR纯化试剂盒纯化酶切产物。将线性化的靶向载体（约0.8 µg/µL）保存于-20 °C，直至进行电穿孔。

3. 巨噬细胞和T细胞系的电穿孔

  1. 为电穿孔准备细胞培养
    1. 制备含10%胎牛血清（FBS）的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640培养基，作为Jurkat T细胞的完全生长培养基。制备含10% FBS的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），用于RAW264.7巨噬细胞的培养。除用于转染后分选前孵育的培养基外，所有完全生长培养基均需添加100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（Pen/Strep）。
    2. 根据供应商说明对RAW264.7和Jurkat T细胞进行传代培养（参见材料表）。传代RAW264.7细胞时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱落。使用含10%（v/v）DMSO的FBS作为RAW264.7和Jurkat细胞的冷冻保存培养基。
    3. 以250 × g离心5分钟收集RAW264.7巨噬细胞，或以90 × g离心8分钟收集Jurkat T细胞。随后用5–10 mL不含Ca2+或Mg2+离子的1× DPBS洗涤细胞。弃去DPBS。
    4. 用2 mL 1× DPBS重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液，与等体积0.2%台盼蓝混合，以估算细胞数量和存活率。
      注意：确保转染当天细胞培养的存活率>90%。
    5. 对于单次基因敲入实验，使用10 µL核转染尖端进行五次重复电穿孔。计算2.0 × 106个细胞所需的体积，并通过离心收集细胞。再次用1× DPBS洗涤细胞沉淀，操作同步骤3.1.3。
      注意：使用10 µL核转染尖端时，每次电穿孔需4.0 × 105个细胞。因此，单次基因敲入实验至少需准备2.0 × 106个细胞。
    6. 在24孔板中每孔加入0.5 mL不含Pen/Strep的完全生长培养基（按步骤3.1.1制备），并将培养板预置于37 °C培养箱中预热。
  2. CRISPR/Cas9组分与靶向载体的电穿孔
    1. 开启电穿孔系统。采用先前研究中优化的电穿孔参数21：RAW264.7巨噬细胞为1,400 V/20 ms/2次脉冲，Jurkat T细胞为1,350 V/20 ms/2次脉冲。
    2. 考虑到移液过程中的样品损失，在无菌1.5 mL微量离心管中配制55 µL电穿孔混合液，其中包含每种CRISPR/Cas9载体2.5 µg、线性化靶向载体2.4 µg以及重悬缓冲液R。
      注意：为节省时间，可在离心过程中（步骤3.1.5）同时配制电穿孔混合液。
    3. 将步骤3.1.5制备的2.0 × 106个细胞重悬于步骤3.2.2配制的55 µL电穿孔混合液中。
    4. 使用移液器和10 µL核转染尖端吸取步骤3.2.3中的细胞/电穿孔混合液。
      注意：移液过程中应避免引入气泡，以免导致电穿孔失败。
    5. 将样品加入含有3 mL电穿孔试剂盒缓冲液E的离心管中。
    6. 按照步骤3.2.1所述，对两种细胞类型分别施加相应的电穿孔参数。
    7. 将样品转移至步骤3.1.6中已预热培养基的24孔板的一个孔中。
    8. 对另外四次重复实验，以及仅含靶向载体和仅含CRISPR表达载体的对照组，重复步骤3.2.4–3.2.7。
      注意：更换不同细胞类型或质粒DNA时，需更换核转染尖端和离心管。
    9. 将转染后的细胞培养48–72小时，以使细胞在电穿孔后恢复，并在流式细胞术分析或荧光激活细胞分选（FACS）前表达CRISPR/Cas9组分。转染后24小时，使用配备红色通道的荧光显微镜观察DsRed2的表达情况。
      注意：监测DsRed2荧光细胞的优势在于可评估电穿孔效率，并预测是否适合进一步的细胞分选。

4. 细胞分选以分离假定的基因敲入细胞

  1. 在进行FACS分选前，用完全培养基将转染的细胞洗涤一次。按照步骤3.1.3所述，通过离心收集细胞，然后将细胞沉淀重悬于500 µL新鲜培养基中。
  2. 在生物安全柜内设置细胞分选仪，配备85 µm喷嘴并调节至低流速。选择 "单细胞" 通过将20-30个细胞分选至96孔微孔板盖上，测试分选模式下的单细胞分选效率与精确度。每个孔中央出现一个液滴表明仪器设置正确。
  3. 将步骤4.1中的细胞悬液转移至无菌FACS管中，并加入SYTOX Red死细胞染料，使其终浓度为1 nM。
  4. 在流式细胞分选仪上分析样品。SYTOX Red 和 EBFP2 由 405 nm 激光激发，分别通过 V450/BV421 和 APC 通道检测。DsRed2 由 488 nm 激光激发，通过 PE 通道检测。使用未转染的细胞以及仅表达 EBFP2 或 DsRed2 的单阳性细胞作为光谱补偿对照。
  5. 将10个单细胞分选至每孔含有150 µL预热完全培养基的96孔微孔板的各孔中。培养悬浮细胞系（如Jurkat T细胞）时使用圆底微孔板，培养贴壁细胞RAW264.7巨噬细胞时使用平底微孔板。
    ​注意：每孔分选10个细胞是一种优化策略，可提高细胞存活率，并减少需要铺板的96孔微孔板数量以及需要通过流式细胞术和基因分型筛选的样本数量；若每孔仅分选一个细胞，则需铺更多微孔板，以增加获得正确编辑细胞的几率。

5. 阳性敲入细胞的筛选与验证

  1. 通过流式细胞术筛选候选敲入细胞
    1. 将步骤 4.5 中的细胞孵育 10–15 天，每 3 天添加一次完全生长培养基，以补充因蒸发而损失的液体。对于 Jurkat T 细胞，将圆底 96 孔板中培养的细胞转移至平底板，以优化细胞增殖。
    2. 将扩增后的分选细胞转移至 48 孔板进行进一步扩增。
    3. 当细胞接近汇合时，取一半培养物通过流式细胞术检测 EBFP2 表达（图 3）。通常情况下，48 孔板中汇合生长后一半的培养物相当于 0.5–1.0 × 105 个细胞，足以用于一次流式细胞术样本分析。
    4. 将剩余细胞转移至 24 孔板进行进一步增殖。
    5. 保留 EBFP2 阳性细胞比例较高的候选细胞群体，用于后续基因分型实验。
      注：由于每个 96 孔板的孔中分选了 10 个细胞，因此敲入细胞可能与不表达敲入基因的细胞共同生长。因此，通常需要进行额外一轮细胞分选，以将 EBFP2 阳性细胞与阴性细胞分离。
  2. 通过 PCR 和测序筛选候选敲入细胞
    1. 收集 2 × 105 个候选细胞，使用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA（参见 材料表）。
    2. 为验证同源定向修复（HDR）是否精确发生在 mRosa26 位点而非基因组其他随机位点，使用跨越两侧同源臂（HAs）的引物进行 PCR 扩增（图 4）。选择一个位于靶向载体外侧基因组区域的引物（外部引物）和一个位于靶向载体内部的引物（内部引物）。
      注：类似的设计可用于验证 hROSA26 位点的 HDR。此外，也可轻松设计 PCR 引物以检测目的插入序列（POI）的整合情况。同时，可采用三引物 PCR 同时检测野生型和敲入等位基因的基因型（参见 补充文件，图 S2）。
    3. 使用快速克隆试剂盒对阳性 PCR 产物进行克隆（参见 材料表），并将反应混合物转化至 DH5α 感受态细胞中。
    4. 每轮转化随机挑选 8–10 个单菌落，对步骤 5.2.3 中的 PCR 产物进行 Sanger 测序。
  3. 通过免疫印迹分析和亲和纯化验证阳性敲入细胞
    注：候选细胞可进行免疫印迹分析以验证目的插入序列（POI）的整合，或进行亲和纯化（AP）用于蛋白质-蛋白质相互作用研究。
    1. 根据抗体生产商的说明进行免疫印迹分析。有关一抗和二抗的使用信息，请参见 材料表。
    2. 使用 Strep-Tactin Sepharose 珠子，按照生产商说明对表达 OST 标签 POI 的敲入细胞裂解液进行亲和纯化（AP）（参见 材料表）。
    3. 使用成像仪检测化学发光信号。

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结果

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按照上述方案，在小鼠 RAW264.7 巨噬细胞中对 mRosa26 位点进行敲入实验，我们设计了一种靶向载体以表达人源 ACE2（SARS-CoV-2 病毒的受体）（图 2A）。采用类似的设计，我们构建了人源 Jurkat T 细胞，实现了 OST 标签标记的 RASGRP1 融合蛋白的敲入（图 2C）。在转染三种质粒后，其中两种用于表达 CRISPR/Cas9 系统（DsRed2；pDsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR26-sg2 用于 mRosa26 位点敲入；pDsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2 用于 hROSA26 位点敲入），另一种作为同源重组的 DNA 模板（EBFP2），随后对表达两种荧光报告基因的双阳性细胞进行分选，并接种至 96 孔板中。在使用单细胞分选模式分选的 RAW264.7 细胞中，双阳性细胞（DsRed2+ EBFP2+）比例为 0.91%，但每个孔中收集了 10...

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讨论

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在本实验中，我们以人源Jurkat T细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞为例，展示了如何从载体设计到基因敲入细胞的筛选与验证，完成免疫细胞中的敲入编辑。T细胞和巨噬细胞系均对转染具有抗性36,37；然而，通过结合荧光报告基因与细胞分选技术，可克服CRISPR/Cas9递送效率低的问题。本方案适用于基因功能挽救实验和蛋白质-蛋白质相互作用实验，但由于该方案是针对Rosa26位点的敲入修饰而开发的，因此不能用于研究调控性DNA序列（如转录因子结合位点）。

双荧光报告系统辅助 CRISPR/Cas9 基因敲入编辑
我们成功应用了一种双荧光报告系统，在免疫细胞中瞬时表达独立的 CRISPR/Cas9 载体，此前的研究已证明该系统可实现大片段 DNA 的删除21。我们设计了一种以 DsRed2 荧光蛋白作为报告基因的 CRISPR/Cas9 靶向工具，并引入另一种光...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢新乡医学院流式细胞术核心设施。该技术的开发得到了国家自然科学基金项目81601360（资助LZ）、81471595和32070898（资助YL）的支持。本工作还得到了河南省教育委员会基金项目No. 21IRTSTHN030的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amersham Imager 600通用电气医疗化学发光成像
氨苄青霉素钠盐MP Biomedicals194526
抗兔 IgG，HRP 标记抗体细胞信号传导技术7074在1/5000稀释度下
抗RasGRP1抗体，克隆10.1默克MABS1461.0 μ工作浓度的 g/mL
AscINew England BioLabsR0558S
β-肌动蛋白（D6A8）兔单克隆抗体细胞信号技术公司8457在1/1000稀释度下
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini 自动细胞计数仪Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α 感受态细胞Takara9057
DMSO（二甲基亚砜）MP Biomedicals196055
DNeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69506细胞培养试剂
DPBS（10倍浓度），无钙，无镁赛默飞世尔科技14200075
含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）HyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ 融合BD 生物科学配备生物安全柜
FACS Canto 流式细胞仪BD 生物科学
Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底试管BD 生物科学352003
胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技10099141
FlowJo 版本 10.7BD 生物科学
GAPDH (D16H11) XP 兔单克隆抗体细胞信号技术公司5174以1/1000稀释度
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，HRP赛默飞世尔科技31430在1/5000稀释度下
Immobilon ECL 超级 Western HRP 底物MilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF 膜MilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
硫酸卡那霉素MP Biomedicals194531
LB 琼脂粉赛默飞世尔科技22700041
多通道移液器（30-300 μLEppendorf 或类似产品
Neon 转染系统赛默飞世尔科技MPK5000
Neon 转染系统，10 μL 型试剂盒赛默飞世尔科技MPK1096
Nunc 15 mL 圆锥形无菌离心管赛默飞世尔科技339651
OneTaq® 热启动快速载入® 2X 试剂混合液New England BioLabs(M0489)高GC%模板
PageRuler 预染蛋白标准品，10 至 180 kDa赛默飞世尔科技26616
移液器吸头 0.1-20µlEppendorf 或类似产品0030 075.005
移液器吸头 2-200µlEppendorf 或类似产品0030 075.021
移液器吸头 50-1000µlEppendorf 或类似产品0030 075.064
质粒大提试剂盒Qiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104从限制性消化中纯化质粒
Q5热启动高保真2X预混液New England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
重组抗ACE2抗体 [EPR4435(2)]Abcamab108252在1/1000稀释度下
RPMI 1640培养基HyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose 珠粒IBA Lifesciences2-1201-010
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140122
SYTOX™ 红色死细胞染料，适用于633或635 nm激发赛默飞世尔科技S34859
T4 DNA连接酶New England BioLabsM0202S
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参考文献

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