循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

摘要

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。

摘要

转移是导致癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略不断改进，转移性癌症的预后仍然较差。因此，我们迫切需要深入了解转移发生背后的机制，从而提出针对晚期癌症的有效治疗方法。转移性癌症难以治疗，因为组织活检具有侵入性且难以获取。近年来，液体活检引起了广泛关注，包括来自外周血的无细胞循环脱氧核糖核酸（DNA）和循环肿瘤细胞；我们已从转移性结直肠癌患者中成功建立多个循环肿瘤细胞系，以参与其特征鉴定。事实上，为了对这些稀有且研究不足的细胞进行功能表征，关键步骤是扩增这些细胞。一旦建立，循环肿瘤细胞（CTC）系可在悬浮或贴壁条件下进行培养。在分子层面，可通过免疫荧光或流式细胞分析，利用CTC系进一步评估特定标志物（如分化、上皮或肿瘤干细胞相关标志物）的表达情况。此外，还可利用CTC系评估其对标准化学治疗药物以及靶向治疗药物的敏感性。通过将CTC皮下注射至免疫缺陷小鼠，也可验证CTC系启动肿瘤形成的能力。

最后，可通过编辑循环肿瘤细胞（CTC）的基因，利用短发夹核糖核酸（shRNA）或CRISPR/Cas9技术，来检测特定目的基因在癌症扩散中可能发挥的作用。经基因修饰的CTC可被注射至免疫缺陷小鼠的脾脏中，以实验性地模拟转移发展过程的某一阶段。 体内.

总之，循环肿瘤细胞系是未来研究和个性化医疗的宝贵工具，它将利用最初导致转移的细胞本身来预测治疗效果。

引言

尽管近年来在癌症早期诊断和治疗策略方面取得了进展，但超过百分之九十的癌症发病仍归因于转移¹。转移过程是一个多步骤级联事件，始于肿瘤细胞从原发灶局部脱落并进入血液，在血液中形成循环肿瘤细胞（CTCs），最终定植于远处器官，例如结直肠癌（CRC）常转移至肝脏和肺部²。近年来，液体活检受到越来越多关注，它是一种非侵入性工具，可用于从患者血液样本中有效检测和计数CTCs。肿瘤内遗传异质性是导致药物耐药的主要原因；因此，从肿瘤组织中分离出具有代表性的细胞，已成为实现个体化医疗的一项有前景的技术手段³。

尽管循环肿瘤细胞（CTCs）在血液中出现频率较低（每10⁶ - 10⁷ 白细胞⁴基于循环肿瘤细胞（CTCs）与血液其他成分之间的特性差异，已开发出多种检测与分离技术⁵患者血液样本中CTCs的数量本身即可提供有关恶性肿瘤分期、治疗反应及疾病进展的信息^6,7因此，CTC 分离是转化研究中评估遗传异质性或进行药物筛选的关键工具，同时也是基础研究中表征这些侵袭性细胞的重要手段，因为它们是介导转移发生的....

方案

所有体内实验方案均经动物伦理机构批准。

1. 循环肿瘤细胞在三维培养条件下的扩增

1. 为了在悬浮条件下培养CTC，首先将CTC以每微升最多5个细胞的浓度接种至超低吸附（ULA）24孔板的孔中µL 并加入 1 mL M12 培养基（即添加了 2 的改良型 DMEM-F12） 毫摩尔 L-谷氨酰胺，100 单位/毫升青霉素和链霉素，N2 添加剂，20 ng/mL 表皮生长因子和 10 ng/mL 成纤维细胞生长因子¹⁰).
2. 为促进细胞成球及扩增，将细胞置于低氧条件（2% O₂）下培养₂6至10天之间
3. 当肿瘤球足够大时（100 μm），将其转移至含10% FBS的DMEM/F12培养基中，并接种于经多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上，以促进贴壁生长。 µm），以防止坏死，将其解离以进行扩增。
   1. 将细胞悬液置于2 mL或15 mL离心管中，于300 x g离心5分钟。
   2. 移去上清液，加入 500 µ加入 L 温和解离试剂（例如 Accumax）至沉淀中。
   3. 轻轻涡旋，并在37℃下用温和解离试剂孵育细胞悬液20至30分钟 °C.
      注意：在温和解离试剂（A....

结果

通过免疫荧光（IF）（图1A 右侧面板）和流式细胞术（FACS）（图1B）分别观察到的EpCAM和CD26表达表明，该循环肿瘤细胞（CTC）系具有上皮特性，并表现出癌症干细胞（CSC）的一种标志性特征¹⁰。该上皮特性可通过使用针对其他上皮和间充质标志物的抗体进行染色进一步表征，从而大致判断该CTC系在上皮-间充质转化轴上的位置。其他CSC标志物的表达也可通过免疫染色和细胞计数进行检测。此外，可通过体内药物耐药性和肿瘤启动能力等功能实验进一步验证该CSC表型¹⁰。例如，此处的发光法细胞活力检测显示，CTC的IC50仅在高药物浓度下达到，表明这些细胞具有高度耐药性（图2）。此外，皮下注射CTC表明该CTC系具有成瘤能力（图3A）。这些结果进一步证实了该CTC系的CSC表型。通过.......

讨论

上述方案最初用于结直肠癌循环肿瘤细胞的功能表征，但也可用于其他类型的癌症（如乳腺癌），并可适用于小鼠模型。

真正的限制因素是血液样本中循环肿瘤细胞（CTC）的数量以及用于分离和扩增这些细胞的技术效率。已有多种基于CTC特定特性的分离技术被报道，例如Parsortix，这是一种微流控装置，可根据细胞大小及其可压缩性实现CTC的分离¹³。此外，还有CellSearch，这是一种基于免疫磁珠的检测方法，也是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于计数血液样本中CTC的方法，其原理是通过CD45阴性标记去除污染的淋巴细胞，并结合EpCAM及细胞角蛋白8/18/19等上皮标志物的阳性标记来识别CTC¹⁴。iChip是另一种基于细胞大小的技术，但它同时结合了EpCAM阳性富集或CD45阴性去除策略来进行CTC富集^15,16。最近，我们还使用了一种快速简便的免疫密度分离方法—.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accumax 溶液	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒	Promega	G7570
Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质	Corning	354230
Costar 24 孔透明平底超低吸附多孔板	Corning	3473
Histiogel 标本包埋介质	LabStorage	HG-4000
人 EGF，优质级	Miltenyi Biotec	130-097-751
人 FGF-2，优质级	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	25030081
N-2 补充剂	Gibco	17502048
青霉素-链霉素（5,000 U/mL）	Gibco	15070063