本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内 使用一种临床可获取的平台。
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本文内容
摘要
摘要
表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程T细胞在针对B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（MM）患者的关键临床试验中已展现出前所未有的疗效。然而，由于CAR T细胞向肿瘤部位的迁移和浸润能力较差，以及体内持久性不足，多种障碍限制了其治疗效果，并阻碍了该疗法的广泛应用 体内此外，危及生命的毒性反应（如细胞因子释放综合征或神经毒性）是主要关注的问题。对CAR T细胞进行高效且灵敏的成像与追踪，能够实现对T细胞迁移、扩增以及 体内 表征并有助于制定策略以克服当前CAR T细胞疗法的局限性。本文描述了将钠碘同向转运体（NIS）整合至CAR T细胞的方法，以及利用[18F]四氟硼酸盐-正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）在临床前模型中的应用。本方案中描述的方法也可应用于其他CAR结构和靶基因，而不仅限于本研究中所使用的内容。
引言
嵌合抗原受体T（CAR T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中是一种快速兴起且具有潜在治愈前景的治疗策略1,2,3,4,5,6。在靶向CD19的CAR T（CART19）或靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR T细胞治疗后，已报道了显著的临床疗效2。这促使美国食品药品监督管理局（FDA）批准了CART19细胞用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤（axicabtagene ciloleucel（Axi-Cel）4、tisagenlecleucel（Tisa-Cel）3和lisocabtagene maraleucel）7、急性淋巴细胞白血病（Tisa-Cel）5,8、套细胞淋巴瘤（brexucabtagene autoleucel）
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方案
该方案遵循梅奥诊所机构审查委员会、机构生物安全委员会以及梅奥诊所机构动物护理和使用委员会的指导方针。
1. NIS+ BCMA-CAR T 细胞制备
注意：本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB 17-008762）和机构生物安全委员会（IBC Bios00000006.04）的指南。
- 编码BCMA-CAR、NIS及荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒的制备
注意：合成了第二代BCMA-CAR结构 从头合成 （参见 材料表）并克隆至由延伸因子-1α（EF-1α）启动子调控的第三代慢病毒载体中。BCMA-CAR结构（C11D5.3-41BBz）包含4-1BB共刺激域以及来源于抗人BCMA抗体克隆C11D5.3的单链可变区片段（scFv）33,34NIS 受 EF-1α 启动子调控，并通过自剪切肽（P2A）与嘌呤霉素抗性基因连接。编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体（见下文 材料表) 用于转导肿瘤细胞，使其表达GFP和荧光素酶。- 准备慢病毒载体质粒：pLV-EF1α-BCMA-CAR（15 µg）、pBMN-CMV-GFP-Lu....
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结果
图1展示了生成NIS+BCMA-CAR T细胞的步骤。第0天，分离外周血单个核细胞（PBMCs），然后通过阴性选择法分离T细胞。接着，使用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞。第1天，用NIS和BCMA-CAR慢病毒同时转导T细胞。第3、4、5天，对T细胞进行计数，并添加培养基，调整细胞浓度至1.0 × 106/mL。对于转导了NIS的T细胞，加入1 μg/mL嘌呤霉素以筛选NIS+细胞。第6天，将细胞置于磁铁中1分钟，去除磁珠。然后将去除了磁珠的细胞从管中转移至新的培养瓶中。取一部分细胞（例如50,000个细胞），用抗体染色，通过流式细胞术检测T细胞表面NIS和CAR的表达情况。第8天，对T细胞进行计数，并以10 × 106/mL的浓度用冻存液进行冷冻保存。
图2 表示慢病毒滴定的流程。第0天，将T细胞重悬至浓度为1.0 × 106/mL 的 TCM 中。然.......
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讨论
本文介绍了一种将NIS整合到CAR T细胞中的方法，并对输注后的CAR T细胞进行成像 体内 通过 [18F]TFB-PET。作为概念验证，NIS+通过双重转导生成BCMA-CAR T细胞。我们近期报道过，将NIS整合入CAR T细胞不会损害CAR T细胞的功能与疗效 体内 并允许CAR T细胞的迁移和扩增30随着CAR T细胞疗法的应用从现有的B细胞恶性肿瘤进一步拓展至慢性淋巴细胞白血病（CLL），人们将更加需要能够实现无创监测的工具 体内 输注的过继性T细胞的成像与监测。T细胞的动态成像将有助于验证过继性T细胞的迁移行为，并可能实现对疗效和毒性的早期检测。
NIS 已在临床试验中被研究并验证为一种用于成像细胞和病毒的敏感模态32,42。NIS 示踪剂的生理性摄取主要见于甲状腺/唾液腺、胃和膀胱，这些器官通常不是液体肿瘤.......
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披露
SSK 是诺华（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）和 Mettaforge（通过梅奥诊所）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。RS、MJC 和 SSK 是人类基因公司（Humanigen）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、Celgene、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis、Leahlabs 和 Lentigen 的研究资助。图片使用 BioRender.com 制作。
致谢
本工作部分得到了梅奥诊所K2R项目（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）以及Predolin基金会（RS）的支持。 图1、图2和图4使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 号针头 | Covidien | 8881250206 | |
| 28 号胰岛素注射器 | BD | 329461 | |
| 96 孔板 | Corning | 3595 | |
| 抗人（ETNL）NIS 抗体 | Imanis | REA009 | ETNL 抗体结合 NIS 的胞质 C 末端 |
| 抗人 BCMA，克隆 19F2，PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | 流式抗体 |
| 抗人 CD45，克隆 HI30，BV421 | BioLegend | 304032 | 流式抗体 |
| 抗小鼠 CD45，克隆 30-F11，APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | 流式抗体 |
| 抗兔 IgG 抗体 | R&D | F0110 | NIS 染色二抗 |
| BCMA-CAR 构建体，第二代 | IDT, Coralville, IA | ||
| BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒 | BD | 554714 | |
| CD3 单克隆抗体（OKT3），PE，eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX 系统 B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | 流式细胞仪 |
| 二甲基亚砜 | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| 带鲁尔锁扣头的一次性注射器 | BD | 309646 | |
| D-荧光素钾盐 | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| D-PBS（杜氏磷酸盐缓冲液） | Gibco | 14190-144 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器） | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep 磁力架 | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep 人 T 细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17951 | 阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液 |
| 胎牛血清 | Millipore Sigma | F8067 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon 多模态 PET/CT 扫描仪 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| 异氟烷液体 | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 成像系统 | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS® Spectrum 活体成像系统 | PerkinElmer | 124262 | |
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，适用于 405 nm 激发 | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.22 µm，无菌 | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.45 µm，无菌 | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | 多发性骨髓瘤细胞系 |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | 编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体 |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓度），液体 | Gibco | 10378-016 | |
| PMOD 软件 | PMOD | PBAS 和 P3D | |
| 混合人 AB 血清，血浆来源 | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | 全自动细胞分离仪 |
| RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基） | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50（IVD） | STEMCELL Technologies | 85450 | 密度梯度分离管 |
| 叠氮化钠，5%（w/v） | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| T175 培养瓶 | Corning | 353112 | |
| Terrell（异氟烷，USP） | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol 酒精消毒片 | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基 | Lonza | 04-418Q |
参考文献
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
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重印与许可
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