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方法文章

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

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DOI：

10.3791/62334

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2022年2月17日

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内 使用一种临床可获取的平台。

摘要

表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程T细胞在针对B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（MM）患者的关键临床试验中已展现出前所未有的疗效。然而，由于CAR T细胞向肿瘤部位的迁移和浸润能力较差，以及体内持久性不足，多种障碍限制了其治疗效果，并阻碍了该疗法的广泛应用 体内此外，危及生命的毒性反应（如细胞因子释放综合征或神经毒性）是主要关注的问题。对CAR T细胞进行高效且灵敏的成像与追踪，能够实现对T细胞迁移、扩增以及 体内 表征并有助于制定策略以克服当前CAR T细胞疗法的局限性。本文描述了将钠碘同向转运体（NIS）整合至CAR T细胞的方法，以及利用[18F]四氟硼酸盐-正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）在临床前模型中的应用。本方案中描述的方法也可应用于其他CAR结构和靶基因，而不仅限于本研究中所使用的内容。

引言

嵌合抗原受体T（CAR T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中是一种快速兴起且具有潜在治愈前景的治疗策略1,2,3,4,5,6。在靶向CD19的CAR T（CART19）或靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR T细胞治疗后，已报道了显著的临床疗效2。这促使美国食品药品监督管理局（FDA）批准了CART19细胞用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤（axicabtagene ciloleucel（Axi-Cel）4、tisagenlecleucel（Tisa-Cel）3和lisocabtagene maraleucel）7、急性淋巴细胞白血病（Tisa-Cel）5,8、套细胞淋巴瘤（brexucabtagene autoleucel）9以及滤泡性淋巴瘤（Axi-Cel）10。最近，FDA还批准了靶向BCMA的CAR T细胞疗法用于多发性骨髓瘤（MM）患者（idecabtagene vicleucel）11。此外，针对慢性淋巴细胞白血病（CLL）的CAR T细胞疗法正处于临床开发的后期阶段，预计在未来三年内将获得FDA批准1。

尽管CAR T细胞疗法取得了前所未有的成果，其广泛应用仍受到以下因素限制：1）不足的 体内 CAR T细胞扩增不足或向肿瘤部位迁移能力差，导致持久应答率降低12,13 以及2）危及生命的不良事件的发生，包括细胞因子释放综合征（CRS）14,15CRS 的特征不仅包括免疫系统激活导致炎性细胞因子/趋化因子水平升高，还包括在 CAR T 细胞输注后出现大量 T 细胞增殖。15,16因此，开发一种经过验证的、临床级别的CAR T细胞成像策略 体内 可实现1）CAR T细胞的实时追踪 体内 以监测其向肿瘤部位的迁移并揭示潜在的耐药机制，以及2）监测CAR T细胞的扩增情况，并可能预测其毒性反应，例如细胞因子释放综合征（CRS）的发生。

轻度细胞因子释放综合征（CRS）的临床特征包括高热、乏力、头痛、皮疹、腹泻、关节痛、肌痛和全身不适。在较严重的CRS中，患者可能出现心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾/肝衰竭以及弥散性血管内凝血17,18。总体而言，细胞因子（包括干扰素-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素（IL）-10和IL-6）升高的程度已被证明与临床症状的严重程度相关17,19。然而，由于成本高昂且检测可及性有限，对血清细胞因子进行"实时"监测以预测CRS的应用受到限制。为了充分利用CAR T细胞治疗的优势，可采用过继性T细胞的无创成像技术，以预测CAR T细胞输注后的疗效、毒性反应及复发情况。

多位研究人员已开发出利用基于放射性核素成像的正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT）的策略，该技术具有高分辨率和高灵敏度20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 对于 体内 CAR T细胞迁移的可视化与监测。在这些基于放射性核素的成像策略中，钠碘同向转运体（NIS）已被开发为一种利用PET扫描成像细胞和病毒的敏感手段31,32. NIS+CAR T细胞成像与[18F]TFB-PET 是一种灵敏、高效且便捷的技术，可用于评估和诊断 CAR T 细胞的扩增、迁移及毒性30. 本方案描述了1）NIS的开发+通过高效双重转导制备CAR T细胞以及NIS成像的方法+CAR T细胞与[18F]TFB-PET 扫描。多发性骨髓瘤（MM）中的BCMA-CAR T细胞被用作概念验证模型，以描述NIS作为CAR T细胞成像报告基因的应用。然而，这些方法可推广至其他任何CAR T细胞治疗。

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方案

该方案遵循梅奥诊所机构审查委员会、机构生物安全委员会以及梅奥诊所机构动物护理和使用委员会的指导方针。

1. NIS+ BCMA-CAR T 细胞制备

注意：本方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB 17-008762）和机构生物安全委员会（IBC Bios00000006.04）的指南。

  1. 编码BCMA-CAR、NIS及荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒的制备
    注意：合成了第二代BCMA-CAR结构 从头合成 （参见 材料表）并克隆至由延伸因子-1α（EF-1α）启动子调控的第三代慢病毒载体中。BCMA-CAR结构（C11D5.3-41BBz）包含4-1BB共刺激域以及来源于抗人BCMA抗体克隆C11D5.3的单链可变区片段（scFv）33,34NIS 受 EF-1α 启动子调控，并通过自剪切肽（P2A）与嘌呤霉素抗性基因连接。编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体（见下文 材料表) 用于转导肿瘤细胞，使其表达GFP和荧光素酶。
    1. 准备慢病毒载体质粒：pLV-EF1α-BCMA-CAR（15 µg）、pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro（15 µg）和 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro（15 µg）。
      注意：pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro 和 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro 载体含有嘌呤霉素抗性基因。因此，转导了 NIS 或荧光素酶-GFP 的细胞可使用 1 µg/mL 或 2 µg/mL 嘌呤霉素二盐酸盐进行筛选，具体方法如前所述。14,35.
    2. 接种 20 × 106 293T细胞在T175培养瓶中的培养，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时2确认在显微镜下直接观察时，293T细胞在培养瓶中均匀分布，融合度达到70-90%。
    3. 配制主混合液，包含15 µg表达载体（如CAR、NIS或荧光素酶-GFP线性DNA）、7 µg包膜载体（VSV-G）和18 µg包装载体（gag、pol、rev和tat）。将DNA主混合液用4.5 mL转染培养基稀释，然后加入111 µL预复合试剂（混合物A）。
    4. 准备一个新离心管，将129 µL脂质体转染试剂加入4.5 mL转染培养基中混匀（混合物B）。
    5. 将混合物A与B混合，轻轻弹击离心管以混匀内容物。室温（RT）孵育30分钟。
    6. 孵育后，直接吸除细胞上清液而不使细胞脱落，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺的16 mL培养基。随后，将混合物A与混合物B的混合液逐滴加入293T细胞中。最后，将转染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24小时。
    7. 转染后第1天和第2天，收集293T细胞的上清液，于900 × g 10分钟，然后通过0.45 µm尼龙滤膜过滤。在24和48小时通过超速离心（112,700 × g 孵育2小时，于-80 °C冷冻。
  2. 离体 T细胞分离图1)
    注意：所有细胞培养操作均须在层流柜中进行，并采用无菌技术和个人防护装备。外周血单个核细胞（PBMCs）从健康志愿者经血细胞分离术采集的血液中分离获得。36对本研究中使用的人源细胞进行了病原体筛查。
    1. 采用标准密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
      1. 轻轻将15 mL密度梯度介质（密度为1.077 g/mL）（含α-D-吡喃葡萄糖苷、β-D-呋喃果糖基同多聚物以及3-(乙酰氨基)-5-(乙酰甲氨基)-2,4,6-三碘苯甲酸单钠盐）加入50 mL密度梯度分离管中，避免产生气泡（参见 材料表).
      2. 为避免细胞滞留，将血液样本与含2% FBS的磷酸盐缓冲液（PBS，含0.2 g/L氯化钾、0.2 g/L一水合磷酸二氢钾、8 g/L氯化钠和1.15 g/L磷酸氢二钠）按1:1体积比稀释。轻柔地将稀释后的血液加至密度梯度介质上方，避免破坏两相界面。在1,200 × g 室温下孵育10分钟。
        注意：可使用50 mL密度梯度分离管分离4–17 mL血液样本。50 mL密度梯度分离管（参见 材料表本方案中使用的）不需要 "折断" 离心过程中。然而，当使用标准的50 mL离心管时，需关闭离心机刹车，且离心时间需30分钟。
      3. 将上清液转移至新的50 mL锥形管中，用PBS + 2% FBS定容至50 mL洗涤，然后在300 × g 室温下持续 8 分钟。
      4. 吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于 50 mL PBS + 2% FBS 中。计数细胞数量，然后在 300 × g 室温下孵育8分钟。重复上一步骤，共洗涤2次。
    2. 吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于浓度为 50 × 106 细胞/mL，使用 PBS + 2% FBS
    3. 使用阴性选择磁珠试剂盒从外周血单个核细胞中分离T细胞。
      注意：理想的阴性分选试剂盒应包含连接有针对非T细胞表面抗原的抗体的磁珠。一种常用的试剂盒含有针对CD15、CD14、CD34、CD36、CD56、CD123、CD235a、CD19和CD16的抗体偶联磁珠（参见 材料表).
      1. 将PBMC转移至14 mL聚苯乙烯圆底管中。随后，将PBMC与阴性选择抗体混合物一同放入全自动细胞分离仪，按照制造商提供的方案进行T细胞分离。
  3. T细胞刺激与T细胞扩增（图1)
    1. 为了培养分离的T细胞，需制备T细胞扩增培养基（TCM），该培养基由无血清造血细胞培养基添加10%人血清白蛋白和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺组成。14分离T细胞后，计数细胞并以2 × 10⁶个/mL的浓度进行培养。6 细胞/mL，用 TCM。
    2. 用TCM将抗CD3/CD28磁珠洗涤三次，然后与T细胞共培养。
      1. 轻轻旋转混匀含有磁珠的小管。然后，用移液器吸取所需体积的磁珠（磁珠与细胞比例为3:1）（例如，当刺激1.0 × 10⁶个细胞时，加入3.0 × 10⁶个磁珠）6 T细胞的细胞数，使用3.0 × 106 将抗CD3/CD28磁珠加入无菌微量离心管（1.5 mL）中，用1 mL TCM重悬。
    3. 将含有珠子的微量离心管置于磁力架上1分钟，吸除上清液。从磁力架上取下离心管，将洗涤后的珠子重悬于1 mL TCM中。重复上述两个步骤，共洗涤3次。
    4. 将磁珠重悬于1 mL TCM中，并转移至T细胞。随后，将T细胞稀释至终浓度为1.0 × 106 细胞/mL）重悬细胞。将T细胞/磁珠悬液转移至经组织培养处理的6孔板中，放入培养箱（37 °C，5% CO₂）培养。2).
  4. 慢病毒滴定图2)
    1. 准备用于滴定实验的T细胞。确保细胞数量约为1.0 × 106 可用于滴定一种病毒的细胞。
    2. 按照第1.3.2节所述刺激T细胞。
    3. 接种 1.0 × 105 在96孔板（滴定板）中培养刺激后的T细胞，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24 小时（图2A). 按照第1.2节所述方法分离并刺激T细胞。
    4. 通过向指定列的孔和未转导对照孔中加入 100 µL TCM，制备稀释板（96 孔板）图2B).
    5. 将一管慢病毒颗粒置于冰上解冻，轻轻吹打混匀。取50 µL病毒上清液加入96孔板第6列的各孔中（稀释度3）图2B用移液器上下吹打混匀。
    6. 进行连续稀释（2倍系列稀释）：将50 µL从A6孔转移至B6孔，再从B6孔转移50 µL至C6孔；依此类推，直至G6孔。然后，向滴定板中加入50 µL稀释后的病毒液图2B).
    7. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育滴定板2 孵育48小时，通过流式细胞术检测CAR阳性、NIS阳性或GFP阳性细胞的百分比（图2C).
      1. 以650 × g离心滴定板两次，洗涤各孔 g 4 °C 下 3 分钟
      2. 按照步骤1.5.3至1.5.9所述方法对转导的T细胞进行染色。
      3. 根据 CAR、NIS 或 GFP 阳性细胞的百分比，使用公式计算滴度1):
        滴度 = BCMA-CAR 的百分比+ 或 NIS+ T细胞 × 转导时的T细胞计数 × 特定稀释倍数/体积（1)
  5. 慢病毒转导与NIS+BCMA-CAR T细胞扩增
    1. T细胞刺激后24至48小时，对已刺激的T细胞进行慢病毒转导（T细胞应形成细胞簇）。
      1. 在4 °C下解冻编码CAR或NIS的慢病毒。
      2. 充分混匀刺激后的T细胞以分散细胞团块，然后直接加入新解冻的病毒，感染复数（MOI）为5.0（当转导1.0 × 10⁶个细胞时）。6 T细胞，使用5.0 × 106 慢病毒颗粒）在37 °C、5% CO₂条件下培养转导后的细胞2.
      3. 在第3、4、5天，使用血细胞计数板对转导的T细胞进行计数37 或全自动细胞计数仪38 并调整细胞浓度至 1.0 × 106 细胞/mL，通过添加新鲜的预温TCM实现。对于转导了NIS并携带嘌呤霉素抗性基因的T细胞，在第3、4、5天以1 µg/mL的盐酸嘌呤霉素处理细胞。
    2. 第6天，通过充分混匀以打散T细胞聚集体，并将细胞置于磁铁中1分钟，从而去除转导T细胞（来自步骤1.3.4）中的抗CD3/CD28磁珠。随后，将收集的转导T细胞重新置于培养中，细胞浓度为1.0 × 106 细胞/mL。从T细胞中去除磁珠后，通过流式细胞术检测CAR和NIS的表达水平。
      注意：由于BCMA-CAR的单链可变区片段来源于小鼠，因此可使用与Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG（H+L）进行染色。NIS可通过抗人ETNL抗体进行检测［该抗体针对对应于氨基酸625-643（SWTPCVGHDGGRDQQETNL）的合成肽段］。该抗体识别NIS的胞质C末端，因此在与抗人NIS抗体孵育前必须对T细胞进行透化处理。
    3. 使用山羊抗小鼠IgG（H+L）对BCMA-CAR进行表面染色。
      1. 取一份培养物（例如50,000个T细胞），用流式缓冲液（PBS、1% FBS和1%叠氮化钠）洗涤。随后，将细胞重悬于50 µL流式缓冲液中，加入1 µL羊抗小鼠抗体以检测CAR表达，并加入0.3 µL活死染料Aqua用于排除死细胞。
      2. 在室温避光孵育15分钟，加入150 µL流式缓冲液洗涤细胞，然后以650 × g 4 °C 下持续 3 分钟。
    4. 表面CAR染色后，加入100 µL固定液（含4.21%甲醛的PBS），在4 °C孵育20分钟，以固定并透化细胞。使用含皂苷等细胞透化剂的缓冲液各100 µL，洗涤细胞两次（650 × g 4 °C下离心3分钟。
    5. 将固定和透化的细胞重悬于50 µL透化缓冲液中。然后加入50 µL流式缓冲液中的0.3 ng抗人ETNL NIS抗体，在4 °C孵育1小时。
    6. 加入150 µL流动缓冲液，以650 × g离心细胞 g 4 °C下离心3分钟。在50 µL流式缓冲液中加入2.5 µL抗兔二抗，4 °C孵育细胞30分钟，加入150 µL流式缓冲液洗涤细胞，然后以650 × g 4 °C下持续3分钟
    7. 最后，用200 µL流式缓冲液重悬细胞，进行流式细胞术检测以确定转导效率（图3A，B).
    8. 第8天，计数T细胞并在300 × g 4 °C 下孵育 8 分钟。用冻存液（90% FBS + 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）重悬 T 细胞，细胞浓度为 10 × 106/mL，然后将1 mL分别转移至已标记的冻存管中。
    9. 将小瓶置于 -80 °C 超低温冰箱中保存 48 小时。48 小时后（并在第 10 天前），将 T 细胞转移至液氮中保存。
      注意：参见 图1 NIS 概述+ CAR T细胞制备 图3D 代表……的示例 离体 来自三位不同供体的T细胞扩增

2. 使用[ 18F]TFB-PET扫描对NIS+ BCMA-CAR T细胞进行成像

注意：本方案遵循梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC A00001767-16）、机构审查委员会（IRB）和机构生物安全委员会（IBC（Bios00000006.04））的指南。OPM-2 是一种 BCMA+ 多发性骨髓瘤细胞系，常被用作 BCMA-CAR T 细胞的靶细胞系39,40。

  1. 建立荧光素酶+ BCMA+ OPM-2 细胞
    1. 在经组织培养处理的24孔板中接种500,000个OPM-2细胞。在4 °C条件下解冻编码荧光素酶-GFP的慢病毒。
    2. 以 3.0 的感染复数（MOI）将新鲜解冻的病毒加入 OPM-2 细胞中，用移液器轻轻吹打混匀。将培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）2).
    3. 转导48小时后，加入2 µg/mL嘌呤霉素以筛选转导成功的细胞。转导四天后，通过流式细胞术检测GFP阳性细胞（即荧光素酶阳性细胞）。图3E).
  2. 建立 BCMA+ OPM-2 异种移植小鼠模型（图4).
    1. 计数荧光素酶+ OPM-2 细胞离心两次，以彻底去除细胞培养基。将 OPM-2 细胞重悬于浓度为 10 × 106 细胞/mL，用PBS悬浮。
    2. 在第 -21 天，注射 100 µL（1.0 × 106 荧光素酶的细胞+ 将OPM-2细胞注入8至12周龄免疫缺陷型NOD小鼠的尾部scid IL2rγnull (NSG) 小鼠 (图4).
    3. 在OPM-2细胞注射后第20天（CAR T细胞注射前第1天），通过生物发光成像（BLI）检测肿瘤负荷（图4).
      注意：OPM-2 细胞形成的肿瘤生长缓慢，通常需要 2–3 周才能成功植入。
    4. 通过腹腔（IP）注射，按 10 µL/g 剂量给予 OPM-2 异种移植小鼠 D-荧光素。注射 10 分钟后，在 2% 异氟烷气体麻醉下对小鼠进行生物发光成像（BLI）图5A在确认肿瘤移植成功后，根据肿瘤负荷将小鼠随机分组。
    5. 在CAR T细胞注射前第1天，解冻NIS+BCMA-CAR T 细胞，并通过离心（300 × g，8 分钟，4 °C）。随后，用 TCM 重悬细胞至 2.0 × 106 细胞/mL，37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2).
    6. 第0天，计数并离心NIS+BCMA-CAR T 细胞（300 × g，8 分钟，4 °C）。重悬 NIS+BCMA-CAR T 细胞，50 × 106 细胞/mL，用PBS悬浮。
    7. 注射 100 µL（5.0 × 106 NIS 的细胞+通过尾静脉注射将BCMA-CAR T细胞注入OPM-2异种移植小鼠。在第7天和第15天，使用PET扫描对小鼠进行成像。
  3. NIS+BCMA-CAR T细胞 体内 使用BCMA进行成像+OPM-2 异种移植小鼠模型
    1. 在成像前称量小鼠体重，并移除任何金属耳标以消除与金属相关的伪影。
    2. 制备[18F]TFB，方法同前41.
      注意：[18F]TFB 必须在使用当天制备。放射化学纯度应 >99% 和摩尔活度 >5 GBq/mmol
    3. 注射 9.25 MBq [18通过尾静脉注射将[F]TFB经静脉注入。给予约40分钟的摄取期，使放射性示踪剂在体内分布并清除血液中的残留。
    4. 使用异氟烷吸入（2%）对小鼠进行麻醉。
      注意：异氟烷是首选的吸入性麻醉剂，因其起效迅速且可靠，恢复也较快。
    5. 在麻醉小鼠之前，使用消毒清洁剂清洁麻醉机的所有表面。
    6. 将小鼠放入诱导室中。将蒸发器旋钮调至2%，等待1-2分钟，直至小鼠呈侧卧且无反应状态。
    7. 监测小鼠以避免麻醉不足或呼吸功能过度抑制。简言之，可通过捏足趾确认是否存在麻醉不足。
      注：正常呼吸频率最高可达180次/分钟，可接受的下降率为50%。
    8. 涂抹眼膏以防止角膜干燥和损伤。
    9. 注射后45分钟，在麻醉状态下使用小动物PET/CT成像工作站获取小鼠的PET/CT图像（参见 材料表然后，采集15分钟静态PET图像，随后以360°旋转、180个投影、500 µA、80 keV和200 ms曝光条件采集5分钟CT图像。
  4. 分析获取的成像数据
    1. 使用 PET 图像处理软件分析图像（图5B 和 补充视频 S1).
    2. 定义感兴趣区域（VOI）。
    3. 使用公式计算标准化摄取值（SUV）2).
      VOI 中的 SUV = VOI 内放射活性浓度（MBq/mL）× 体重（g）/ 注射剂量（MBq）  (2)
  5. NIS 的确认+BCMA-CAR T细胞通过流式细胞术检测向肿瘤部位的迁移
    1. 之后[18F]TFB-PET 成像后，将小鼠放回笼中。麻醉停止后，需监测动物直至其恢复有目的的运动，并确保其能够获取食物和水。
    2. 监测小鼠，直至注射的[18F]TFB。一旦放射性同位素无法被检测到，使用CO₂处死小鼠2.
    3. 实施安乐死时，将小鼠放入笼中（每笼不超过5只小鼠）。
    4. 将小鼠暴露于CO2 直至呼吸完全停止，大约需要5-10分钟。
      注意：此安乐死方法必须符合《美国兽医协会动物安乐死指南》（2020年版）。
    5. 为确保小鼠死亡，应通过抓住动物头部后方和尾根部，然后将双手向外拉开进行颈椎脱位。
    6. 收获骨髓以确认 NIS+BCMA-CAR T细胞能有效迁移至肿瘤部位。
    7. 将收获的股骨和胫骨转移至含有5 mL细胞培养基的6孔板中。去除股骨和胫骨上的肌肉和肌腱，并简单剪去股骨和胫骨的两端（关节上方）。
    8. 用胰岛素注射器吸取细胞培养基，将骨髓冲洗至6孔板中。对于股骨，使用22 G针头和5 mL注射器，因为股骨直径大于胫骨。
    9. 使用注射器推杆的平端研磨骨髓。将70 µm细胞滤网置于无菌50 mL锥形管上，过滤研磨后的骨髓。随后用流式缓冲液补满管体积，在300 × g 4 °C下离心8分钟。
    10. 吸弃上清液，用 5 mL 流式缓冲液重悬骨髓细胞。取 200 µL 骨髓细胞悬液转移至 96 孔板。以 300 × g 4 °C 下离心 3 分钟。倾去上清液，用 50 µL 流式缓冲液重悬细胞。
    11. 使用针对 0.25 µg 小鼠 CD45、0.03 µg 人 CD45、0.06 µg 人 CD3、0.24 µg 人 BCMA 以及 0.3 µL 活/死染料（aqua）的流式抗体对骨髓进行染色。将培养板在室温避光孵育 15 分钟。
    12. 将培养板在300 × g条件下离心 g 4 °C 下孵育 3 分钟。然后加入 200 µL 流式缓冲液，在流式细胞仪上检测（图5C).

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结果

图1展示了生成NIS+BCMA-CAR T细胞的步骤。第0天，分离外周血单个核细胞（PBMCs），然后通过阴性选择法分离T细胞。接着，使用抗CD3/CD28磁珠刺激T细胞。第1天，用NIS和BCMA-CAR慢病毒同时转导T细胞。第3、4、5天，对T细胞进行计数，并添加培养基，调整细胞浓度至1.0 × 106/mL。对于转导了NIS的T细胞，加入1 μg/mL嘌呤霉素以筛选NIS+细胞。第6天，将细胞置于磁铁中1分钟，去除磁珠。然后将去除了磁珠的细胞从管中转移至新的培养瓶中。取一部分细胞（例如50,000个细胞），用抗体染色，通过流式细胞术检测T细胞表面NIS和CAR的表达情况。第8天，对T细胞进行计数，并以10 × 106/mL的浓度用冻存液进行冷冻保存。

图2 表示慢病毒滴定的流程。第0天，将T细胞重悬至浓度为1.0 × 106/mL 的 TCM 中。然...

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讨论

本文介绍了一种将NIS整合到CAR T细胞中的方法，并对输注后的CAR T细胞进行成像 体内 通过 [18F]TFB-PET。作为概念验证，NIS+通过双重转导生成BCMA-CAR T细胞。我们近期报道过，将NIS整合入CAR T细胞不会损害CAR T细胞的功能与疗效 体内 并允许CAR T细胞的迁移和扩增30随着CAR T细胞疗法的应用从现有的B细胞恶性肿瘤进一步拓展至慢性淋巴细胞白血病（CLL），人们将更加需要能够实现无创监测的工具 体内 输注的过继性T细胞的成像与监测。T细胞的动态成像将有助于验证过继性T细胞的迁移行为，并可能实现对疗效和毒性的早期检测。

NIS 已在临床试验中被研究并验证为一种用于成像细胞和病毒的敏感模态32,42。NIS 示踪剂的生理性摄取主要见于甲状腺/唾液腺、胃和膀胱，这些器官通常不是液体肿瘤...

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披露

SSK 是诺华（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）和 Mettaforge（通过梅奥诊所）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。RS、MJC 和 SSK 是人类基因公司（Humanigen）授权的 CAR 免疫疗法领域专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、Celgene、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis、Leahlabs 和 Lentigen 的研究资助。图片使用 BioRender.com 制作。

致谢

本工作部分得到了梅奥诊所K2R项目（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）以及Predolin基金会（RS）的支持。 图1、图2和图4使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22 号针头Covidien8881250206
28 号胰岛素注射器BD329461
96 孔板Corning3595
抗人（ETNL）NIS 抗体ImanisREA009ETNL 抗体结合 NIS 的胞质 C 末端
抗人 BCMA，克隆 19F2，PE-Cy7BioLegend357507流式抗体
抗人 CD45，克隆 HI30，BV421BioLegend304032流式抗体
抗小鼠 CD45，克隆 30-F11，APC-Cy7BioLegend103116流式抗体
抗兔 IgG 抗体R&DF0110NIS 染色二抗
BCMA-CAR 构建体，第二代IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒BD554714
CD3 单克隆抗体（OKT3），PE，eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX 系统  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652流式细胞仪
二甲基亚砜Millipore SigmaD2650-100ML
带鲁尔锁扣头的一次性注射器BD309646
D-荧光素钾盐Gold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS（杜氏磷酸盐缓冲液）Gibco14190-144
杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
Dynabeads MPC-S（磁性颗粒浓缩器）Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep 磁力架STEMCELL Technologies18002
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies17951阴性选择磁珠；17951RF 包含吸头和缓冲液
胎牛血清Millipore SigmaF8067
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon 多模态 PET/CT 扫描仪Siemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
异氟烷液体Piramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 成像系统PerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum 活体成像系统PerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 转染试剂InvitrogenL3000075
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，适用于 405 nm 激发InvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.22 µm，无菌Thermo Scientific450-0020
Nalgene 快速流动 500 mL 真空滤器，0.45 µm，无菌Thermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273多发性骨髓瘤细胞系
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389编码荧光素酶-GFP 的慢病毒载体
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓度），液体Gibco10378-016
PMOD 软件PMODPBAS 和 P3D
混合人 AB 血清，血浆来源Innovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
嘌呤霉素二盐酸盐MP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000全自动细胞分离仪
RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基）Gibco21870-076
SepMate-50（IVD）STEMCELL Technologies85450密度梯度分离管
叠氮化钠，5%（w/v）Ricca Chemical7144.8-16
T175 培养瓶Corning353112
Terrell（异氟烷，USP）Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol 酒精消毒片Covidien6818
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基Lonza04-418Q

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