方法文章

使用[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描对嵌合抗原受体T细胞进行动态成像

DOI：

10.3791/62334

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2022年2月17日

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

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该协议描述了非侵入性跟踪T细胞的方法，该T细胞经过基因工程改造，以使用临床可用的平台 在体内 表达嵌合抗原受体。

摘要

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经过基因工程改造以表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞在B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（MM）患者的关键临床试验中显示出前所未有的结果。然而，由于运输和浸润肿瘤部位以及体内缺乏持久性，许多障碍限制了疗效并禁止了CAR T细胞疗法的广泛使用。此外，危及生命的毒性，如细胞因子释放综合征或神经毒性，是主要问题。对CAR T细胞进行高效和灵敏的成像和跟踪，可以评估T细胞的运输，扩增和体内表征，并允许制定策略来克服CAR T细胞治疗的当前局限性。本文描述了在临床前模型中使用[18F]四氟硼酸盐 - 正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）在CAR T细胞中掺入碘化钠共排（NIS）和CAR T细胞成像的方法。除了用于本研究的方法外，该协议中描述的方法还可以应用于其他CAR构建体和靶基因。

引言

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嵌合抗原受体 T （CAR T） 细胞疗法是血液系统恶性肿瘤中一种迅速出现且具有潜在治愈意义的方法1，2，3，4，5，6。在CD19指导的CAR T（CART19）或B细胞成熟抗原（BCMA）CAR T细胞治疗后报告了非凡的临床结果2。这导致美国食品和药物管理局（FDA）批准CART19细胞用于侵袭性B细胞淋巴瘤（axicabtagene ciloleucel（Axi-Cel）4，tisagenlecleucel（Tisa-Cel）3和lisocabtagene maraleucel）7，急性淋巴细胞白血病（Tisa-Cel）5，8，套细胞淋巴瘤（brexucabtagene autoleuce）9<....

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方案

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该协议遵循Mayo Clinic机构审查委员会，机构生物安全委员会和Mayo Clinic机构动物护理和使用委员会的指导方针。

1. NIS+ BCMA-CAR-T细胞生产

注意:本议定书遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB 17-008762）和机构生物安全委员会（IBC Bios00000006.04）的指导方针。

  1. 生产BCMA-CAR，NIS和荧光素酶 - 绿色荧光蛋白（GFP）编码慢病毒。
    注:从头合成第二代BCMA-CAR构建体（见材料表），并在伸长因子-1α（EF-1α）启动子的控制下克隆成第三代慢病毒载体。BCMA-CAR构建体（C11D5.3-41BBz）包括4-1BB共刺激和来自抗人BCMA抗体克隆C11D5.333，34的单链可变片段（scFv）。NIS在EF-1α启动子的控制下，并通过自切割肽（P2A）与嘌呤霉素抗性基因结合。编码荧光素酶-GFP的慢病毒载体（见材料表）用于转导肿瘤细胞，然后表达GFP和荧光素酶。
    1. 制备慢病毒载体质粒:pLV-EF1α-BCMA-CAR（15μg），pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro（15μg）和....

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结果

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图1 表示生成NIS + BCMA-CAR T细胞的步骤。在第0天，分离PBMC，然后通过阴性选择分离T细胞。然后，用抗CD3 / CD28珠刺激T细胞。在第1天，用NIS和BCMA-CAR慢病毒转导T细胞。在第3天、第4天和第5天，计数T细胞并用培养基进料，将浓度调整为1.0×106 / mL。对于NIS转导的T细胞，加入1μg/ mL嘌呤霉素以选择NIS + 细胞。在第6天，通过将细胞放入磁铁中一分钟来去除珠子。然后，将管中去珠细胞放入新烧瓶中。取等分试样细胞（例如，50，000个细胞）并用抗体染色，以使用流式细胞术检查T细胞表面NIS和CAR的表达。在第8天，计数T细胞并用浓度为10×106 / mL的冷冻培养基冷冻保存。

图2显示了滴定慢病毒的轮廓。第0天，将浓度为1.0×106 / mL的T细胞重悬在中药中。然后，用抗CD3 / CD28微球以1.......

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讨论

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本文描述了一种将NIS掺入CAR T细胞并通过[18F]TFB-PET在体内对注入的CAR T细胞进行成像的方法。作为概念验证，NIS + BCMA-CAR T细胞通过双转导产生。我们最近报道说，将NIS掺入CAR T细胞不会损害CAR T细胞在体内的功能和功效，并允许CAR T细胞运输和扩增30。随着CAR T细胞疗法继续从目前的B细胞恶性肿瘤扩展到CLL中的应用，对允许非侵入性体内成像和监测输注过继性T细胞的工具的需求将会增加。T细胞的动态成像将能够验证过继性T细胞运输，并可能允许早期检测疗效和毒性。

NIS已被研究并验证为临床试验中细胞和病毒成像的敏感方式32，42。NIS示踪剂的生理积累主要见于甲状腺/唾液腺、胃和膀胱，这些不是受液体肿瘤影响的常见器官44。特别是在M.......

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披露

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SSK是CAR免疫疗法专利的发明人，该专利授权给诺华（通过Mayo Clinic，宾夕法尼亚大学和诺华公司之间的协议）和Mettaforge（通过Mayo Clinic）。RS，MJC和SSK是CAR免疫疗法领域专利的发明者，这些专利已授权给Humanigen。SSK获得了Kite，Gilead，Juno，Celgene，Novartis，Humanigen，MorphoSys，Tolero，Sunesis，Leahlabs和Lentigen的研究经费。数字是用 BioRender.com 创建的。

致谢

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这项工作得到了Mayo Clinic K2R管道（SSK），Mayo Clinic Center for Personalized Medicine（SSK）和Predolin Foundation（RS）的部分支持。图 1、2 和图 4 是使用 BioRender.com 创建的。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22 号针头Covidien8881250206
28 号胰岛素注射器BD329461
96 孔板宁3595
抗人 （ETNL） NISImanisREA009ETNL 抗体结合 NIS
抗人 BCMA、克隆 19F2、PE-Cy7BioLegend357507Flow 抗体
抗人 CD45、克隆 HI30、BV421BioLegend304032Flow 抗体
抗小鼠 CD45、克隆 30-F11、APC-Cy7BioLegend103116Flow 抗体
抗兔 IgGR&DF0110用于 NIS 染色
BCMA-CAR 构建体的二抗，第二代IDT，爱荷华州
BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒BD554714
CD3 单克隆抗体 （OKT3）、PE、eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX 系统 B5-R3-V5贝克曼库尔特C04652流式细胞仪
二甲基亚砜Millipore SigmaD2650-100ML
一次性注射器，带 Luer-Lok 尖端BD309646
D-荧光素、钾盐金生物技术LUCK-1G
D-PBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水）Gibco14190-144
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水Gibco14190-144
Dynabeads MPC-S（磁珠浓缩器）Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep 磁珠STEMCELL Technologies18002
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies17951阴性选择磁珠;17951RF 包括吸头和缓冲液
胎牛血清Millipore SigmaF8067
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon 多模态 PET/CT 扫描仪Siemens Medical Solutions USA， Inc.10506989 VFT 000 03
异氟烷液体Piramal 重症监护66794-017-10
IVIS Lumina S5 成像系统珀金埃尔默CLS148588
IVIS®Spectrum 活体成像系统PerkinElmer 
Lipofectamine 3000 转染试剂InvitrogenL3000075
LIVE/DEAD 可固定水细胞死细胞染色试剂盒，用于 405 nm 激发InvitrogenL34966
淋巴制备STEMCELL Technologies07851
Nalgene 快速流式 500 mL 真空过滤器，0.22 uM，无菌Thermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL 真空过滤器，0.45 μM，无菌Thermo Scientific450-0045
NOD。CG-PRKDCSCID Il2rgtm1Wjl/SzJJackson 实验室05557
OPM-2DSMZCRL-3273多发性骨髓瘤细胞系
pBMN（CMV-copGFP-Luc2-Puro）Addgene80389编码荧光素酶-GFP
青霉素-链霉素-谷氨酰胺 （100x）Gibco10378-016
PMOD 软件PMODPBAS 和 P3D
混合人 AB 血清血浆衍生创新研究IPLA-SERAB-H-100ML
嘌呤霉素二盐酸盐MP Biomedicals， Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000全自动细胞分离器
RPMI（罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基）Gibco21870-076
SepMate-50 （IVD）STEMCELL Technologies85450密度梯度分离管
叠氮化钠，5% （w/v）Ricca Chemical7144.8-16
T175 培养瓶康宁353112
Terrell（异氟醚，USP）Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基Lonza04-418Q
康的胞质 C 端克拉尔维尔124262 的慢病毒载体，液体 0210055210

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al.

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CAR T PET CT T T T

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