利用光遗传学多点光刺激在小鼠心脏中实现高级心律管理

摘要

本研究报道了一种利用微米级LED阵列进行局部光刺激，同时结合心外膜膜电位的光学标测，以调控表达转染型通道视紫红质-2（ChR2）的完整小鼠心脏节律的方法。

摘要

室性心动过速是全球范围内导致死亡和疾病的主要原因。目前，对于危及生命的心室颤动，唯一有效的治疗方法是使用高能量电击进行电除颤。然而，电除颤可能带来一系列副作用，包括难以忍受的疼痛、组织损伤以及预后恶化，这表明临床上迫切需要开发更为温和的心律调控策略。除了降低能量的电学方法外，心脏光遗传学作为一种强有力的工具被引入，可通过光敏性细胞膜离子通道和光脉冲来调控心脏活动。本研究将介绍一种在Langendorff灌流的完整小鼠心脏上实现成功光刺激的可靠且有效的方法，该方法基于多点起搏，采用3×3微发光二极管（micro-LED）阵列。通过同步进行心外膜膜电位的光学标测，可研究特定区域刺激所产生的效应，并在现场直接评估新诱导的心脏电活动。结果表明，除颤效果在很大程度上取决于心律失常期间所选择的光刺激参数。本文将展示心脏受照区域在终止心律失常的成功率中起着关键作用，以及如何通过靶向控制光照期间的心脏活动来改变心律失常模式。总之，该技术为优化心脏节律的实时反馈调控机制提供了可能，并在区域特异性方面，相较于非特异性的电击治疗，为减少对心脏系统的潜在损伤提供了新的研究方向。

引言

早期对心律失常期间时空动态的研究表明，心脏纤维化过程中复杂的电活动模式由涡旋状的旋转性兴奋波驱动¹。这一发现为心律失常的潜在机制提供了新的认识，并推动了基于心肌多点兴奋的新型电学终止疗法的发展^2,3,4。然而，使用电场刺激的治疗方法具有非局域性，可能激活所有周围的可兴奋细胞，包括肌肉组织，从而导致细胞和组织损伤以及难以忍受的疼痛。与电刺激疗法相比，光遗传学方法能够以高空间和时间精度特异性诱发心肌细胞动作电位，同时保护组织。因此，光遗传学刺激有望实现对心脏纤维化期间紊乱激活模式的微创调控。

通过基因操作将光敏感离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）引入可兴奋细胞后^5,6,7，可利用光刺激实现可兴奋细胞膜电位的去极化。目前已开发出多种医学应用，包括神经网络的激活、心脏活动的调控、视觉与听觉的恢复、脊髓损伤的治疗等^{8,9,10,11,12,13,14}。由于ChR2具有毫秒级响应时间¹⁵，在心脏病学中的应用潜力巨大，非常适合用于精准调控心律失常的心脏动力学。

本研究展示了对转基因小鼠模型完整心脏进行多点光刺激的方法。简而言之，该转基因 alpha-MHC-ChR2 小鼠品系是在欧洲共同体第七框架计划 FP7/2007-2013（HEALTH-F2-2009-241526）范围内建立的，并由 S. E. Lehnart 教授惠赠。通常，将表达由 alpha-MHC 启动子驱动的 Cre 重组酶的成年雄性 C57/B6/J 转基因小鼠与雌性 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J 小鼠交配。由于在第二代中已删除心肌特异性的 STOP 突变盒，其子代表现出稳定的 MHC-ChR2 表达，可用于维持具有光敏感性的心脏小鼠品系。所有实验均使用 36 至 48 周龄的成年雄性和雌性小鼠进行。光照刺激采用一个 3×3 微型 LED 阵列实现，其制备方法如文献^16,17所述，但未采用基于硅的封装结构和短光学玻璃纤维。该装置首次应用于心脏研究见于文献¹⁸。基于类似制造技术的线性微型 LED 阵列已被用作穿透式探针以实现心脏起搏¹⁹。微型 LED 以 3×3 形式排列，间距为 550 µm，可在极小面积上同时提供高空间分辨率和高辐射功率。作者在本研究中展示了一种灵活的局部多点光刺激方法，有望为开发新型抗心律失常治疗策略开辟路径。

以下实验方案涉及一种离体逆行式兰格多夫灌注，其中插管的主动脉作为灌注液入口。由于施加的灌注压力和心脏收缩作用，灌注液流经从主动脉分出的冠状动脉。在本研究中，通过将灌注液储液罐抬高至1米高度（相当于73.2 mmHg）实现恒压灌注，从而获得2.633 ± 0.583 mL/min的流速。实验过程中使用两种类型的台氏液作为灌注液。常规台氏液可维持稳定窦性心律，而低钾（Low-K⁺）台氏液则与吡那地尔混合，用于在小鼠心脏中诱导心律失常。采用六边形水浴槽可透过六个不同的平面窗口观察心脏，从而减少折射带来的畸变，便于多个光学元件的耦合。

方案

所有实验均严格遵循动物福利法规，符合德国法律、当地规定以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）的建议。动物实验审批申请已获得主管动物福利机构的批准，所有实验均已向本单位的动物福利代表报告。

1. 实验准备与材料

1. 光学图谱实验装置
   注意：光学装置和电学装置如图所示 图1光学和电学装置中使用的所有组件均在材料表中详细列出。
   1. 使用LED 1和LED 2诱导心律失常并进行备用除颤。选择波长为λ的高功率LED_蓝色 约475 nm，这是ChR2的激发波长峰值⁶为进一步收窄光学光谱，使用470 ± 20 nm带通滤光片。
      注意：根据数据手册，本研究中使用的 LED 1 和 LED 2 的典型辐射通量为 3.9 至 5.3 W²⁰.
   2. 使用高功率红色LED（LED 3）照射心外膜，以进行光学标测 图1），其发射光的中心波长为 λ_红色 = 625 纳米和700毫瓦的辐射通量²¹. 红光通过628 ± 20 nm带通滤光片过滤，并由截止波长为λ的长通二向色镜（DM）反射_DM = 685 nm
   3. 使用发射滤光片，其波长为 λ_滤光相机 = 775 ± 70 nm，位于相机物镜前方，仅记录心脏活动的荧光发射信号。使用适用于低光照应用的快速物镜。
      注意：小鼠心脏的颤动频率范围为 20 至 35 Hz；因此，应使用足够高速的相机以 1 至 2 kHz 或更高的频率进行记录。
2. 微发光二极管阵列
   注意：此处应用的微LED阵列是采用微系统加工工艺制备的，具体细节见其他文献^16,17.
   1. 在4英寸硅基底（单面抛光，525 µm厚）上旋涂一层5 µm厚的聚酰亚胺（PI）层。
   2. 在氮气氛围下，将该 PI 层在最高温度 450 °C 下固化，保持最高温度恒定 10 分钟。
   3. 采用紫外光刻技术涂覆并图形化反相光刻胶（PR），然后溅射沉积一层250 nm厚的铂薄膜（Pt）。
   4. 通过电镀一层1 µm厚的金（Au）层来增厚该铂基金属化层 以图案化的光刻胶作为掩模层。
   5. 旋涂前 第二层PI层，将带有第一层PI层和电镀金金属化的晶圆暴露于氧等离子体中，以化学活化PI层表面。
   6. 再次在450 °C下固化第二层PI，通过紫外光刻技术对PR层进行图形化，并利用反应离子刻蚀（RIE）以图形化的PR作为掩模层，打开微LED芯片阵列与接口印刷电路板（PCB）的接触焊盘。
      注意：在此反应离子刻蚀（RIE）工艺步骤中，建议分别施加 200 W 和 100 W 的功率，持续时间分别为 10 分钟和 30 分钟，以定义接触焊盘开口以及二维（2D）微发光二极管阵列的外轮廓。
   7. 使用溶剂和等离子体刻蚀去除光刻胶。通过电镀额外的6 µm厚金层进一步加厚接触电极。
   8. 使用倒装芯片键合机将微LED芯片连接到焊盘上。
   9. 在氧等离子体中活化PI表面，并使用无溶剂胶粘剂对微LED芯片进行底部填充。随后在120 °C下固化胶粘剂12小时。
   10. 为封装微LED芯片，使用氩气进行二次等离子体处理，并手动涂覆一层薄氟聚合物。在80 °C下预固化该层1小时。
   11. 在将微LED阵列暴露于氧气等离子体处理以增强硅胶与底层氟聚合物层的粘附性后，手动涂覆硅胶作为最终封装层。将硅胶层在80 °C和180 °C下分别固化1小时。这些最终固化步骤同时可使氟聚合物层完全固化。
   12. 将 PI 基底的焊盘焊接至印制电路板上，该电路板带有条形连接器，用于将阵列与外部仪器连接。使用粘合剂覆盖电路板上的焊盘。
3. 电学装置
   1. 使用适用于记录心电图（ECG）的电极，例如银/氯化银电极或单相动作电位（MAP）电极，并结合心电图放大器以持续监测心脏的电活动。此外，使用适当的信号采集装置（AD）记录所获得的所有电信号。
   2. 为大功率LED（LED 1、LED 2 和 LED 3）选择合适的驱动器，该驱动器应能够控制施加到每个器件的最大电流。使用任意波形发生器（AFG）精确控制LED驱动器的输出。
   3. 使用多通道LED驱动器来控制流经微LED阵列的电流。具有多个输出通道的任意波形发生器（AFG）也适用于此任务。
      注意：建议选择LED驱动器 将电流限制在微发光二极管（micro-LED）的最大额定电流以内，否则二极管可能受损。多通道微发光二极管驱动器的一个示例在另一项研究中有所描述。¹⁸如有必要，可将AFG或任何其他LED驱动器连接至计算机，以远程控制微LED的设置。若采用此方式，需使用选定的通信协议（如通用接口总线（GPIB）或串行连接）将LED驱动器与计算机连接。

   

2. 实验步骤

1. 溶液配制
   1. 配制 Tyrode 溶液：130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl₂₂, 24 mM NaHCO₃₃, 1.8 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 5.6 mM 葡萄糖，0.1% BSA/白蛋白
   2. 制备低钾溶液⁺ Tyrode 氏液：低钾⁺ Tyrode's 溶液的配制方法与常规 Tyrode's 溶液相同，只是 KCl 的添加量减半（即 2 mM 而非 4 mM KCl）。
      ​注意：对于持续3小时的实验，通常需要2-3 L的低钾溶液（Low-K）⁺ Tyrode 溶液（若进行光学标测，则额外加入 Blebbistatin（步骤 2.1.5））以及 1–2 L 的普通 Tyrode 溶液已足够。
   3. 加入Pinacidil至低钾溶液⁺ Tyrode 溶液以促进心律失常诱导过程，如所述于²²，以获得 100 mM 的浓度。操作 Pinacidil 时需佩戴防护手套。
   4. 用常规Tyrode's溶液配制1 mL的50 µM DI-4-ANBDQPQ染料溶液。避免光照以防止光漂白。
   5. 配制10 mM的Blebbistatin储备液。用于光学标测时，将Blebbistatin与100 mM Pinacidil-Tyrode溶液（步骤2.1.3）混合，得到终浓度为5 µM的Blebbistatin 溶液。处理Blebbistatin时请佩戴防护手套。
      注意：在开始光学标测之前，将染料和Blebbistatin溶液置于一旁避光保存。
2. 朗根多夫灌流
   注意：该装置包含两个用于盛放两种台氏液的储液器，储液器通过带三通阀的管路与气泡捕集器相连。随后，通过鲁尔锁扣接头将心脏连接至气泡捕集器，并将其悬置于六边形水浴槽中。水浴槽进一步连接至废液容器，用于收集使用过的台氏液。
   1. 每次实验前，使用完全去矿物质水清洗所有试管。
   2. 用碳合气（5% CO₂ + 95% O₂）充分饱和两种台氏液₂ 和 95% O₂₂) 在室温下孵育30分钟，然后开始实验。用NaOH将Tyrode's溶液的pH值调节至7.4。
   3. 将500 mL的每种Tyrode's溶液分别加入对应的储液罐中，并通过运行Tyrode's溶液冲洗灌流系统，以去除管路及气泡捕集器中的空气，直至管路和气泡捕集器中无可见的气泡残留。
   4. 在整个实验过程中，持续使用碳酰气（Carbogen）对储液器中的台氏液进行通气，以确保灌注液在后续灌注期间 pH 值保持稳定。
   5. 使用水加热泵将灌注系统加热至 37 °C。通过额外的加热元件（如防水加热电缆）维持水浴中灌注液温度恒定。
      注意：实验过程中，必须在Tyrode液储液槽排空前及时补充液体。否则，空气气泡可能进入心脏，导致血管阻塞并引发缺血。
3. 小鼠准备
   1. 皮下注射 0.1 mL 500 I.E. 肝素，30 分钟 心脏分离术前步骤
   2. 将冰冻的Tyrode溶液注入一个6 cm的培养皿和一支2 mL注射器中，置于体视显微镜下。
   3. 将小鼠置于饱和异氟烷环境中进行短暂麻醉2分钟，随后立即行颈椎脱位处死。
      ​注意：为了确认麻醉充分，必须检查足趾间反射是否消失。
   4. 打开胸腔，取出心脏，具体操作参见其他部分²³，放入含有冰冻台氏液的6 cm培养皿中。由于温度降低，心肌搏动将减弱。
   5. 在体视显微镜下进行精细操作，具体步骤见其他部分²³将主动脉连接到钝针上，并用缝合材料固定血管。
   6. 作为对照，通过针头向心脏注入冰冷的Tyrode's溶液，检查心脏是否牢固固定。此步骤还可冲洗出心脏中残留的血液。
   7. 将固定好的心脏转移至灌流系统。连接针头与气泡捕获装置时，确保灌流液持续流动，以防止空气进入心脏。检查水浴中的心脏是否被台氏液完全覆盖。步骤 2.3.4、2.3.5 和 2.3.7 的示意图如下所示 图2.
   8. 确保心脏在几分钟内开始跳动。让心脏适应灌注装置15至20分钟，然后切换至低钾液⁺ 含Pinacidil的台氏液（步骤2.1.3）及低钾溶液⁺ 若进行光学标测，则使用含Pinacidil和Blebbistatin的Tyrode溶液（步骤2.1.5）。
4. 心律失常诱导与光学除颤
   1. 将其中一个心电图（ECG）电极尽可能靠近心脏表面放置，以确保良好的信号质量。将第二个ECG电极悬置于Tyrode's溶液中。确保所采集的心电图信号正被选定的AD系统记录。
   2. 将微LED阵列放置在研究感兴趣区域，例如左心室。
   3. 更换灌流液为低钾液⁺ 用含Pinacidil的Tyrode's液灌注心脏15至30分钟。
   4. 为诱导心律失常，使用LED 1和LED 2以频率f照射心脏，给予20至50次光脉冲序列_ind 25至35 Hz，脉冲持续时间 W_ind 2至15毫秒，光强度LI_{opt_ind} 2.8 mW mm^-2.
   5. 重复该过程直至诱发心律失常。
      注意：心律失常在心电图信号中易于识别，因其信号频率和形态与正常窦性心律不同。若心律失常在接下来的5秒内终止，则将其归类为自限性终止，并开始下一次诱导尝试。
   6. 一旦通过视觉检测到持续性心律失常，即施加一串具有不同脉宽 W 的脉冲_def 和频率 f_def，使用阵列中的三个、六个或九个微发光二极管，在脉冲电流 I 下_脉冲 15分之1 mA 转化为光强度 LI_µLED = 33.31 ± 2.05 mW 毫米^-2.
   7. 若在五次基于微LED阵列的除颤尝试后心律失常仍持续存在，则将该次尝试归类为失败，并启动备用除颤方案。
   8. 作为备用除颤方式，使用LED 1和LED 2，并采用与微LED阵列相同的时序参数。
      ​注意：由于心脏在整个实验过程中均暴露于缺血和代谢应激条件下，即使采用备用除颤措施，仍可能无法终止心律失常。一旦发生此情况，应将灌注液更换为常规Tyrode's液，使心脏恢复5至10分钟。待心电图恢复为窦性心律后，从步骤2.4.3重新开始实验方案。
5. 光学作图
   1. 用2.1.5步骤中配制的Blebbistatin溶液灌注心脏，并等待机械去耦联的发生。当心脏停止跳动但仍可测得心电图信号时，即表示去耦联完成。
      注意：将Blebbistatin溶液配制至上述浓度，并持续用该溶液灌注心脏，可使心脏的机械活动与电活动在整个实验过程中保持解耦状态。
   2. 将1 mL电压敏感染料DI-4-ANBDQPQ（按步骤2.1.4制备）以团注方式注入Langendorff灌流系统的气泡捕集器中。等待5至10分钟，使染料均匀灌注心脏。
      ​注意：在未进行记录时，应关闭红光以避免染料发生光漂白。如果记录的信噪比过低（所获取信号噪声过大），请重复步骤 2.1.4 和 2.5.2。
   3. 将相机对准心脏表面，打开 LED 3，并施加 1.27 mW mm^-2 光功率
   4. 关闭实验室灯光并开始记录。通过将所获得信号的频率与记录的心电图（ECG）频率进行比较，确认是否正在采集光学信号。这可确保所获得的光学信号完全与心脏的电活动相关。
      注意：由于染料发出的荧光信号非常微弱，光学标测需在暗室中进行，以避免其他光源对信号的干扰。

结果

该方案允许使用LED 1和LED 2产生的光刺激脉冲（图1）在完整的小鼠心脏中诱导心室心律失常，刺激频率f_ind 为25 Hz至35 Hz，脉冲持续时间W_ind为2 ms至10 ms。需注意，此类快速光脉冲的目的并非起搏心脏节律，而是扰乱心脏电活动，从而产生不规则的电波，进而诱发心律失常。与电刺激诱导相比，光诱导心律失常的优势在于不会在心电图（ECG）中产生干扰伪影，因此可无限制地对采集到的信号进行后续分析，甚至可在快速起搏期间评估心脏的电反应，这一特点还使得在光消颤过程中观察心脏行为成为可能。而使用电诱导或电除颤方法则无法实现这一点。然而，若所用实验装置因空间限制等原因无法使用外部高功率LED，则可如其他文献所述^3,22,24，在心脏上放置额外的起搏电极以诱导心律失常。

一旦诱发心室纤颤，心律...

讨论

成功治疗心脏快速性心律失常是心脏疾病治疗的关键。然而，心律失常发生、持续和终止背后的生物物理机制尚未完全阐明。因此，心脏研究致力于优化电击治疗，以更温和的方式终止心律失常，从而提高患者的生活质量^28,29,30,31。低能量电刺激方法有望显著减少严重副作用，但仍可能引发不必要的肌肉兴奋。心脏光遗传学 有望克服这一局限性，不仅可提供一种对组织更温和的终止技术，还可作为灵活的平台，用于研究完整小鼠心脏及细胞培养中针对心律失常特异性涡旋样兴奋波的靶向控制^32,33。

基于上述动机，设计并构建了一套稳健的光刺激装置以及相应的实验方案，二者共同提供了一个高度可调的光学系统，可轻松拓展用于三维全景光学成像研究

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学成分
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM 储备液
BSA/白蛋白	Sigma-Aldrich	A4919
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl₂
碳酰气（Carbogen）	Westfalen		50 升气瓶
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	光学标测染料
葡萄糖	Sigma-Aldrich	D9434	C₆H₁₂O₆
肝素	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25,000 I.E./5 ml，仅凭处方供应
盐酸	Merck	1.09057.1000	HCl，1 M 储备液
异氟烷	CP Pharma		1 ml/ml，仅凭处方供应
氯化镁	Merck	8.14733.0500	MgCl₂
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	30407	KH₂PO₄
吡那地尔一水合物	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM 储备液
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO₃
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
氢氧化钠	Merck	1.09137.1000	NaOH，1 M 储备液
电生理设备
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	数据采集与分析系统
定制心电图放大器，或替代型号 ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	心电图放大器
使用加热电缆自制的水浴加热装置	RMS Heating System	HK-5,0-12	120 W 加热电缆
六边形水浴槽
LED 驱动电源	Thorlabs	KPS101	15 V、2.4 A 电源单元，带 3.5 mm 插孔连接器，用于单个 K 或 T 立方模块
LEDD1B LED 驱动器	Thorlabs	LEDD1B	T 立方 LED 驱动器，最大驱动电流 1200 mA
MAP、ECG 电极	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	用于离体心脏的微型心电图电极
微型 LED 驱动器，例如 AFG	Agilent Instruments	A-2230	任意波形发生器（AFG）
信号发生器	Agilent Instruments	A-2230	AFG
微型 LED 阵列组件
环氧胶	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	双组分环氧树脂
氟聚合物	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	高透明度氟聚合物
图像反转光刻胶	Merck KGaA	AZ 5214E	用于高分辨率的图像反转光刻胶
LED 芯片	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	蓝色微型 LED
光刻胶	Merck KGaA	AZ 9260	厚层正性光刻胶
聚酰亚胺	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	聚酰亚胺溶液
硅胶	NuSil Technology LLC	MED-6215	低粘度硅橡胶
无溶剂粘合剂	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	低粘度环氧树脂
光学标测
蓝色滤光片	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	蓝色激发滤光片
相机	Photometrics	Cascade 128+	高性能 EMCCD 相机
相机物镜	Navitar	DO-5095	Navitar 高速定焦镜头，适用于 CCD 和 CMOS 相机
二向色镜	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm 边缘 BrightLine® 单边标准透射式荧光二向色分光镜
发射滤光片	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® 单通带通滤光片
散热片	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	散热器 - LED STAR LED 散热片，直径 45 mm，长度 68 mm，黑色/银色，底板无螺纹
LED 1 和 LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	高功率单色蓝色 LED，460 nm，130 流明，700 mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm，700 mW（最小值），安装式 LED，1000 mA
透镜	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LZ4 LED 照明透镜组件，窄泛光束型
用于功率计的光电二极管	Thorlabs	S120VC	标准光电二极管功率传感器
功率计	Thorlabs	PM100D	紧凑型功率与能量计
红色滤光片	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® 单通带通滤光片