本研究报道了一种利用微米级LED阵列进行局部光刺激，同时结合心外膜膜电位的光学标测，以调控表达转染型通道视紫红质-2（ChR2）的完整小鼠心脏节律的方法。
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方法文章
利用光遗传学多点光刺激在小鼠心脏中实现高级心律管理
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
室性心动过速是全球范围内导致死亡和疾病的主要原因。目前，对于危及生命的心室颤动，唯一有效的治疗方法是使用高能量电击进行电除颤。然而，电除颤可能带来一系列副作用，包括难以忍受的疼痛、组织损伤以及预后恶化，这表明临床上迫切需要开发更为温和的心律调控策略。除了降低能量的电学方法外，心脏光遗传学作为一种强有力的工具被引入，可通过光敏性细胞膜离子通道和光脉冲来调控心脏活动。本研究将介绍一种在Langendorff灌流的完整小鼠心脏上实现成功光刺激的可靠且有效的方法，该方法基于多点起搏，采用3×3微发光二极管（micro-LED）阵列。通过同步进行心外膜膜电位的光学标测，可研究特定区域刺激所产生的效应，并在现场直接评估新诱导的心脏电活动。结果表明，除颤效果在很大程度上取决于心律失常期间所选择的光刺激参数。本文将展示心脏受照区域在终止心律失常的成功率中起着关键作用，以及如何通过靶向控制光照期间的心脏活动来改变心律失常模式。总之，该技术为优化心脏节律的实时反馈调控机制提供了可能，并在区域特异性方面，相较于非特异性的电击治疗，为减少对心脏系统的潜在损伤提供了新的研究方向。
引言
早期对心律失常期间时空动态的研究表明，心脏纤维化过程中复杂的电活动模式由涡旋状的旋转性兴奋波驱动1。这一发现为心律失常的潜在机制提供了新的认识，并推动了基于心肌多点兴奋的新型电学终止疗法的发展2,3,4。然而，使用电场刺激的治疗方法具有非局域性，可能激活所有周围的可兴奋细胞，包括肌肉组织，从而导致细胞和组织损伤以及难以忍受的疼痛。与电刺激疗法相比，光遗传学方法能够以高空间和时间精度特异性诱发心肌细胞动作电位，同时保护组织。因此，光遗传学刺激有望实现对心脏纤维化期间紊乱激活模式的微创调控。
通过基因操作将光敏感离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）引入可兴奋细胞后5,6,7，可利用光刺激实现可兴奋细胞膜电位的去极化。目前已开发出多种医学应用，包括神经网络的激活、心脏活动的调控、视觉与听觉的恢复、脊髓损伤的治疗等8,9,
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方案
所有实验均严格遵循动物福利法规，符合德国法律、当地规定以及欧洲实验动物科学联合会（FELASA）的建议。动物实验审批申请已获得主管动物福利机构的批准，所有实验均已向本单位的动物福利代表报告。
1. 实验准备与材料
- 光学图谱实验装置
注意：光学装置和电学装置如图所示 图1光学和电学装置中使用的所有组件均在材料表中详细列出。- 使用LED 1和LED 2诱导心律失常并进行备用除颤。选择波长为λ的高功率LED蓝色 约475 nm，这是ChR2的激发波长峰值6为进一步收窄光学光谱，使用470 ± 20 nm带通滤光片。
注意：根据数据手册，本研究中使用的 LED 1 和 LED 2 的典型辐射通量为 3.9 至 5.3 W20. - 使用高功率红色LED（LED 3）照射心外膜，以进行光学标测 图1），其发射光的中心波长为 λ红色 = 625 纳米和700毫瓦的辐射通量21. 红光通过628 ± 20 nm带通滤光片过滤，并由截止波长为λ的长通二向色镜（DM）....
- 使用LED 1和LED 2诱导心律失常并进行备用除颤。选择波长为λ的高功率LED蓝色 约475 nm，这是ChR2的激发波长峰值6为进一步收窄光学光谱，使用470 ± 20 nm带通滤光片。
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结果
该方案允许使用LED 1和LED 2产生的光刺激脉冲（图1）在完整的小鼠心脏中诱导心室心律失常，刺激频率find 为25 Hz至35 Hz，脉冲持续时间Wind为2 ms至10 ms。需注意，此类快速光脉冲的目的并非起搏心脏节律，而是扰乱心脏电活动，从而产生不规则的电波，进而诱发心律失常。与电刺激诱导相比，光诱导心律失常的优势在于不会在心电图（ECG）中产生干扰伪影，因此可无限制地对采集到的信号进行后续分析，甚至可在快速起搏期间评估心脏的电反应，这一特点还使得在光除颤过程中观察心脏行为成为可能。而使用电诱导或电除颤方法则无法实现这一点。然而，若所用实验装置因空间限制等原因无法使用外部高功率LED，则可如其他文献所述3,22,24，在心脏上放置额外的起搏电极以诱导心律失常。
一旦诱发纤颤，心律失常.......
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讨论
成功治疗心脏快速性心律失常是心脏疾病治疗的关键。然而，心律失常发生、持续和终止背后的生物物理机制尚未完全阐明。因此，心脏研究致力于优化电击治疗，以更温和的方式终止心律失常，从而提高患者的生活质量28,29,30,31。低能量电刺激方法有望显著减少严重副作用，但仍可能引发不必要的肌肉兴奋。心脏光遗传学 有望克服这一局限性，不仅可提供一种对组织更温和的终止技术，还可作为灵活的平台，用于研究完整小鼠心脏及细胞培养中针对心律失常特异性涡旋样兴奋波的靶向控制32,33。
基于上述动机，设计并构建了一套稳健的光刺激装置以及相应的实验方案，二者共同提供了一个高度可调的光学系统，可轻松拓展用于三维全景光学成像研究
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披露
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Marion Kunze 和 Tina Althaus 在实验过程中提供的出色技术支持。本研究的成果获得了欧洲共同体第七个框架计划 FP7/2007-2013（资助协议编号 HEALTH-F2-2009-241526）的资助。德国心血管研究中心（DZHK e.V.，项目 MD28）哥廷根合作站点、德国研究基金会 CRC 1002（项目 C03）以及马克斯·普朗克学会也提供了支持。本工作部分得到了德国研究基金会（DFG，资助编号 EXC 1086）资助的卓越集群 BrainLinks-BrainTools 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学成分 | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM 储备液 |
| BSA/白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl₂ |
| 碳酰气（Carbogen） | Westfalen | 50 升气瓶 | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | 光学标测染料 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D9434 | C₆H₁₂O₆ |
| 肝素 | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25,000 I.E./5 ml，仅凭处方供应 | |
| 盐酸 | Merck | 1.09057.1000 | HCl，1 M 储备液 |
| 异氟烷 | CP Pharma | 1 ml/ml，仅凭处方供应 | |
| 氯化镁 | Merck | 8.14733.0500 | MgCl₂ |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | 30407 | KH₂PO₄ |
| 吡那地尔一水合物 | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM 储备液 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO₃ |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| 氢氧化钠 | Merck | 1.09137.1000 | NaOH，1 M 储备液 |
| 电生理设备 | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | 数据采集与分析系统 |
| 定制心电图放大器，或替代型号 ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | 心电图放大器 |
| 使用加热电缆自制的水浴加热装置 | RMS Heating System | HK-5,0-12 | 120 W 加热电缆 |
| 六边形水浴槽 | |||
| LED 驱动电源 | Thorlabs | KPS101 | 15 V、2.4 A 电源单元，带 3.5 mm 插孔连接器，用于单个 K 或 T 立方模块 |
| LEDD1B LED 驱动器 | Thorlabs | LEDD1B | T 立方 LED 驱动器，最大驱动电流 1200 mA |
| MAP、ECG 电极 | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | 用于离体心脏的微型心电图电极 |
| 微型 LED 驱动器，例如 AFG | Agilent Instruments | A-2230 | 任意波形发生器（AFG） |
| 信号发生器 | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| 微型 LED 阵列组件 | |||
| 环氧胶 | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | 双组分环氧树脂 |
| 氟聚合物 | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | 高透明度氟聚合物 |
| 图像反转光刻胶 | Merck KGaA | AZ 5214E | 用于高分辨率的图像反转光刻胶 |
| LED 芯片 | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | 蓝色微型 LED |
| 光刻胶 | Merck KGaA | AZ 9260 | 厚层正性光刻胶 |
| 聚酰亚胺 | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | 聚酰亚胺溶液 |
| 硅胶 | NuSil Technology LLC | MED-6215 | 低粘度硅橡胶 |
| 无溶剂粘合剂 | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | 低粘度环氧树脂 |
| 光学标测 | |||
| 蓝色滤光片 | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | 蓝色激发滤光片 |
| 相机 | Photometrics | Cascade 128+ | 高性能 EMCCD 相机 |
| 相机物镜 | Navitar | DO-5095 | Navitar 高速定焦镜头，适用于 CCD 和 CMOS 相机 |
| 二向色镜 | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm 边缘 BrightLine® 单边标准透射式荧光二向色分光镜 |
| 发射滤光片 | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® 单通带通滤光片 |
| 散热片 | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | 散热器 - LED STAR LED 散热片，直径 45 mm，长度 68 mm，黑色/银色，底板无螺纹 |
| LED 1 和 LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | 高功率单色蓝色 LED，460 nm，130 流明，700 mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm，700 mW（最小值），安装式 LED，1000 mA |
| 透镜 | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LZ4 LED 照明透镜组件，窄泛光束型 |
| 用于功率计的光电二极管 | Thorlabs | S120VC | 标准光电二极管功率传感器 |
| 功率计 | Thorlabs | PM100D | 紧凑型功率与能量计 |
| 红色滤光片 | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® 单通带通滤光片 |
参考文献
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation....
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