本文介绍了一种利用基于DNA的张力探针成像免疫细胞受体受力的详细实验方案。该方法可绘制受体受力图谱 >4.7 pN 的实时力，并能对力进行时间上的积分。
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本文内容
摘要
摘要
相邻细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的连接处所传递的机械力，在调控从发育到免疫学等多种生物学过程方面至关重要。因此，开发能够在分子尺度上研究这些力的工具具有重要意义。我们课题组开发了一系列分子张力传感器，用于定量和可视化细胞产生并传递至特定配体的力学信号。其中最灵敏的一类分子张力传感器由核酸茎环发夹结构组成。这类传感器利用荧光团-淬灭剂对来报告在受力条件下DNA发夹结构的机械拉伸与展开状态。DNA发夹张力传感器的一个挑战在于其可逆性：当张力解除后，发夹结构会迅速重新折叠，因此难以记录短暂的力学事件。本文中，我们描述了制备可“锁定”DNA张力传感器的实验方案，使其无法重新折叠，从而实现机械信息的“存储”。该方法能够记录高度瞬时的皮牛顿级力学信号，并可通过添加互补核酸链解除锁定，实现机械信息的“擦除”。这种在实时张力成像与机械信息存储之间切换的能力，有助于揭示T细胞在执行免疫功能过程中常见的微弱、短暂且丰度较低的力学信号。
引言
免疫细胞通过持续爬行并扫描靶细胞表面的抗原以抵御病原体和癌细胞，这些抗原散布在细胞表面1,2。当T细胞受体（TCR）与靶细胞表面表达的肽-主要组织相容性复合物（pMHC）结合时，即启动抗原识别过程。由于TCR与pMHC的识别发生在两个可移动细胞之间的接触界面上，长期以来人们推测该过程会受到机械力的影响。此外，这促使了TCR激活的力学感受模型的提出，该模型认为TCR所受的机械力有助于其功能发挥3,4。为了理解机械力在何时、何地以及如何影响T细胞功能，迫切需要开发能够可视化T细胞传递的分子水平机械力的工具。传统上，牵引力显微镜（TFM）和微柱阵列被用于研究细胞层面的力学作用5,6。然而，TFM和微柱阵列的力敏感度处于纳牛顿（nN）量级，通常不足以研究细胞受体传递的皮牛顿（pN）级别的分子力7。为了提高检测的力分辨率和空间分辨率，我们实验室率先开发了分子张力探针，最初使用聚乙二醇（PEG）聚合物合成7。分子张力探针由一个可伸展的分子“弹簧”（如PEG、蛋白质或DNA）构成，其两端分别连接荧光团和....
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方案
OT-1 转基因小鼠饲养于埃默里大学动物资源中心。所有实验均经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照其规程进行。
1. 寡核苷酸制备
- 将配体链DNA溶解于水（电阻率为18.2 MΩ，整个实验流程均使用该规格水）中。涡旋混匀后，使用台式离心机离心收集溶液。调节加水量，使终浓度为1 mM。使用NanoDrop分光光度计测定260 nm处的吸光度，根据寡核苷酸的消光系数确定最终浓度。
注意：配体链在两端均带有修饰基团，5'端为氨基，3'端为生物素，分别用于与荧光染料偶联以及展示生物素化配体。配体链中的氨基需与荧光染料偶联。本实验选用Cy3B染料进行偶联，因其具有高亮度和良好的光稳定性，但该染料通常不直接商业化供应，需自行在实验室完成偶联。因此，下文将描述氨基与NHS酯类染料的偶联方法。对于无法获得核酸修饰相关设备或资源的终端用户，可从提供高亮度、高光稳定性染料（如Alexa和Atto系列染料）的定制DNA合成公司直接购买已修饰的核酸。 - 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）和1 M NaHCO3溶液。取10 µL 1 mM氨基配体链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO3和60 µL H2O，混匀。在使用前立即用10 µL DMSO溶解50 µg Cy3B NHS酯，并将其加入上述混合液中，总体....
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结果
此处展示了代表性的表面质量控制图像（图4）。高质量的表面在RICM通道中应具有干净的背景（图4B），在Cy3B通道中应呈现均匀的荧光强度（图4C）。使用相同的成像设备和完全一致的荧光成像采集条件时，每次使用DNA探针进行实验所获得的背景荧光强度应保持一致且可重复。我们建议在每组独立实验前，将其作为表面质量控制的指标。
在本文中，我们展示了一些代表性数据（图5) 与OT-1初始CD8+ 细胞作为一种模型细胞类型，可特异性识别鸡卵清蛋白。实验中包含CD3ε抗体作为系统的阳性对照，并以同源抗原pMHC N4（SIINFEKL）为例进行说明。细胞接种于功能化基底上，该基底修饰有4.7 pN的DNA发夹探针，探针呈现抗CD3ε抗体或pMHC N4。30分钟后，通过反射干涉对比显微镜（RICM）记录细胞铺展情况，并在Cy3B通道中实时捕.......
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讨论
通过本文提供的详细步骤，可制备DNA发夹张力探针底物，用于绘制和量化免疫细胞产生的受体张力。当细胞接种到DNA发夹张力探针底物上时，受体会同时从化学和机械层面感知配体，细胞随之着陆、附着并铺展，其中机械信号由我们的探针检测。然而，在某些情况下，细胞可能无法铺展（图7A）或无法产生张力信号。这通常是表面化学问题所致，需要进行故障排查（Table 1）。配体密度偏低是导致细胞无法铺展最常见的原因之一。这可能由多种因素引起，例如配体降解、DNA链降解、APTES和/或LA-PEG-NHS等试剂水解、金纳米颗粒聚集，或玻璃盖玻片清洁不充分。通过比较成功实验与失败实验中底物的背景荧光强度（图7B），可快速判断问题来源。例如，背景测量中出现强荧光信号表明DNA探针的固定已成功；而背景信号弱则提示在加入链霉亲和素和生物素化配体之前的制备步骤存在问题。若问题源于配体，可通过将其以10 µg/mL浓度包被在玻璃载片或96孔板孔中，检测细胞黏附情况来评估其质量。这对于pMHC配体和抗CD3抗体而言是一种有.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01GM131099、NIH R01GM124472以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER 1350829的支持。我们感谢NIH四聚体中心提供的pMHC配体。本研究部分由埃默里大学综合糖组学核心设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-羟基吡啶酸（3-HPA） | Sigma | 56197 | 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）基质 |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | 表面处理 |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Acros | AC430941000 | 表面处理 |
| 10× 红细胞裂解缓冲液 | Biolegend | 00-4333-57 | 缓冲液 |
| 8.8 nm 金纳米颗粒，单宁酸 | Nanocomposix | 定制订单 | 表面处理 |
| Atto647N NHS 酯 | Sigma | 18373-1MG-F | 荧光染料，寡核苷酸制备 |
| Attofluor 细胞培养皿（用于显微镜） | Thermo Fisher Scientific | A7816 | 成像 |
| BD 注射器（仅限 Luer-Lok 接头） | BD bioscience | 309657 | 细胞 |
| 生物素标记抗小鼠 CD3e 抗体 | ebioscience | 13-0031-82 | 抗体/配体 |
| 生物素标记 pMHC 卵清蛋白（SIINFEKL） | 埃默里大学 NIH 四聚体核心设施 | NA | 抗体/配体 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | 735078001 | 封闭非特异性相互作用 |
| 细胞滤筛 | Biologix | 15-1100 | 细胞 |
| 盖玻片迷你架（聚四氟乙烯材质） | Thermo Fisher Scientific | C14784 | 表面处理 |
| Cy3B NHS 酯 | GE Healthcare | PA63101 | 荧光染料，寡核苷酸制备 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Corning | 21-031-CM | 缓冲液 |
| 乙醇 | Sigma | 459836 | 表面处理 |
| Hank’s 平衡盐溶液（HBSS） | Sigma | H8264 | 缓冲液 |
| 过氧化氢 | Sigma | H1009 | 表面处理 |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | 表面处理 |
| Midi MACS（LS）启动试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | 细胞 |
| 小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | 细胞 |
| Nanosep MF 离心装置 | Pall laboratory | ODM02C35 | 寡核苷酸制备 |
| 2 号圆形玻璃盖玻片 | VWR | 48382-085 | 表面处理 |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | 表面处理 |
| P2 凝胶 | Bio-rad | 1504118 | 寡核苷酸制备 |
| 硫酸 | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | 表面处理 |
| 乙酸磺基-NHS 酯 | Thermo Fisher Scientific | 26777 | 表面处理 |
| 设备 | |||
| Agilent AdvanceBio 寡核苷酸 C18 色谱柱，4.6 × 150 mm，2.7 μm | 653950-702 | 寡核苷酸制备 | |
| Barnstead Nanopure 水纯化系统 | Thermo Fisher | 水 | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 物镜 | Nikon | 显微镜 | |
| Cy5 滤光立方体 | CHROMA | 显微镜 | |
| evolve 电子倍增电荷耦合器件（EMCCD） | Photometrics | 显微镜 | |
| 高效液相色谱仪 | Agilent 1100 | 寡核苷酸制备 | |
| Intensilight 正置荧光光源 | Nikon | 显微镜 | |
| 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS） | Voyager STR | 寡核苷酸制备 | |
| Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher | 寡核苷酸制备 | |
| Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜 | Nikon | 显微镜 | |
| Nikon 完美聚焦系统 | Nikon | 显微镜 | |
| NIS Elements 软件 | Nikon | 显微镜 | |
| 四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光立方体 | CHROMA | 显微镜 | |
| RICM 滤光立方体 | CHROMA | 显微镜 | |
| TIRF 激光发射器（488 nm（50 mW）、561 nm（50 mW）和 640 nm） | Coherent | 显微镜 | |
| TRITC 滤光立方体 | CHROMA | 显微镜 | |
| 寡核苷酸名称 | 5' 修饰 / 3' 修饰 | 序列（5' 至 3'） | 用途 |
| 15 个碱基的胺修饰锁定链 | 5' 修饰： 无修饰 3' 修饰： /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 锁定实时张力信号 |
| 15 个碱基的 Atto647N 标记锁定链 | 5' 修饰： Atto647N 3' 修饰： /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 锁定实时张力信号 |
| 15 个碱基的非荧光锁定链 | 5' 修饰： 无修饰 3' 修饰： 无修饰 | A AAA AAC ATT TAT AC | 用于定量分析的锁定实时张力信号 |
| 4.7 pN 发夹链 | 5' 修饰： 无修饰 3' 修饰： 无修饰 | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | 发夹探针 |
| 胺修饰配体链 | 5' 修饰： /5AmMC6/ 3' 修饰： /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 发夹探针 |
| BHQ2 锚定链 | 5' 修饰： /5ThiolMC6-D/ 3' 修饰： /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | 发夹探针 |
| Cy3B 标记配体链 | 5' 修饰： Cy3B 3' 修饰： /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 发夹探针 |
| 解锁链 | 5' 修饰： 无修饰 3' 修饰： 无修饰 | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | 解锁累积张力信号 |
参考文献
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.
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