需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

成年斑马鱼的部分肝切除术

4.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62349

⸱

2021年4月4日

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

本文内容

摘要

本方案描述了在成年斑马鱼中切除肝脏腹叶以研究肝脏再生的过程。

摘要

肝衰竭是全球主要的死亡原因之一，美国慢性肝病导致的死亡率正在急剧上升。健康的肝脏能够从毒性损伤中再生，但在晚期肝病中，肝脏的自然再生能力会受到损害。斑马鱼已成为研究再生的有力实验体系。它们是研究部分肝切除后肝脏再生的理想模型，部分肝切除是一种具有直接临床相关性的手术，即外科切除部分肝脏而保留其余部分完整。目前尚无部分肝切除的标准操作流程；以往使用该模型的研究采用了略有不同的方案，并报告了不同的结果。本文描述了一种在成年斑马鱼中实施部分肝切除的高效且可重复的方案。我们利用该技术证明，斑马鱼能够对被切除的肝叶进行表型再生。该方案可用于进一步探究斑马鱼肝脏再生所需的机制。

引言

在人体的实质性器官中，肝脏是唯一具有再生能力的器官1。这一点至关重要，因为肝脏是一个关键器官，负责重要的代谢功能、能量储存、血液解毒、血浆蛋白分泌以及胆汁生成2。因毒性或炎症损伤而丢失的肝细胞主要通过剩余肝细胞的分裂来补充1。研究肝脏再生的一个经典实验模型是部分肝切除术，即切除肝脏的个别叶，而保留其余肝叶完整3。该手术最初在大鼠中建立，其中约切除肝脏总质量的三分之二。在哺乳动物中进行部分肝切除术后，剩余肝叶会发生代偿性再生，直至肝脏恢复其初始质量。值得注意的是，哺乳动物的肝脏并不会重新生成缺失的肝叶。

斑马鱼（Danio rerio）是研究成体器官再生的可行模型4。尽管斑马鱼肝脏在结构上与哺乳动物肝脏不同，但其由相同类型的细胞组成，并发挥与哺乳动物相似的功能2。斑马鱼肝脏由三个叶组成，包括两个背侧叶和一个沿肠道扁平分布的单一腹侧叶。此前已在斑马鱼中实施过部分肝切除术，但关于其确切再生模式的研究结果存在争议。通常通过完全切除整个腹侧叶来实现约三分之一的部分肝切除。早期研究报告称，在切除腹侧叶后，该叶可在一周内完全再生5,6,7，这表明与哺乳动物肝脏不同，斑马鱼肝脏具备表形态再生能力。然而后续研究显示，腹侧叶的切除实际上导致背侧叶发生代偿性再生，而非缺失腹侧叶的再生，最终在一周内恢复肝脏质量8,9。对腹侧叶切除后背侧叶的转录组分析揭示了与代偿性再生相关的重要变化10。鉴于肝脏再生模式可能随损伤程度的不同而变化8，我们推测研究结果之间的差异可能是由于不同研究团队在部分肝切除实验操作流程上的技术差异所致。

本方案描述了一种通过切除腹叶对成年斑马鱼进行三分之一部分肝切除的手术方法。该技术将有助于评估肝脏再生的机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

斑马鱼的饲养和繁殖均按照标准操作程序进行。实验已获得布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（2016N000405）的批准。成年斑马鱼在实验开始前禁食24小时。系统水指水产养殖设施中斑马鱼饲养箱内的水。

1. 准备与麻醉

  1. 在系统水中配制0.016%的Tricaine溶液。
    注意：Tricaine若接触眼睛、皮肤或呼吸道，可能引起刺激。
  2. 准备一块海绵，用于在解剖过程中固定麻醉后的斑马鱼。将一整块海绵切成四等份。使用剃刀刀片，沿海绵块四分之一部分的长轴方向切去一条薄楔形部分。
    1. 切口应足够长以容纳成年斑马鱼（具体长度因鱼体大小而异）。例如，对于体长35 mm的成年鱼，切口长度应为20 mm。鱼的头部和身体被紧密固定在海绵中，而尾部则伸出海绵边缘（图1B）。
  3. 将海绵浸泡在0.016%的Tricaine溶液中。
  4. 将成年斑马鱼（雄性或雌性均可）放入625 mL的0.016% Tricaine溶液中。
  5. 孵育6分钟，或直至鱼对触碰无反应。
  6. 用镊子小心地将鱼从Tricaine溶液中取出，并将其腹面朝上放置于海绵的凹槽中（图1A - B）。
  7. 将海绵置于体视显微镜下，并使用自上而下的照明。

2. 手术

  1. 使用精细镊子在心脏后方中线位置夹住皮肤和鳞片（图1B）。
  2. 使用弹簧剪刀在镊子下方剪开，于体腔上造孔（图1C - D）。注意避免损伤心脏或主要血管，否则将导致死亡率升高。
  3. 使用弹簧剪刀沿腹部做3-4 mm切口，向后延伸直至切口到达腹鳍（图1D - E）。此时，肝脏的腹叶可能已通过切口可见。
  4. 单手挤压海绵两侧，使内脏器官从体腔中挤出。此时肝脏腹叶将位于肠管上方（图1F，2A-B）。肝脏呈粉红色或橙色，覆盖于金褐色的肠管表面。被指定为假手术对照组的动物在此步骤后即进行恢复处理。
  5. 闭合精细镊子，使两镊尖相互接触。在保持对海绵压力的同时，将精细镊子的镊尖插入肝脏与肠管之间（图1G）。注意避免刺破肠管，否则将导致死亡率升高。
  6. 缓慢放松镊子压力，使两镊尖逐渐分开（图1H）。该滑动操作可切断肝脏腹叶与肠管之间的多条门静脉连接（图2B），是完整分离肝脏腹叶所必需的步骤。重复此操作，直至肝脏与肠管之间的所有门静脉连接均被切断。
  7. 使用精细镊子将肝脏腹叶从肠管上剥离，并将其与肝脏其余部分分离（图1I）。
  8. 该操作可实现约三分之一的肝部分切除术（图1J）。

3. 恢复

  1. 小心地将鱼从海绵上取下，并放入装有系统水的水族箱中。
  2. 用移液器将系统水缓慢滴加至鳃部数分钟，直至鱼能够自主游动（图1K）。
  3. 手术后将鱼观察2–4小时后再放回系统中。手术后24小时内不得喂食。
  4. 在整个实验期间每日观察鱼的状态。
  5. 随着时间推移，体壁上的切口会自然愈合，无需缝合（图 1L，2C）。

4. 腹叶与肠道长度分析

  1. 将所有用于分析的动物置于冰水中处死，持续10分钟，直至所有鳃盖运动完全停止。
  2. 将鱼从冰水中取出，腹面朝上放置于海绵的凹槽中。
  3. 使用弹簧剪刀，在心脏所在前后位置的腹壁处做一切口，然后沿前后轴方向从该切口向腹鳍方向再做两个切口。（图2A）。
  4. 掀开皮肤和肌肉，暴露内脏器官（图2A）。
  5. 使用落射荧光显微镜获取内脏器官的明场和荧光图像。该视野应包含腹叶被切除的区域。由于动物在分析前已被处死，因此此类分析无法实现对同一条鱼的长期成像观察。

5. 肝脏与体重比值分析

  1. 将所有用于分析的动物置于冰水中安乐死，持续10分钟，直至所有鳃盖运动完全停止。
  2. 将鱼放入一个50 mL的锥形管中。
  3. 向管中加入25 mL含4%多聚甲醛、1×PBS和0.3%吐温的溶液。
    注意：甲醛具有毒性，含甲醛的溶液必须始终在化学通风橱中操作。
  4. 在4 °C下振荡固定48小时。
  5. 用1×PBS加0.3%吐温溶液进行四次洗涤，每次10分钟。
  6. 用镊子取出鱼，用纸巾吸干表面液体。
  7. 记录整条鱼的重量。
  8. 使用弹簧剪刀，在心脏所对应的前后位置处沿腹部体壁做一切口，然后从该切口沿前后轴方向继续做两个切口，一直延伸至腹鳍处。（图2A）。
  9. 掀开皮肤和肌肉组织，暴露内脏器官（图2A）。
  10. 使用落射荧光显微镜拍摄肝脏的明场图像。
  11. 解剖取出肝脏，并将肝脏组织置于称量舟中。
  12. 记录肝脏的重量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了研究成年斑马鱼肝脏的再生潜能，我们在成年斑马鱼中进行了部分肝切除术（PHX）。通常选择体型较大的成年鱼（体长30-40 mm），年龄范围为1.5-2.5年。在单次实验中，所用个体均来自同一水箱，并在年龄和体型上相匹配。作为合适的对照，我们采用了假手术组，即对动物进行麻醉并在腹壁做大切口，但不切除任何组织即进行恢复。假手术组中雄性和雌性斑马鱼的存活率均在90%-100%之间。PHX组动物的存活率在雄性斑马鱼中为60%-75%，在雌性斑马鱼中为60%-90%，所有死亡均发生在手术后24小时内。

评估肝部分切除术（PHX）后肝脏再生恢复的金标准是肝脏与体重比（LBR）。该检测方法已用于哺乳动物11和斑马鱼模型8中肝脏质量恢复的测量。为可靠地定量肝脏重量，我们如前所述8对固定处理的动物进行了称重。我们在野生型、未受损伤的斑马鱼中进行了LBR测定，发现与既往报道一致8，雌性斑马鱼的LBR几乎是雄性斑...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

斑马鱼与哺乳动物在肝脏再生模型上的解剖学差异为肝脏切除手术带来了独特的挑战。斑马鱼的肝脏紧邻心脏和肠道，若不慎损伤其中任一器官，将导致死亡率升高。斑马鱼的肝脏无包膜包裹，因此更难以与肠道分离。肝脏通过门静脉接收来自肠道的富含营养的血液。在哺乳动物中，离开肠道的静脉汇集成一条主要的门静脉，随后在进入肝脏时分支12相比之下，斑马鱼的肝脏通过一系列微小血管直接从肠道接收门脉循环血液进入肝脏（图2B因此，肝脏的每个叶在展开并覆盖于肠道上时，均通过这些血管牢固地附着于肠道。若在切断门静脉之前尝试切除腹侧叶，往往会导致切除不完全（数据未显示）。一些早期方案描述通过相对较小的切口将腹侧叶拉出，但这种方法无法切断这些门静脉连接。5,6.

本文所述方案旨在解决这些挑战，以实现稳定地切除腹侧叶。将麻醉后的斑马鱼紧密地放置在海绵的凹槽中，以保持其鳃部湿润，并在手术过程中固定身体。在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

I.M.O. 由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA）资助（项目编号：F32AA027135）。W.G. 由以下项目资助：R01DK090311、R01DK105198、R24OD017870，以及 Claudia Adams Barr 癌症研究卓越计划。W.G. 是生物医学科学 Pew 学者。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛水溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences15700
50 mL Falcon 离心管，聚丙烯材质，无菌Corning352098
AS 82/220.R2 PLUS 分析天平Bay State Scale & Systems, INC.WL-104-1051
Dumont #55 镊子Fine Science Tools11295-51
EMS Kuehne 盖玻片/样本镊子Electron Microscopy Sciences72997-07
落射荧光显微镜ZeissDiscovery.V8
Mastertop 纤维素清洁海绵AmazonB07CBSM53Z
PBS 10X 液体浓缩液 4LEMD Millipore6505-4L
超细微型剪刀，3 1/4" 直头Biomedical Research Instruments11-1020
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）SyndelTRIC-M-GR-0010
吐温 20，Fisher BioReagentsFischer ScientificBP337-500

参考文献

  1. Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
  2. Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
  3. Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
  4. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  5. Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
  6. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
  7. Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
  8. Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
  9. Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
  10. Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979(2015).
  11. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
  12. Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

肝脏再生斑马鱼模型肝腹叶切除肝脏与体重比荧光显微镜解剖显微镜遗传工具肝病
成年斑马鱼的部分肝切除术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。