成年斑马鱼的部分肝切除术

摘要

本方案描述了在成年斑马鱼中切除肝脏腹叶以研究肝脏再生的过程。

摘要

肝衰竭是全球主要的死亡原因之一，美国慢性肝病导致的死亡率正在急剧上升。健康的肝脏能够从毒性损伤中再生，但在晚期肝病中，肝脏的自然再生能力会受到损害。斑马鱼已成为研究再生的有力实验体系。它们是研究部分肝切除后肝脏再生的理想模型，部分肝切除是一种具有直接临床相关性的手术，即外科切除部分肝脏而保留其余部分完整。目前尚无部分肝切除的标准操作流程；以往使用该模型的研究采用了略有不同的方案，并报告了不同的结果。本文描述了一种在成年斑马鱼中实施部分肝切除的高效且可重复的方案。我们利用该技术证明，斑马鱼能够对被切除的肝叶进行表型再生。该方案可用于进一步探究斑马鱼肝脏再生所需的机制。

引言

在人体的实质性器官中，肝脏是唯一具有再生能力的器官¹。这一点至关重要，因为肝脏是一个关键器官，负责重要的代谢功能、能量储存、血液解毒、血浆蛋白分泌以及胆汁生成²。因毒性或炎症损伤而丢失的肝细胞主要通过剩余肝细胞的分裂来补充¹。研究肝脏再生的一个经典实验模型是部分肝切除术，即切除肝脏的个别叶，而保留其余肝叶完整³。该手术最初在大鼠中建立，其中约切除肝脏总质量的三分之二。在哺乳动物中进行部分肝切除术后，剩余肝叶会发生代偿性再生，直至肝脏恢复其初始质量。值得注意的是，哺乳动物的肝脏并不会重新生成缺失的肝叶。

斑马鱼（Danio rerio）是研究成体器官再生的可行模型⁴。尽管斑马鱼肝脏在结构上与哺乳动物肝脏不同，但其由相同类型的细胞组成，并发挥与哺乳动物相似的功能²。斑马鱼肝脏由三个叶组成，包括两个背侧叶和一个沿肠道扁平分布的单一腹侧叶。此前已在斑马鱼中实施过部分肝切除术，但关于其确切再生模式的研究结果存在争议。通常通过完全切除整个腹侧叶来实现约三分之一的部分肝切除。早期研究报告称，在切除腹侧叶后，该叶可在一周内完全再生^5,....

方案

斑马鱼的饲养和繁殖均按照标准操作程序进行。实验已获得布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（2016N000405）的批准。成年斑马鱼在实验开始前禁食24小时。系统水指水产养殖设施中斑马鱼饲养箱内的水。

1. 准备与麻醉

1. 在系统水中配制0.016%的Tricaine溶液。
   注意：Tricaine若接触眼睛、皮肤或呼吸道，可能引起刺激。
2. 准备一块海绵，用于在解剖过程中固定麻醉后的斑马鱼。将一整块海绵切成四等份。使用剃刀刀片，沿海绵块四分之一部分的长轴方向切去一条薄楔形部分。
   1. 切口应足够长以容纳成年斑马鱼（具体长度因鱼体大小而异）。例如，对于体长35 mm的成年鱼，切口长度应为20 mm。鱼的头部和身体被紧密固定在海绵中，而尾部则伸出海绵边缘（图1B）。
3. 将海绵浸泡在0.016%的Tricaine溶液中。
4. 将成年斑马鱼（雄性或雌性均可）放入625 mL的0.016% Tricaine溶液中。
5. 孵育6分钟，或直至鱼对触碰无反应。
6. 用镊子小心地将鱼从Tricaine溶液中取出，并将其腹面朝上放置于海绵的凹槽中（图1A - B）。

结果

为了研究成年斑马鱼肝脏的再生潜能，我们在成年斑马鱼中进行了部分肝切除术（PHX）。通常选择体型较大的成年鱼（体长30-40 mm），年龄范围为1.5-2.5年。在单次实验中，所用个体均来自同一水箱，并在年龄和体型上相匹配。作为合适的对照，我们采用了假手术组，即对动物进行麻醉并在腹壁做大切口，但不切除任何组织即进行恢复。假手术组中雄性和雌性斑马鱼的存活率均在90%-100%之间。PHX组动物的存活率在雄性斑马鱼中为60%-75%，在雌性斑马鱼中为60%-90%，所有死亡均发生在手术后24小时内。

评估肝部分切除术（PHX）后肝脏再生恢复的金标准是肝脏与体重比（LBR）。该检测方法已用于哺乳动物¹¹和斑马鱼模型⁸中肝脏质量恢复的测量。为可靠地定量肝脏重量，我们如前所述⁸对固定处理的动物进行了称重。我们在野生型、未受损伤的斑马鱼中进行了LBR测定，发现与既往报道一致⁸，雌性斑马鱼的LBR几乎是雄性斑.......

讨论

斑马鱼与哺乳动物在肝脏再生模型上的解剖学差异为肝脏切除手术带来了独特的挑战。斑马鱼的肝脏紧邻心脏和肠道，若不慎损伤其中任一器官，将导致死亡率升高。斑马鱼的肝脏无包膜包裹，因此更难以与肠道分离。肝脏通过门静脉接收来自肠道的富含营养的血液。在哺乳动物中，离开肠道的静脉汇集成一条主要的门静脉，随后在进入肝脏时分支¹²相比之下，斑马鱼的肝脏通过一系列微小血管直接从肠道接收门脉循环血液进入肝脏（图2B因此，肝脏的每个叶在展开并覆盖于肠道上时，均通过这些血管牢固地附着于肠道。若在切断门静脉之前尝试切除腹侧叶，往往会导致切除不完全（数据未显示）。一些早期方案描述通过相对较小的切口将腹侧叶拉出，但这种方法无法切断这些门静脉连接。^5,6.

本文所述方案旨在解决这些挑战，以实现稳定地切除腹侧叶。将麻醉后的斑马鱼紧密地放置在海绵的凹槽中，以保持其鳃部湿润，并在手术过程中固定身体。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon 离心管，聚丙烯材质，无菌	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS 分析天平	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 镊子	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne 盖玻片/样本镊子	Electron Microscopy Sciences	72997-07
落射荧光显微镜	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop 纤维素清洁海绵	Amazon	B07CBSM53Z
PBS 10X 液体浓缩液 4L	EMD Millipore	6505-4L
超细微型剪刀，3 1/4" 直头	Biomedical Research Instruments	11-1020
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）	Syndel	TRIC-M-GR-0010
吐温 20，Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500