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使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

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DOI：

10.3791/62350

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2021年8月5日

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1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

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摘要

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。

摘要

本文介绍了一种从浸入式冷冻网格制备冷冻薄片的方案 恶性疟原虫-感染的 人红细胞，该方法可轻松适用于其他生物样本。制备样品、切削及观察薄片的基本原理适用于所有仪器，本方案可作为冷冻电镜（cryoEM）和冷冻电子断层扫描（cryoET）中载网原位冷冻薄片制备的通用指南。承载细胞的电镜载网通过手动或自动冷冻仪浸入液氮冷却的液态乙烷中进行速冻，随后在配备冷冻台的光学显微镜下进行筛选。冷冻后的载网转移至配备聚焦离子束（cryoFIB-SEM）的冷冻扫描电子显微镜中。在切削前，载网通常需进行溅射镀膜，以帮助消除切削过程中积累的电荷。 alternatively，可使用电子束旋转镀膜仪在载网上沉积一层碳-铂，其厚度可更精确地控制。进入cryoFIB-SEM后，通过气体注入系统（GIS）在载网表面沉积一层有机铂化合物。该涂层可保护薄片前缘在切削过程中的完整性，这对获得厚度均匀的薄片至关重要。通过扫描电镜（SEM）识别感兴趣区域，并逐步进行离子束切削，在薄片接近电子透明时逐步降低离子束电流，以避免产生过多热量。制备有多片薄片的载网随后在低温条件下转移至透射电子显微镜（TEM）中进行倾转系列图像采集。稳定且无污染的薄片制备流程是细胞冷冻电镜、冷冻电子断层扫描及亚断层平均等下游技术的关键前提。目前领域内高度优先的发展方向包括针对高压冷冻样本的拾取与切削技术的优化与完善。

引言

只有厚度 <500 nm 的生物样品的细胞内容物，才能在低温条件下通过透射电子显微镜（TEM）进行有效成像，这限制了可观察样本的范围，仅限于病毒、原核生物、简单的单细胞生物以及较大真核细胞的较薄区域1。在载网上进行的聚焦离子束（FIB）铣削技术，可将较厚的速冻生物样品在低温条件下（< -150 °C）减薄至电子透明的薄片。所得薄片随后被转移至透射电子显微镜中进行观察和断层数据采集，从而实现对细胞内细胞结构和分子特征的高分辨率三维重构（相关综述见 Rigort 等，20122；Oikonomou 等，20163；Wagner 等，20204）。

聚焦离子束（FIB）铣削技术源于材料科学领域，该领域通常对样品进行减薄处理以用于后续分析5。该技术在扫描电子显微镜（SEM）中进行，该显微镜具有两个光学柱：一个是常规的扫描电子显微镜光学系统，另一个则包含能够生成并精确控制聚焦离子束（FIB）的光学系统，此类设备称为FIB-SEM。通过镓离子源产生的离子束可对样品的特定区域进行消融，去除多余材料，从而留下一片薄片（lamella）6。铣削过程由SEM对样品表面形貌的成像进行引导，用于定位感兴趣区域并实时监控铣削进展。在生物学应用中，基本装置大体相同，但铣削需在低温条件下进行。这要求标准FIB-SEM配备可维持恒定低温且表面污染率低的低温冷却台，以及配备气闸以实现无需玻璃化破坏或污染的样品转移。样品载具也已改进，以便在cryoFIB-SEM内安装多种不同类型的载体，包括透射电镜（TEM）载网、冷冻板（planchettes）和毛细管。多个研究团队在这些方法的发展及该领域持续的技术进步中发挥了核心作用7,8,9,10,11,12。目前，适用于生物样品的低温FIB铣削商业解决方案已更加普及，对于优化后的样品，载网上直接铣削薄片正变得日益常规化。

一系列室温与冷冻电镜（cryoEM）技术可用于在生命的所有尺度上可视化细胞信息，从低分辨率下观察完整的多细胞生物体，到在细胞水平上理解复杂过程的背景，乃至更精细地解析原位（in situ）分子结构13,14,15,16,17,18,19。传统的室温技术包括对固定、染色并包埋于树脂中的细胞和组织进行超薄切片（ultramicrotomy），随后通过透射电子显微镜（TEM）分析其细胞形态（综述见 Studer 等，200820）。另一种技术则利用扫描电子显微镜（SEM）检测二次电子散射，对保存的细胞块表面成像，并通过刀片（连续块面成像）或聚焦离子束逐步去除材料21,22,23。该技术也已成功应用于低温条件（称为冷冻体积成像，cryo-volume imaging），使用cryoFIB-SEM对玻璃态、未染色的细胞或组织块进行成像24。此外，也可制备较厚的薄片（约15 µm厚），并通过扫描透射电子显微镜（STEM）成像进行研究25。利用这些技术，可对包含多个细胞的整块样品成像以获取群体信息，或对整个器官/生物体进行三维成像与重建。然而，若要从细胞中获取高分辨率的分子信息，样品必须以接近天然状态的冷冻水合形式保存，因此需在低温条件下制备。玻璃态切片冷冻电子显微术（CEMOVIS）是一种在低温条件下使用超薄切片机对高压冷冻的生物样品进行切片的技术。该方法可产生厚度为40–100 nm的冷冻切片带26，将其附着于电镜载网上并在TEM中成像。然而，刀片与玻璃态样品的物理相互作用会导致裂隙和压缩伪影，严重扭曲细胞结构27,28,29,30。较厚的切片更容易出现此类伪影，因此使用超过约70 nm的切片在实践中不可行26。这一限制极大影响了断层成像（tomogram）中生物结构的三维视图。低温聚焦离子束（FIB）铣削不会出现上述问题，但会产生因样品不同区域铣削速率差异导致的伪影，造成薄片内部厚度不均，即“帘状效应”（curtaining）。该问题可通过气体注入系统（GIS）施加有机铂涂层来缓解，该涂层可在铣削过程中保护薄片前缘31。载网上FIB铣削的样品厚度上限取决于将样品快速冷冻同时保持其玻璃态的能力32。然而，随着冷冻提取技术（cryo lift-out）及适用于生物样品的改良样品载体的引入，FIB铣削也可用于处理高压冷冻样品31,33,34,35。此外，快速冷冻的样品也不能过薄，因为必须有足够的生物材料以形成尺寸合理的薄片，从而提供足够的表面积用于在所需放大倍数下采集倾转系列图像（tilt-series）。该问题可通过铣削较小细胞（如细菌或酵母）的聚集体来缓解。最终薄片的厚度（约100–300 nm）通常由样品完整性及铣削策略决定。较薄的薄片更适合高分辨率结构研究（如亚断层平均化），而较厚的薄片则能在接近天然保存状态的样品中包含更大的细胞体积，从而提供更丰富的细胞背景信息。FIB铣削还可用于减薄快速冷冻的蛋白质晶体，以进行电子衍射研究36。

如果科学问题需要对近天然状态的样本进行高分辨率分子细节分析，则对玻璃态细胞进行聚焦离子束铣削是值得投入时间和精力的 原位。随着更多设施可用于常规制备薄片样品，限制速率的步骤通常是铣削前的样品优化，需要花费时间确保样品处于玻璃态并具有合适的厚度，以制备出坚固且厚度均匀的薄片。本文所述为聚焦离子束铣削制备 plunge-frozen 感染疟原虫的人类红细胞样品的优化方法 恶性疟原虫 疟原虫是疟疾的致病因子，但该方法可适用于任何给定样本。

方案

人血通过英国国家血液与移植服务机构从匿名捐赠者处获取，并在收到后两周内使用。使用此类血液无需伦理审批。

1. 样品制备与冷冻投入  恶性疟原虫  感染的红细胞

  1. 通过离心（1,580 x g）分离成熟的裂殖体 g) 在70%（v/v）等渗密度梯度培养基上方（关于培养3D7无性血阶段的标准操作步骤 恶性疟原虫 在人红细胞中，参见 Blackman M.J., 199537).
  2. 用100%甲醇固定载玻片上的空气干燥薄血膜，以在使用6.7 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.1）配制的10%吉姆萨染液染色前，检查裂殖体的形态均一性。
    注意：为了富集停滞在特定裂解阶段的裂殖体，可进一步使用化合物2和E64抑制剂对裂殖体进行同步化处理（参见 代表性结果 和 图1 有关这些抑制剂作用的解释）。
    警告： 恶性疟原虫 是一种人类病原体，必须在符合当地健康与安全规范的适当 containment 设施中操作。
  3. 轻轻离心裂殖体（240 × g） g) 离心沉淀细胞，然后用相当于细胞沉淀体积2倍的RPMI培养基重悬，得到50%红细胞比容的细胞悬液。
  4. 在手动冷冻固定装置上，取2.5 μL裂殖子悬液滴加至经辉光放电处理的（使用辉光放电仪，参数设置为：空气环境中30 mA，60 s，仅处理载网的碳膜面）200目铜载网的碳膜面，该载网为具有2/4型穿孔碳膜的载网。用带有撕边的1号滤纸从载网背面吸附约20 s。迅速浸入液氮冷却的液态乙烷中进行冷冻，随后将载网转移至储存容器中（见 材料表 用于本研究的设备）。
    注意：实验可在此处暂停，载网可无限期地保存在液氮中。
    警告：液氮具有窒息性，可导致冻伤；须在配备氧气监测的适宜环境中小心操作。
    警告：液态乙烷会引起严重灼伤，且具有可燃性；应在通风橱中使用，并远离点火源。
    注意：经浸入式冷冻的裂殖体已无活性。该结论基于将若干载有空气解冻后浸入式冷冻裂殖体的金网格与人血共同孵育，数日后未观察到寄生虫生长，而未冷冻的对照组则有生长。因此，裂殖体冷冻载网在非密闭设施中操作时是安全的，只需采用常规的安全与去污染程序（如佩戴手套，使用70%乙醇或次氯酸钠溶液对表面和工具进行消毒）。 >70% 乙醇及载网的处理 >70% 乙醇
  5. 使用光学显微镜的冷冻载台筛选载网，特别注意冰层在载网上的厚度梯度。在较薄的冰区，检查各个载网方格中的细胞覆盖情况。
    ​注意：最佳的方格应为在网格方格中心处单层细胞厚度图2）。这可以确保在方格中心切削薄片时，不会触及网格条边缘处较厚的冰层。实验可在此暂停，载网可无限期地保存在液氮中。如果细胞带有荧光标记，也可通过冷冻关联显微镜（cryoCLEM）对载网进行筛选，以定位感兴趣的X/Y位置，并将这些位置与冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryoFIB-SEM）中的载网位置相关联，从而指导切削操作。

2. 冷冻浸入细胞的网格内聚焦离子束铣削

  1. 使用黑色永久性记号笔在专用于冷冻FIB的自动网格环的正面标记，以指示切口部分的中心位置及环的对侧位置图3）。设置剪切工作站，将载网网格剪切到已标记的载网环中，碳膜面朝下。
  2. 将载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）样品 shuttle 中（通常为 2 个载网，取决于 shuttle 类型），碳膜面朝上，并在氩气环境中进行铂溅射镀膜（5 × 10⁻³ mbar，厚度约 20–30 nm）。-2 mbar）（5 mA，60 s——厚度可变）或对细胞表面进行碳/铂电子束旋转镀膜（约4 nm厚度）。
    注意：两种涂层均有助于在扫描电镜成像过程中分散电荷。电子束旋转镀膜仪的优点在于可精确设定涂层的厚度。
  3. 将载样穿梭盒装入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM），在5 kV（13 pA或25 pA）条件下通过扫描电镜观察每张载网上的细胞分布情况。先获取低倍率概览图像（约100倍），检查载网上的冰层梯度。随后获取较高倍率图像（约5,000倍），观察单个载网方格，识别出具有明显细胞结构且表面污染较少的区域，用于后续切削加工。
  4. 应用 >使用气体注入系统（GIS）在每张载网表面沉积2 µm的有机铂涂层。操作时，将GIS针头插入载网上方的腔室中，将有机铂源加热至设定温度并保持一定时间（例如，约27 °C下持续3–10 s），以产生蒸气流。
    注意：通过 GIS 针对样品施加有机铂镀层的角度、温度和时间应优化，以实现均匀镀层。具体参数取决于所使用的 cryoFIB-SEM 型号（参见 代表性结果 如需进一步说明）。
  5. 将样品倾斜，使载网平面与离子束入射角成约10°，并移动合适网格方格的中心，使其在扫描电镜（SEM）和聚焦离子束（FIB）图像中均可见。
  6. 使用离子束在低电流（标称值为 1.5 pA，30 kV）下扫描网格，并放大至足够高的倍数（约 7,000 倍），以观察位于网格方格中心的细胞。在第一铣削电流（300 pA）下将样品调至聚焦状态，并校正像散。调节亮度与对比度，然后标记出两个用于铣削的矩形区域，分别位于一个厚度为 3 µm 的受保护区域的上方和下方，该受保护区域的中心即为目标薄片的最终位置。
    注意：所选图案的宽度取决于周围细胞层的形貌和细胞大小。对于裂殖体而言，7–20 µm 是合适的宽度，但较宽的薄片需要更长的铣削时间。第一次铣削步骤中所选图案的高度取决于样品厚度，起始值约为 6 µm；该参数在铣削过程中可能需要调整。铣削从图案的外侧上下边缘朝薄片表面方向进行。此过程可并行或顺序完成：并行指两个图案同时铣削；顺序指先去除薄片上方的材料，再去除下方的材料。
  7. 以初始电流开始研磨；在离子束视图中实时监测进展，并间歇性地通过扫描电镜（5 kV，13 或 25 pA）进行观察。检查离子束是否已穿透保护区域上下方的样品。若未穿透，增加矩形图案的高度以去除更多材料。当离子束视图中薄片上下表面完全光滑时，停止研磨。
    注意：当矩形图案内部在焦平面上无任何特征时，表明离子束已在保护区域的上下方穿透样品。某些特征（如网格条）可能在背景中失焦可见。
  8. 切换至下一个铣削电流（100 pA）；调整焦距并优化亮度/对比度。将两个矩形图案之间的间距减小至1.5 µm，并降低图案高度，使其仅覆盖未铣削的材料区域。在新电流下开始铣削，直至薄片上下表面完全平整。
  9. 逐步重复此过程，直至达到 0.3 µm 的厚度，每次根据铣削方案逐步降低离子束电流。 表1.
  10. 在一张或两张网格上铣削多个薄层（数量取决于样品厚度和可用时间），厚度约为0.3 µm，记录每个薄层的X/Y/Z位置，并在会话结束前预留约1–2小时，将薄层抛光至最终厚度（60–200 nm）。
  11. 对整个载网进行低倍率扫描电镜概览，规划一个从载网前端（靠近离子束源一侧）的薄片到载网后端（远离离子束源一侧）的薄片的抛光路径（图5).
    注意：这可以减少消融材料重新沉积到抛光薄片表面的现象。
  12. 将两个矩形图案之间的间距减小至100–200 nm，并在离子束电流为30 pA的条件下开始最终抛光步骤。使用扫描电子显微镜（SEM）在2–3 kV（13 pA，停留时间 = 300 n，3072 × 2048，全帧约2 s）下监测进展，当薄片在SEM中对比度消失，或薄片本身的有机铂涂层开始失去完整性时，停止抛光。
  13. 在取出载网之前，先对整个载网采集低倍SEM图像，并保存每片薄片的图像，以便后续在TEM中对照载网时使用。在此暂停实验，将带有薄片的载网小心地保存在液氮中。
    ​注意：从冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryoFIB-SEM）中取出后，载网可进行轻微溅射镀膜，有助于在高倍透射电镜（TEM）观察时减少漂移和电荷积累。但应谨慎操作，过度溅射镀膜可能遮蔽薄片内部的生物结构。此阶段可对薄片进行荧光筛选，但能否获得足够信号取决于薄片厚度内标记蛋白的丰度。操作载网时须格外小心，以避免薄片损伤和表面污染。

3. 倾斜系列图像采集及数据处理总体概述

  1. 将载网装入透射电子显微镜，使铣削方向与样品台的倾斜轴垂直对齐。
    注意：通过肉眼观察自动网格边缘的标记来对齐网格。允许约10°的误差范围，否则在倾斜网格时，薄层两侧的沟槽壁可能会遮挡薄层。
  2. 获取整个载网的低倍率图像（约150倍），定位薄片区域；然后对每个薄片获取中等倍率图像（约1,500倍，根据薄片大小调整），并定位感兴趣区域。
  3. 将载网预倾 ±10°，使薄层平面（而非载网）垂直于光轴
    注意：预倾方向可通过低倍和中倍率图像中薄层前缘的位置（寻找残留的有机铂涂层）来确定。对于本实验所用的透射电镜，载网需要 若片层前缘指向，则具有+10°预倾角 在图谱中上升并需要 指向时具有 -10° 的预倾角 向下。每个网格可能因拾取和插入自动进样器的方式不同而有所差异。
  4. 获取剂量对称的倾斜系列图像38 （例如，倾斜角度范围为 -54° 到 +54°，增量为 3–5°），像素尺寸应能同时满足感兴趣区域所需的视场和分辨率。使用 -2 至 -5 µm 之间的欠焦值范围。每个角度增量采集 3–10 帧的电影图像，并根据像素尺寸调整这些参数，使总电子剂量累积约为 150 e⁻/Ų。-/Å2 （适用于300 kV透射电子显微镜）。
    注意：应避免薄片出现裂纹，因为这些区域可能发生漂移。还应避免表面污染，因为它可能遮蔽感兴趣区域或高倾角下的聚焦区域。
  5. 使用 MotionCor2 等程序对电影文件进行运动校正39. 对校正后的图像（累积的 e）应用剂量加权滤波器-/image)40 并使用诸如 CTFFIND4 之类的程序估计每幅图像的离焦量41.
  6. 使用无标志点对齐（图像块追踪）方法，在 etomo（IMOD）等程序中进行42 用于计算倾斜系列图像中的图像对齐和角度关系。
  7. 输入对齐和旋转信息以及离焦值到能够进行三维CTF校正的程序中，例如 NovaCTF43计算校正后的断层图像，以获得适用于下游分析的、具有相应合并像素（binning）因子的输出断层图像。
  8. 分析重建结果，并为后续处理做好准备，例如过滤、分割或子断层平均。

结果

用于冷冻固定P. falciparum裂殖体的制备
使用化合物2（Compound 2）和E64抑制剂可将裂殖体阻滞在逸出过程的不同阶段，从而富集裂殖体群体，便于后续研究。这一点至关重要，因为在缺乏互补性相关技术的情况下，对特定亚细胞结构或细胞类型进行聚焦离子束切割（milling）具有挑战性，因为该过程本质上是盲性的。化合物2是一种蛋白激酶抑制剂，可将逸出过程阻滞在液泡破裂之前。裂殖体可在含化合物2的培养基中同步化培养4小时，随后用不含化合物2的培养基洗涤以去除抑制剂，此时裂殖体将在约30分钟后继续成熟并逸出。或者，经化合物2同步化的裂殖体可洗涤后转入含E64的培养基中——E64是一种不可逆的广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂——孵育约1小时，以将逸出过程阻滞在液泡破裂之后、但宿主细胞破裂之前的阶段。在进行冷冻固定前，应通过吉姆萨染色血涂片检查处理后裂殖体的形态和均一性（图1）。本研究中所述方法可用于将处于上述任一状态的裂殖体进行快速冷冻固定。

疟原虫裂殖子示意图与显微镜图像；红细胞侵入过程，寄生泡。
图 1：通过吉姆萨染色血涂片观察化合物 2 和 E64 阻滞的 P. falciparum 裂殖体的形态学特征。（A）在化合物 2 存在下，寄生泡（PV）内密集排列着裂殖子（紫色圆圈），并含有一个血红素晶体簇（深棕色圆圈）。PV 与宿主红细胞（hRBC）内血红蛋白（灰色区域）之间的边界清晰，红细胞膜也清晰可见。（B）在 E64 存在下，PV 膜破裂，裂殖子在 hRBC 内散开。每个裂殖体仍含有一个血红素晶体簇。宿主细胞膜出现渗漏并部分塌陷，因此细胞周边无可见血红蛋白，且 hRBC 膜边界不易辨识。比例尺：5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻固定条件的优化
在优化P. falciparum感染红细胞的 blotting 条件过程中，测试了多种不同孔径的载网，包括金和铜制200目载网上带有2/2、3/3、3.5/1和5/2（方形）孔状碳膜的载网。带有2/4孔状碳膜的200目铜定位载网可形成足够厚度的细胞层，用于铣削较长的玻璃态薄片。孔径过大或过小通常会导致细胞层分别过薄或过厚（图2A-C）。使用2/4孔状碳膜时，通过从载网背面（无碳膜面）进行blotting，可使裂殖子被拉过2 µm的孔，从而使细胞突出于碳膜上下两侧。孔间4 µm的碳膜延伸部分会在大多数最终获得的薄片中央形成一条连续的碳带，增强结构强度。定位载网最适用于关联成像和筛选目的44，但需注意确保网格设计中的数字/字母不宜过大，以免阻碍铣削区域。

使用手动冲压装置进行 blotting 的时间约为 20 秒，但停止 blotting 的确切时机需通过肉眼判断，即当从载网中被吸出的液滴在滤纸上不再扩散时即停止。需要利用滤纸的撕裂边缘破坏液滴的表面张力，以启动 blotting 过程。本研究未使用自动冷冻装置，但对于该样品，合理的起始条件是采用与手动冲压装置相同的细胞体积和载网类型，并确保在高湿度（约 70%）和室温（约 25 °C）条件下从载网背面进行 blotting。具体的 blotting 时间和条件需根据所使用的特定自动化系统进行优化。

P. falciparum 裂殖子的急速冷冻载网使用配备低温载物台的光学显微镜进行筛选，而非透射电子显微镜（TEM），因为该样品无法透射电子。对于较薄的样品，可在将样品转移至冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryoFIB-SEM）之前，先通过TEM（全载网约150倍放大）进行筛选，这可能是使用国家级设施的前提要求。应特别注意载网上冰层厚度的梯度变化，以及各个载网方格内部的冰层差异。理想的载网方格应仅含单层细胞，或细胞位于碳膜的中央（图2C）。这样可避免在载网方格边缘栅条周围的较厚冰层中进行铣削，并确保离子束能在细胞层上下完全穿透，从而获得游离的薄片（lamella），而非楔形结构。一旦优化了可重复的 blotting 和急速冷冻条件，在FIB铣削前通常不再需要进行筛选。

冷冻电子断层成像、细胞结构显微图像、样品载网细节、实验设置。
图 2。通过冷冻光学显微镜分析浸入式冷冻的P. falciparum裂殖体在载网上的细胞分布情况。（A）通过冷冻光学显微镜观察到载网方格中冰层过厚的示例，导致细胞和碳膜难以分辨。比例尺，10 µm。（B）孔径过大（300目铜网，5/2方形多孔碳膜）导致细胞无法有效附着的示例，结果形成极薄的生物材料层，周围为无冰的空区域。此类载网会产生非常短且不稳定的薄片。比例尺，10 µm。（C）在200目铜网上使用2/4多孔碳膜时细胞分布良好的示例。这些裂殖体经E64抑制剂处理。大细胞（红框，直径约5 µm）具有清晰边界，为仍保留完整空泡膜的感染性红细胞。小细胞簇（蓝框，约1 µm）为包含在部分塌陷的宿主红细胞内的单个裂殖子。每个裂殖体中心均有一个黑点，代表疟色素晶体的位置（详见图 1）。此类形态差异在进入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）后较难分辨，因此在建立可重复的 blotting 条件前，通过冷冻光学显微镜进行预筛是十分有益的。靠近载网条边沿区域的细胞覆盖层（白色虚线区域）过厚，不适合切削。载网方格中心较薄的区域（黄色虚线区域）是理想的切削位置，可将薄片延伸至周围细胞层中。比例尺，6 µm。（D）专用于cryoFIB的自动载网边缘图像，带有两个黑点标记，分别位于切口区域（黑色方括号）内及相对位置的12点和6点方向。黑色箭头表示切削方向。（E）当载网装入自动进样器卡匣时，两个标记需对称分布于加载镊子两侧，以确保所形成的薄片垂直于样品台的倾斜轴。 请点击此处查看该图的高清版本。

用于断层扫描的冷冻聚焦离子束专用自动网格边缘标记
通常，在铣削前将载网夹入自动网格边缘，以方便操作并提供刚性，从而在后续转移步骤中保护薄片免受损伤。专为冷冻聚焦离子束设计的自动网格边缘具有切口结构，以便在铣削过程中更充分地接触网格表面。必须将铣削方向定向为垂直于透射电子显微镜（TEM）的倾斜轴，使薄片在采集倾转系列图像时沿其长度方向旋转。这样可确保当网格倾斜时，包围薄片的沟槽高壁不会遮挡生物学信息。

通常，需在自动网格环（autogrid rim）上做标记，以帮助在cryoFIB-SEM样品载送器内进行视觉对齐，并在后续加载至透射电子显微镜（TEM）时使用。对于这些样品，使用永久性记号笔（见材料表）在12点钟和6点钟位置各做一个标记，其中一个位于夹环切口部分的中心，另一个正对前者（图2D）。在将样品装入TEM时（见材料表），两个标记应位于加载镊子两侧，并与镊子边缘成90°对齐（图2E）。需要注意的是，制造商建议使用自动网格环上刻蚀的点进行网格对齐，因为某些靠近离子束的墨水可能会干扰切削过程。

可通过改良的冷冻载台盒对剪裁后的载网进行光学显微镜检测，以确认剪裁过程未破坏载网的碳膜。根据样品载盒的类型，未剪裁的载网也可进行铣削，但在将样品从冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）转移至透射电镜（TEM）的过程中必须格外小心，以尽量减少载网弯曲，否则会导致薄片断裂。未剪裁的载网可通过侧入式冷冻样品杆装入透射电镜，但如果在铣削完成后进行剪裁，薄片断裂的风险将显著增加。

有机铂涂层
将载有样品的载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）后，可在单侧或双侧载网上进行有机铂涂层处理。将气体注入系统（GIS）的针管插入样品上方的腔室内，使来自加热源的有机铂蒸气在设定时间内流过载网表面。蒸气在低温表面冷凝，形成一层约 2 µm 厚的固体涂层。该涂层的完整性对于实现均匀且薄的切片至关重要。有机铂涂层的最佳施用条件通常由仪器制造商预先确定，但仍可能需要进一步优化。大多数系统会根据腔室端口的几何结构和样品台的旋转限制，将GIS针管对准平行或垂直于切削方向。可通过在载网上进行涂层、铣削一小块区域、倾斜样品台，并利用扫描电镜（SEM）测量涂层厚度，来尝试不同的设置。

除了 cryoFIB-SEM 本身的设置外，还有若干其他因素可能影响有机铂镀膜的应用，包括：1）样品的形貌特征；2）载网上表面的污染；以及 3）气体注入系统（GIS）针头释放的蒸气流的可重复性。由于 GIS 蒸气流具有方向性，样品表面形貌不平整可能导致细胞或表面污染物遮挡区域未能镀膜或镀膜较薄。这可能在抛光过程中导致有机铂层塌陷（图3）。在选择铣削区域时，必须注意周围形貌情况；例如，较大的表面污染物、成团的细胞或断裂的碳膜碎片，若从载网表面突出达数个网格单元之远，可能阻挡蒸气流，形成较薄的有机铂阴影区，从而削弱薄片结构。此外，应避免在薄片前缘附近存在微小的表面污染物颗粒，因为在铣削过程中这些颗粒可能弹出，留下裸露冰层的薄弱区域，导致抛光时薄片上出现孔洞。最后，若开始铣削后发现有机铂镀层不稳定，应重新镀膜，延长镀膜时间，或切换至备用载网。

显示纳米颗粒在有机相-碳上分布的透射电子显微镜图像。
图3：高质量的有机铂涂层对于获得薄而均匀研磨的薄片至关重要。（A）薄片前缘的显微图像，其中有机铂涂层（OP，黄色）涂覆过薄，导致在抛光过程中薄片前缘出现孔洞（绿色圆圈）以及整个薄片宽度上研磨不均（条纹）。离子束将有机铂表面剪切剥离，导致涂层前缘后方出现材料喷溅（黄色虚线）。（B）有机铂涂层（OP）涂覆较厚，从而获得更均匀减薄的薄片。涂层在整个薄片宽度上保持完整，且有机铂涂层与玻璃态生物材料之间的界面清晰可辨（黄色虚线）。碳层可见贯穿薄片后部（橙色）。比例尺，1 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

评估冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）中的载网质量和切削过程
载网转移至冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）后，可通过扫描电镜（SEM）检查碳膜的完整性以及细胞在载网上的分布情况（图 4A-C）。通过30 kV的低倍扫描电镜可观察冰层梯度、载网栅条的位置以及定位载网上编号的位置（图 4B）；但在高倍镜下定位切削位置并监测切削过程时，应将电压调回至5 kV，以增强表面形貌带来的对比度。

冷冻电子显微镜分析；图像显示了载网制备和玻璃化过程。
图 4：在冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryoFIB-SEM）中评估载网质量并定位待铣削区域。 （A）通过扫描电子显微镜（SEM）在 5 kV 下拍摄的载网低倍概览图。图像底部可见自动载网边缘的切口部分。比例尺，0.5 mm。（B）同一载网在 30 kV 下的 SEM 图像，显示了较厚冰层区域（较暗的载网方格）和较薄冰层区域（较亮的载网方格）。插图显示方框内的区域，箭头指示寻位载网上可见的编号，该编号在 30 kV 下可辨识。比例尺，0.5 mm。（C）两个载网方格的中等倍率概览图，用于评估细胞在碳膜上的分布情况以及载网条的位置。比例尺，50 µm。（D）首次切割的高倍率铣削图案排列（离子束视角，1.5 pA，30 kV）。红色区域（厚 3 µm）受到保护，而黄色区域将被离子束消蚀。白色虚线表示最终薄片的位置。比例尺，10 µm。（E）通过 SEM 在 3 kV 下观察抛光后厚度为 200 nm 的薄片（宽 10 µm × 长 15 µm）的高倍率图像。在 3 kV 下薄片内部对比度的降低表明已达到合适的厚度。明亮的白色前缘是铣削前通过气体注入系统（GIS）在载网上沉积的残留有机铂层。比例尺，5 µm。（F）同一薄片（来自 E）在 30 kV 和 1.5 pA 条件下用离子束观察的结果。黑色方格上横穿的细白线（白色箭头）是薄片最前端边缘残留的有机铂涂层。比例尺，10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在离子束视图中，通过在受保护区域两侧设置一对矩形图案（裂殖体的放大倍数约为7,000倍）来选择待铣削区域（图4D）。必须确保铣削区域附近没有附着表面污染物颗粒，因为这些颗粒可能遮挡了保护性有机铂涂层的应用。此外，该区域的表面形貌必须适合在薄片达到最终厚度后支撑其侧边。

对于疟原虫裂殖体（细胞大小：直径约 5 µm × 厚度 2 µm，呈盘状），可制备宽度为 7–20 µm 的薄片。若细胞层足够厚，所制得的薄片长度通常约为 10–15 µm，能够覆盖碳膜上下多个细胞（图 4E–F）。在一个 8 小时的工作时段内（包含 6–7 小时的切削和 1–2 小时的抛光），通常可完成 5–10 个薄片的制备。实际数量会因样品厚度和薄片宽度而异，样品越厚、薄片越宽，所需切削时间越长。即使网格膜存在局部损伤，也可进行切削，因为仅需少数完好的网格方格即可制备一组薄片（图 5A）。此外，若样品厚度低于预期（例如由于吸滤过度或培养物血细胞比容差异），可较快地制备较短的薄片；但其较短的长度将限制透射电子显微镜（TEM）中可用于数据采集的区域（图 5B）。

聚焦离子束（FIB）铣削过程；扫描电镜图像；微观结构分析；材料横截面。
图 5：确定铣削过程中最终薄片厚度的判定方法。（A）在5 kV条件下通过扫描电镜（SEM）对载网进行的低倍率概览图像，显示剪切过程中出现的碳损伤。未受损区域因过度 blotting 导致样品过薄；然而，在 cryoFIBSEM 上仍可在一整天的工作时段内在此载网上成功制备出六片薄片（白色虚线框内区域）。比例尺：0.5 mm。（B）由该载网制得的一段较短薄片（约10 µm宽 × 3 µm长，不含有机铂层）的SEM图像（3 kV），该薄片仍可提供两个可用于采集倾转系列图像的区域。比例尺：25 µm。（C）在最终抛光步骤中一系列SEM图像（3 kV），显示随着薄片变薄（从左至右），其内部对比度逐渐丧失。所有图像中薄片中部的黑色线条为来自载网的碳膜条带。位于该区域前方的细胞被玻璃化于碳膜之上，而后方的细胞则被玻璃化于碳膜之下。当薄片前缘左侧的有机铂涂层即将失去结构完整性时，停止铣削操作。此终止点早于整个薄片达到均匀厚度，因此薄片后部仍保留部分对比度较高的材料。（D）基于（A）图所示载网上所铣削薄片的一种抛光路径示例。抛光路径应从靠近FIB源的薄片开始，逐渐远离FIB源，以减少铣削材料在薄片表面的再沉积。请点击此处查看该图的放大版本。

在抛光过程中，薄片的最终厚度取决于被铣削区域样品的结构、有机铂涂层的完整性以及可用时间。理想情况下，应持续减薄样品，直至在3 kV的扫描电镜（SEM）下观察到整个薄片表面失去衬度，表明其已达到均匀的电子透明状态，厚度约为150–200 nm（图5C）。然而，若有机铂层出现穿孔或薄片开始弯曲，则可能需要在此前停止铣削。此时，薄片前端可能仍足够薄，可用于断层扫描成像。相反，若薄片形态稳定，也可在失去衬度阶段后继续减薄，通过缩小铣削图案间距使样品进一步变薄（约100 nm或更薄），具体取决于后续实验流程所需的厚度。需获取低倍SEM图像以规划抛光路径，路径应从更靠近离子束源的位置开始，并逐步向外延伸（图5D）。抛光路径的方向至关重要，以防止溅射材料重新沉积到已完成的薄片区域上。

收集和处理倾转系列数据
将样品载入透射电子显微镜（TEM）后，首先获取低倍率的全网格拼图（约150倍），以确定薄片的位置，这些位置可与铣削结束时采集的低倍扫描电镜（SEM）图像进行关联。对于 plunge frozen 的裂殖体样品，网格的大部分区域对电子不透明，因此薄片位置在黑色背景上呈现为白色缺口（图6A）。应记录薄片相对于显微镜倾转轴的角度，若偏离垂直方向超过约10°，可能会导致倾转系列数据采集困难。在每个薄片位置获取中等倍率拼图（约1,500倍），可概览其生物学内容，并检查是否存在转移损伤、结晶冰或过度的表面污染（图6B-D）。还应在高倾转角度下进行检查，以确保无表面污染物遮挡数据采集或对焦区域。选择数据采集区域时，不仅需考虑生物学特征，还需评估周围冰层的结构完整性，例如应避开裂纹区域（这些区域容易发生漂移）或存在严重帘状伪影的区域（此类区域中薄片厚度不均）。在开始采集倾转系列数据前，需对网格施加±10°的预倾转，使薄片平面（而非网格平面）与光轴垂直。预倾转方向可根据中等倍率拼图中薄片前缘的位置（观察残留的有机铂涂层）来确定。对于本研究使用的TEM（300 kV Titan Krios），若拼图中薄片前缘朝上，则需施加+10°预倾转；若朝下，则需施加-10°预倾转。由于镊子夹取和插入自动进样器时的方向不同（切口侧面向左或右会导致180°旋转），每张网格的情况可能各异。最后一个考虑因素是像素尺寸。通常，倾转系列数据的采集像素尺寸在2.5–7 Å/pixel之间，具体选择需综合考虑目标特征的大小、期望的断层成像数据分辨率以及薄片的表面积（后者可能限制采集区域的大小）。也可采用更小的像素尺寸以获取高分辨率信息，本研究中在这些样品上成功使用的最小像素尺寸为1.4 Å/pixel（数据未展示）。更小的像素尺寸下漂移现象更为明显，因此仅适用于较薄（<100 nm）的薄片，且仅在研究中需最大化分辨率时才适用。

材料的显微镜分析，带注释的示意图显示结构组分（SC，CR）
图6：选择可用于采集倾转系列图像的可访问感兴趣区域（A）一段低倍透射电镜（TEM）图谱，显示含有薄片的区域，在黑色背景上呈现为六个白色刻痕（红色箭头）。白色方块为破裂的碳膜。（B）一个受损且已脱玻璃态的薄片的中等倍率图谱。在薄片的前缘（FE），有机铂涂层已断裂脱落（1）。薄片中心存在一块清晰的结晶冰区域（2）。由于靠近网格条处冰层过厚，离子束未能在薄片后缘（BE）完全穿透。仅在后缘有很小一部分薄片脱离周围冰层（3），形成楔形结构。冰层厚度还导致在薄片上方切出了台阶状结构（4），这在高倾转角下极有可能遮挡TEM中细胞的视野。（C）TEM下观察到的一个完整薄片的中等倍率拼接图。采集倾转系列图像时应避免的典型问题区域包括：表面污染覆盖区域（SC）、被有机铂涂层覆盖的区域（OP，黄色）、靠近裂纹的区域（CR和黑色箭头）、因生物材料密度变化导致“帘状伪影”的区域（CU和蓝色括号内区域），以及因有机铂涂层破裂而结构弱化的区域（绿色圆圈）。唯一可用于倾转系列图像采集的区域是两个黑色虚线框内的区域（标记为1和2）。必须在高倾转角下检查视野，以确保表面污染不会遮挡感兴趣区域或聚焦区域。（D）一个更洁净的薄片的中等倍率拼接图，但仍存在因抛光过程中有机铂涂层变薄而产生的裂纹（CR）（绿色圆圈）。在此情况下，感兴趣区域由薄片内观察到的细胞类型确定，即位于碳层（橙色）后方、靠近薄片后部的单个裂殖子（黑色虚线框）。比例尺：3 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电子显微镜揭示膜结构；示意图突出显示脂质谱型。
图7：通过聚焦离子束切削制备的薄片获取冷冻电子断层扫描数据。 (A一张薄片中某个区域的显微图像，显示一个红细胞刚被病原体侵入 P. falciparum 裂殖子。在（B）同一图像中标注了红细胞的边界（红色）、多个双层膜的细胞内囊泡（内膜为紫色，外膜为蓝色）以及被来自宿主细胞的第二层膜（黄色）包裹的裂殖子（绿色）。黑色方框表示获取倾斜系列图像的区域。比例尺：500 nm。C在裂殖子顶端获取的8倍箱合并（2.4 Å/像素）断层图像中，从XY平面观察的约20个中央切片D）其注释显示了包围细胞的两层膜（绿色和黄色），以及在裂殖子顶端堆叠的四层膜（蓝色），这些膜与一个电子致密的蘑菇状结构（紫色）相关联。红色箭头指示了顶端膜堆与蘑菇状结构的连接处（也在部分中显示） F, i）。黑色箭头指示裂殖子质膜与寄生虫内多层囊泡之一发生融合的事件（也在部分中显示） F, ii）。宿主红细胞膜显示为红色，黑色虚线表示在XZ平面上观察的横截面位置，如（E）。横截面中的特征（E) 的颜色和标注与 ( 部分相同D），彩色箭头指向膜结构。黑色箭头指示在切削后对薄片进行溅射镀膜的位置，并标明薄片的厚度。对于部分（C-E），比例尺：500 nm。F) 红色和黑色箭头所示特征的更详细视图（部分（C），显示了裂殖子顶端膜层堆叠中脂质双分子层的清晰结构（i）以及多层囊泡与裂殖子质膜的融合事件。比例尺：75 nm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

本研究的主要目标是解析P. falciparum裂殖子逸出的通路，但由于实验所用细胞群体始终无法完全均一，因此在切片中常可观察到其他发育阶段的细胞结构。此处展示的示例（图7）包含一个刚刚被P. falciparum寄生虫（裂殖子）侵入的红细胞。所用切片厚度为240 nm，在插入透射电镜（TEM）前，载网已在氩气环境中进行轻微的铂溅射镀膜，导致对比度略低于常规预期水平。红细胞膜可被完整追踪，环绕整个细胞。在红细胞内部可见三个被膜包围的结构：两个囊泡，每个均被双层膜包裹，以及一个灯泡状结构（最宽处为1.2 μm × 0.9 μm），该形态特征与裂殖子一致（图7A-B）。这两个囊泡的内容物与红细胞内含物的电子密度相似，提示这些囊泡可能含有血红蛋白。此前已有报道在侵入后的宿主红细胞内观察到囊泡的存在45。这些囊泡被认为来源于裂殖子的分泌细胞器——棒状体（rhoptries）所释放的脂质及其他毒力因子，这些物质在侵入过程中被排入宿主红细胞。裂殖子被两层紧密关联的膜所包围，最内层膜推测为裂殖子自身的质膜，其表面未见明显的外被层；最外层膜则应来源于宿主红细胞膜，即在裂殖子侵入过程中包裹其表面的膜结构。裂殖子的胞质中含有多个多层囊泡，以及一个位于顶端膜堆旁的电子致密、蘑菇状结构。对该区域获取的倾斜系列图像（2.4 Å/像素）显示，该结构包含四层膜堆，且与蘑菇状结构相连（图7C-E）。值得注意的是，这种形态与成熟裂殖子顶端区域通常的细胞器和亚细胞结构排列方式明显不同。为进行比较，我们从经E64处理后再进行冷冻固定与切削的裂殖体样本中，获取了成熟裂殖子顶端区域的对比倾斜系列图像（2.74 Å/像素）（图8）。结果显示，成熟裂殖子顶端包含两个显著的棒状分泌细胞器，称为棒状体，它们嵌于细胞顶端极环结构中的三个极环内，并被多个较小的分泌细胞器——微线体（micronemes）所包围。最内层的极环连接着一种双层膜结构，该结构位于裂殖子质膜下方，称为内膜复合体（inner membrane complex, IMC），其内含有驱动侵入过程的运动蛋白。已有研究表明，在侵入过程中，这些分泌细胞器的内容物被释放至裂殖子表面及宿主红细胞内，从而促进裂殖子与宿主红细胞的黏附，并启动驱动侵入的运动复合体45。本研究数据显示，侵入完成后，裂殖子内部未见任何类似棒状体、微线体或极环的可辨识结构，提示裂殖子顶端结构在侵入后发生了显著形态变化。此前通过室温固定切片的透射电镜观察已证实，棒状体在侵入前会发生融合46，这与我们在侵入后状态裂殖子中观察到的蘑菇状结构的形成一致。然而，此前尚未报道过与该结构相连的膜堆结构；并且由于在新侵入的裂殖子中未见内膜复合体（IMC）存在的迹象，我们推测这些膜堆可能是侵入完成后残留的IMC机械结构残余，但这一假设仍有待进一步验证。

与裂殖子侵入相关的细胞超微结构示意图及显微照片，展示相关细胞器。
图8通过聚焦离子束切片后的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）及塑料切片的透射电镜（TEM）观察成熟裂殖子的顶端结构。 (A) 来自经 E64 处理并在冷冻前制备的 230 nm 厚薄片的 8x 降采样断层图像（2.74 Å/像素），选取其中典型的成熟裂殖子顶端形态的平均 20 张中央切片。由于裂殖体在浸入冷冻前经 E64 处理，故寄生泡（PV）膜已破裂，裂殖子仍保留在宿主红细胞内。B) 显示的内容与 (A），但添加了注释以标明宿主红细胞膜（RCM，红色）、裂殖子质膜（绿色）、内膜复合体（IMC，紫色）、极环（PR，黑色）、微线体（M，黄色）、棒状体（R，灰色）以及核膜（NE，蓝色）。在断层图该区域中一个不在焦平面的邻近裂殖子用绿色三角形标示。比例尺：200 nm。C通过冷冻电子断层扫描（cryoET）观察到的细胞特征与经塑料切片包埋的裂殖体在透射电子显微镜（TEM）下所见一致。在经化合物2处理、于空泡膜破裂前阻滞逸出过程的裂殖体所释放的成熟裂殖子中，亦可见类似的细胞结构。比例尺：500 nm。D) 裂殖子结构示意图，标注了各部分的细胞特征A-C). 请点击此处查看此图的放大版本。

矩形铣削图案之间保护区域的厚度（µm）30 kV 下的标称离子束电流（pA）
3300
1.5100
0.7550
0.330
0.2 - 0.06（最终抛光）30*

表1：制备薄片层的铣削策略。 通过逐步降低离子束电流以对应保护区域的厚度，实现逐级铣削。这可以限制样品加热，防止非晶化。*抛光步骤应并行进行，以便从两侧均匀地向片层施加热量，从而在片层达到最终厚度时降低其弯曲或拱起的风险。其他步骤可依次进行，先在片层上方铣削图案，再在片层下方铣削，然后进入下一个束流强度。在网格上定位铣削位置时，应使用1.5 pA束流强度进行扫描，以最小化样品加热。 请点击此处下载该表格。

讨论

尽管冷冻聚焦离子束（cryoFIB）切片技术正逐渐趋于常规化，但用于切片的最优样品制备仍未实现标准化；因此，本方案中的大多数关键步骤均发生在样品进入冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）之前。在尝试切片前，必须通过多轮的细胞制备、投入式冷冻以及光学和电子显微镜的筛选来优化样品。获得尽可能高质量的样品不仅能够提高实验成功的几率，还能优化设备的使用效率。正因如此，大多数国家级平台在分配机时前，均要求用户提供已进行充分优化的证据。一旦样品进入cryoFIB-SEM，最大化有机铂镀层的效能至关重要，以确保生成厚度均匀的薄片。最后，操作者必须具备耐心和良好的样品操作技能，因为需要连续多日完成含精细薄片的载网制备及转移工作。随着自动化切片策略的引入47,48，这一状况可能发生变化，但目前在大多数机构中，整个切片过程仍主要依赖人工操作。

尽管本研究仅针对P. falciparum裂殖体，但本文所介绍的方法可轻松修改，以优化其他细胞类型的载网制备和切片过程。需要考虑的重要因素包括：接种到载网上的细胞密度、载网类型（铜网对某些细胞具有毒性）、碳膜上孔洞的大小和间距、 blotting时间以及blotting方法（单侧/双侧、手动或自动）。此外，如果细胞是在载网上培养的（通常为带有穿孔碳膜的金网），可在blotting和冷冻前通过光学显微镜检查细胞汇合度。切片策略取决于细胞在载网上的沉积方式。对于疟原虫感染的红细胞，载网表面基本被一层连续的细胞覆盖，某些区域较厚，其他区域较薄。切片操作可在该厚度梯度的某一区域内多个位点进行，选择冰层厚度能够产生适合断层成像的薄片区域。这种方法适用于较小的细胞，因为可以制备出包含多个细胞横截面的薄片。而对于较大的细胞或细胞团块，可能一个细胞或细胞团块仅能产生一个薄片。

载网操作和样品转移仍是该工作流程中的主要挑战之一。薄片可能因断裂或裂纹而丢失，帘状伪影会遮蔽生物学结构，表面污染过度，以及在透射电镜（TEM）中出现载网方向问题，这些都可能需要额外的操作步骤来重新定位载网。损失程度因天而异、因载网而异，但随着实践和操作经验的积累会逐步改善。本研究发现，载网可在自动进样器中多次小心地重新调整方向，而不会破坏薄片，有时还能借此洗去表面的冰层。该工作流程的另一个主要局限在于制备薄片所需的时间。由于制备过程缓慢，因此至关重要的是要对样品进行充分优化，以使铣削过程尽可能高效。

近年来，针对玻璃态生物样品的聚焦离子束铣削（FIB-milling）技术已引入多项改进。其中一项具有变革意义的进展是在cryoFIB-SEM腔室内采用低温冷却的拾取工具，使得能够从高压冷冻样品中铣削出更大体积的样品块。这些样品块可被固定在金属杆上，或用夹具拾取并转移至第二个样品位置，该位置包含经过特殊改造的电镜载网。随后可对样品块进行有机铂镀膜，并进一步铣削以制备薄片（lamellae）。这种从高压冷冻样品中直接铣削薄片的能力，使得更大尺寸的细胞和组织得以处理，并可通过相关荧光显微镜技术对特定区域进行精确定位12。FIB铣削技术的其他近期改进包括：通过楔形预铣削减少帘状伪影16、微流控低温固定技术49，以及对电镜载网进行光刻微图案化以改善细胞分布50。此外，已有研究证明，在薄片两侧铣削出微小的扩展间隙，可在样品达到最终厚度时缓解周围材料对其产生的压缩效应51。这一方法在处理连续细胞层（如本研究中的样品）时尤为有用，因为此类样品在最终抛光步骤中常出现薄片弯曲现象。

电子显微镜的未来很可能是通过子层析平均法（sub-tomogram averaging）来确定in situ分子结构，而聚焦离子束切削（FIB-milling）是一项重要工具，将有助于为这类工作流程制备玻璃态生物样品。尽管FIB-milling在生物应用中仍处于起步阶段，但由于学术界和国家级研究设施的研究人员的辛勤工作，以及商业领域对开发支持科研的冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryoFIB-SEM）技术的投入，相关方法的开发正在快速推进。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究全部或部分由惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：212916/Z/18/Z）资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿件版本应用了CC BY公共版权许可。

本项目的研究方法由英国医学研究理事会（MRC）资助，资助编号为 MR/P010288/1，授予 Helen R. Saibil、Roland A. Fleck 和 Michael J. Blackman。恶性疟原虫（P. falciparum）的培养在弗朗西斯·克里克研究所（The Francis Crick Institute）进行，并得到 Michael J. Blackman 研究团队成员的支持。作者谨此感谢 Ser Ying (Michele) Tan 博士提供了化合物 2 以及经 E64 处理的裂殖体在薄血涂片中的图像。大部分薄片样品的制备得到了电子生物成像中心（eBIC）工作人员的支持，我们感谢在研究提案 NT21004 下使用 Scios 双束冷冻聚焦离子束-扫描电镜（cryoFIB-SEM）的机会。作者还感谢英国皇家学会产业研究员计划（INF\R2\202061）对在 CUI 内持续推进聚焦离子束切削（FIB-milling）技术发展的支持。作者同时感谢 Helen R. Saibil 就本方法学论文所进行的有益讨论以及对整个项目的指导。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
c-clipsThermo Fisher Scientific1036171
切片站Thermo Fisher Scientificn/a直接引用自 Thermo
切片站Sub-angstromCSA-01
化合物 2n/an/a由 LifeArc 的 Simon A. Osborne 博士合成
用于冷冻聚焦离子束的专用 autogrid 边框Thermo Fisher Scientific1205101
E64SigmaE3132
Emitech K100X 电晕放电装置Quorumn/a
Gibco RPMI 1640 培养基Thermo Fisher Scientific12633012所用配方为定制（货号 041-91762 A），包含 Albumax、谷氨酰胺、HEPES 和次黄嘌呤补充物
吉姆萨染液VWR International350864X
载玻片Thermo Fisher Scientific11562203
载网盒Sub-angstromPB用于存放切片后的载网
载网盒Thermo Fisher Scientificn/a用于存放切片后的载网——直接引用自 Thermo Fisher Scientific
载网盒Agar ScientificAGG3727
自制手动浸入式冷冻装置n/an/a配备隔热乙烷罐（高密度泡沫）和液氮浴（聚苯乙烯），置于生物安全实验室的操作台面上
人血n/an/a来自英国国家血液与移植服务中心
配备 Leica VCT500 冷却阶段系统的 JEOL 4700F Z JSMJEOLn/aFIB-SEM
配备 VCT500 冷冻台的 Leica EM ACE600Leican/a溅射镀膜仪
Leica EM ACE900Leican/a电子束旋转镀膜仪。在湿度受控的房间内使用。
Linkam 显微镜用冷冻台Linkam型号 CMS196用于存放切片和未切片载网的样品盒。在湿度受控的房间内使用。
甲醇Sigma179957
配备 Linkam 冷冻台的 Nikon Eclipse E200 光学显微镜Nikonn/a在湿度受控的房间内使用
PercollVWR International17-0891-01Percoll 垫层溶液的配制方法为：35 ml 10x PBS、150 ml RPMI 1640 培养基和 315 ml Percoll
Quantifoil 铜质 200 目 2/4 多孔碳 EM Finder 载网QuantifoilN1-C17nCuH2-01每包 100 片
Quantifoil 铜质 200 目 2/4 多孔碳 EM 载网QuantifoilN1-C17nCu20-01每包 100 片
Quorum PP3010 预处理室Quorumn/a溅射镀膜仪
配备 Quorum PP3010 转移台的 Scios 双束系统FEIn/aFIB-SEM
Staedtler Lumocolor 细尖黑色永久记号笔Viking DirectND538522
TFS Titan Krios 300 kV 透射电子显微镜Thermo Fisher Scientificn/a配备 K2 或 K3 相机的透射电镜
Whatman 1 号级滤纸SigmaWHA1001150
配备 Linkam 冷冻台的 Zeiss Axio Scope A1 光学显微镜Zeissn/a在湿度受控的房间内使用

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 9/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

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