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在微加工微流控平台中构建简化的三维皮肤芯片模型

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DOI：

10.3791/62353

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2021年5月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。

摘要

本研究展示了一种新型、经济高效且可靠的微流控平台，具有生成复杂多层组织的潜力。作为概念验证，构建了一个简化的、未分化的包含真皮（间质）和表皮（上皮）结构域的人类皮肤模型。为实现这一目标，开发了一种基于乙烯基、多功能且稳定的双腔室装置，克服了聚二甲基硅氧烷（PDMS）基微流控设备在生物医学应用中存在的一些局限性，例如需要昂贵且专用的设备，或对小分子疏水性物质及蛋白质的吸附问题。此外，还开发了一种基于平行流动的新方法，可实现 原位 真皮和表皮双层结构的构建。该皮肤模型由含有原代人成纤维细胞的纤维蛋白基质以及在其上方接种的永生化角质形成细胞单层组成，并在动态培养条件下维持。这一新型微流控平台为模拟人类皮肤疾病提供了可能，并可进一步拓展该方法以构建其他复杂的组织。

引言

近年来，在开发与生产方面已取得进展 体外 用于化妆品和药品毒性分析的人体皮肤模型1制药和护肤品行业的研究人员一直使用动物（其中小鼠最为常见）来测试其产品2,3,4,5然而，在动物身上测试产品并不总能预测人体反应，这常导致药物在人体中失效或产生不良反应，进而造成经济损失5,6英国是1998年首个禁止使用动物进行化妆品测试的国家。随后，欧盟于2013年禁止在动物身上进行化妆品测试及批准化妆品上市（欧盟化妆品法规第1223/2009号）。7.

这一禁令也正在被其他国家考虑，例如美国的《人道化妆品法案》（The Humane Cosmetics Act）8除了伦理方面的顾虑之外，动物皮肤与人类皮肤在解剖结构上的差异使得动物实验耗时、昂贵且常常无效。此外，全球 体外 毒理学检测市场规模预计到2025年将达到269.8亿美元9因此，有必要开发新的方法和替代方案 体外 研究，例如可进行化妆品和药物安全性和毒性测试的生物工程人皮肤模型，使得无需使用动物即可完成相关测试。

有两种不同类型的市售产品， 体外 人体皮肤模型。第一类是由分层的表皮等效物构成，包含在不同材料上接种的多层分化角质形成细胞。其中一些模型已获得经济合作与发展组织（OECD）批准，并由欧洲替代方法验证中心（ECVAM）验证，可用于皮肤腐蚀性和刺激性测试，例如 EpiDerm 或 SkinEthic10,11,12第二类是全层皮肤等效物，其结构为在含有成纤维细胞的三维（3D）支架上接种分化的人角质形成细胞层，例如 T-Skin 和 EpiDerm-FT。然而，这些模型在静态条件下培养，无法准确模拟人体生理条件。

近期研究兴趣集中于生成 体外 具有动态灌注的细胞培养插入式（CCI）格式三维皮肤模型13,14,15,16,17,18,19。然而，这些系统不能被视为 严格意义上 根据该领域中的经典定义，即类器官芯片（organs-on-chips）中的微流控皮肤芯片。Ingber 对类器官芯片的定义指出，器官必须被置于微流控通道内部，这一条件仅有少数装置能够满足20,21目前，类皮肤芯片主要通过多孔膜分隔的单细胞层和/或真皮细胞层来模拟简单的上皮组织22,23尽管在微流控系统中模拟皮肤方面已取得一些进展16,24目前尚无文献报道符合英格伯定义的器官芯片系统，能够生成多层皮肤结构 原位 包括上皮和间质成分。

本研究介绍了一种新型、低成本、坚固耐用的基于乙烯基的微流控平台，适用于“芯片上的皮肤”应用。该平台采用微机械加工技术制备，简化了制造工艺，同时提高了器件结构布局的灵活性与多功能性，克服了聚二甲基硅氧烷（PDMS）的一些局限性25。此外，还设计了一种通过注射泵控制平行流的方式，以引入简化的皮肤结构。平行流可使两种黏度差异较大的流体（本实验中为缓冲液和纤维蛋白预凝胶）在通道内并行灌注而不发生混合。作为概念验证，将包含包埋于模拟真皮层的纤维蛋白基质中的成纤维细胞的真皮-表皮复合结构引入芯片中，并在其上方接种单层角质形成细胞，以模拟未分化的表皮层。通过调节流速可调控真皮区室的高度。与先前报道的模型22,26,27,28,29相比，本研究的主要创新在于利用微流控技术在微腔内构建三维组织结构。尽管本文展示的是简化的未分化皮肤模型，但长期目标是构建并表征完全分化的皮肤组织，以验证其在药物和化妆品测试中的可行性与功能性。

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方案

1. 芯片设计与微加工参数

  1. 使用开源设计软件 FreeCAD 设计微流控芯片的各层结构；通道尺寸请参考表1。在设计中包含四个直径为 2.54 mm 的孔，用于使用定制的对准装置实现各层的准确对齐。
长度 (μm)宽度 (μm)
下室28,400800
上室31,000800

表1：装置上通道与下通道的尺寸。

  1. 将95 µm厚的压敏透明乙烯基薄膜裁剪成30 cm × 30 cm的正方形，以适配绘图仪。
  2. 使用Brother CanvasWorkspace软件创建一个30 cm × 30 cm的工作区，并填入芯片各层的设计图案（图1A），保存为.svg文件。
  3. 使用边缘绘图仪裁剪30 cm × 30 cm的乙烯基薄膜（图1B-D）。
    1. 将乙烯基薄膜粘贴到低粘性背胶垫上，必要时排除所有气泡。
    2. 将.svg文件上传至绘图仪，并设置裁剪参数：刀具等级：3级；裁剪压力：0级；裁剪速度：1级。将带有乙烯基薄膜的背胶垫放入绘图仪，启动裁剪过程。
  4. 按照上述步骤，在12 µm厚的双面胶带乙烯基材料上裁剪顶层通道图案。

figure-protocol-1
图1：芯片设计与微加工工艺。（A）软件布局图，显示了为芯片设计的顶部和底部图案所填充的工作区域。（B）切割过程中边缘绘图仪；图中显示了切割刀片、完整乙烯基片材和粘合垫。（C）从已切割的片材上剥离出已成型的乙烯基图案。（D）采用顶部通道设计图案化的粘合乙烯基层样品。请点击此处查看该图的高清版本。

2. PDMS 层的制备

  1. 按10:1（v/v）的比例混合PDMS与固化剂，将混合物置于真空环境中15分钟以去除气泡。将55 mL混合液倒入55 cm2的方形培养皿中，形成厚度为2 mm的液层。用针头去除残留气泡。
  2. 将混合物（步骤2.1）在80 °C的烘箱中固化1小时。脱模后，将PDMS切割成与芯片尺寸相同的矩形，并使用18 G注射器针头打孔以连接管路。

3. 芯片组装

注意：为便于理解，请参见图2。

  1. 使用对准仪正确调整通道、入口和出口，组装整个装置。堆叠四层乙烯基材料（带相应的底部微结构图案）以组装下层通道，保留底层的覆盖胶带，以避免粘附到对准仪上。
  2. 将聚碳酸酯（PC）多孔膜裁剪并放置在下层通道顶部，以将其与上层通道分隔开。注意不要覆盖下层通道的入口。
  3. 添加十层具有上腔室设计的乙烯基材料。在顶部贴上带有上层通道图案的双面胶乙烯基层。将芯片从对准仪上取下，并粘附到玻片上。
  4. 在双面胶乙烯基层上方放置一块2 mm厚的PDMS片，以提供适当的管路固定并防止泄漏。在芯片上方放置重物过夜，以确保芯片完全密封。用70%（v/v）乙醇冲洗5分钟对芯片进行灭菌，然后用去离子H2O洗涤。

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图 2：微流控芯片组装示意图。（A）装置组装的总体示意图。下腔室和上腔室分别由四层和十一层叠加的乙烯基薄膜组成。（B）微流控芯片的俯视图和侧视图。顶部通道和底部通道分别以粉红色和蓝色表示。（C）使用定制对准装置进行芯片组装的照片。（D）完成组装后的芯片图像。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 泵的连接

注意：泵连接的图示见图3。

  1. 将泵1连接到上腔入口1（UCi1）。
  2. 将泵2连接到上腔入口2（UCi2）。
  3. 将泵3连接到下腔入口（LCi）。
  4. 将上腔出口（UCo）和下腔出口（LCo）连接至废液管。
  5. 使用聚四氟乙烯（PTFE）管和18 G不锈钢接头将注射器连接至各个入口。

figure-protocol-3
图3：泵的连接方式及进出口位置。（A）示意图显示三种不同泵与其对应进口的连接方式；出口均连接至废液容器。（B）芯片图像，标注了各个进口和出口。缩写：LCi = 下腔室进口；LCo = 下腔室出口；UCi1 = 上腔室进口1；UCi2 = 上腔室进口2；UCo = 上腔室出口。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 细胞培养

注意：HaCaT 细胞系具有商业来源。人原代成纤维细胞来自健康供体，由西班牙卡洛斯三世健康研究所生物医学研究国家生物样本库注册系统（"Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III"）所收录的人源生物样本集合中获得。

  1. 在经紫外线灭菌并用乙醇擦拭的细胞培养罩内操作。
  2. 解冻 H2B-GFP-HaCaT 细胞（人永生化皮肤角质形成细胞，hKCs）和 GFP-人原代成纤维细胞（hFBs） 37 °C，加入 2 mL 培养基，以 7 min 离心 20 °C 在250 × g.
    注意：H2B-GFP-HaCaT 细胞是经基因改造表达组蛋白 H2B-绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的人永生化角质形成细胞，其细胞核呈现绿色荧光。GFP-hFBs 是经 pLZRS-IRES-EGFP 载体转导表达胞质绿色荧光的人原代成纤维细胞。这些细胞系的构建均依据已发表的文献方法进行改造。30,31
  3. 将hKC和hFB均在含10%胎牛血清和1%抗生素/抗真菌溶液的1×DMEM中培养。使用前将培养基预热至 37 °C 使用前
  4. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入2 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），于37℃孵育10分钟以消化细胞 37 °C.
  5. 加入4 mL培养基以灭活胰蛋白酶。重悬细胞并转移至15 mL离心管中。去除 10 µL 使用血细胞计数板进行细胞计数并确定合适的细胞浓度。
  6. 将15 mL离心管以7分钟离心 20 °C 在250 × g. 去除上清液，并将沉淀重悬于所需浓度：hFBs 为 50,000 个细胞/mL，hKCs 为 5·× 106 cells/mL

6. 纤维蛋白原预凝胶的制备

  1. 通过向小瓶中加入 1 mL 氯化钙（CaCl2，1% w/v，溶于 NaCl）来激活凝血酶。
  2. 加入以下组分，制备 1 mL 纤维蛋白终浓度为 3.5 mg/mL 的纤维蛋白水凝胶：59 µL 激活的凝血酶（10 NIH 单位/mL）、59 µL 氨甲环酸（材料表，100 mg/mL）、764 µL 含 50,000 hFBs/mL 的培养基、118 µL 纤维蛋白原（20 mg/mL，溶于 0.9% w/v NaCl）。
    ​注意：纤维蛋白原必须在最后时刻加入。

7. 平行流方案

  1. 在整个过程中，使用泵3以50 µL/min的流速将1×PBS通过LCi泵送。
  2. 使用泵2以100 µL/min的流速将牺牲液（1×PBS）通过UCi2泵送。
  3. 将预凝胶吸入注射器后迅速装入泵1，并以200 µL/min的流速运行（图4A）。
  4. 当预凝胶从UCo流出后，停止泵1和泵2。
  5. 将芯片连同管路一起在37 °C下静置至少10分钟，以完成凝胶化。
  6. 使用泵3以50 µL/h的流速通过UCi2泵送 培养基过夜。
  7. 用堵头封闭UCi1。

8. hKCs 单层接种

  1. 在生成真皮层隔室24小时后，于显微镜下观察确认人成纤维细胞（hFBs）是否已铺展。
  2. 通过泵2在UCi2处以5的流速引入hKCs ×·106 细胞/mL 于 40 µL/min 1 分钟（图4B).
  3. 将芯片在室温下放置过夜 37 °C 在湿度饱和的培养箱中孵育，以促进细胞贴壁。
  4. 仅通过 LCi 使用泵 3 泵入新鲜培养基 50 µL/min (图4C).

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图 4：用于生成真皮-表皮复合结构的微流控方案。 （A）横截面图，显示用于生成真皮层的并行流动过程。（B）在生成真皮层后 24 小时接种角质形成细胞单层。（C）在微流控装置内进行细胞培养维持。（D）芯片内皮肤结构的横截面重建。请点击此处查看此图的放大版本。

9. 细胞活力检测

注意：活/死细胞染色试剂盒根据细胞的活或死状态，使其呈现绿色或红色荧光。为正确区分细胞活力，此步骤必须使用非荧光标记的人角膜上皮细胞（hKCs）和人成纤维细胞（hFBs）。本方案中的所有步骤均通过 UCi2 以泵 2 实施。

  1. 以 50 µL/min 的流速用 1× PBS 冲洗上通道 5 分钟，以去除培养基。
  2. 以 50 µL/min 的流速泵入空气，去除 1× PBS。
  3. 根据制造商说明书配制 Calcein AM/Ethidium homodimer-1 试剂盒（活/死细胞染色）溶液。
  4. 以 50 µL/min 的流速泵入活/死细胞染色溶液，持续 2 分钟。
  5. 在 37 °C 避光孵育 30 分钟。
  6. 以 50 µL/min 的流速泵入 1× PBS 冲洗上通道 2 分钟，以去除残留试剂。
  7. 在共聚焦显微镜下观察样品。活细胞和死细胞的激发波长分别使用 495/590 nm，发射波长分别使用 519/617 nm。

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结果

设计的芯片由两个流体腔室组成，二者之间由孔径为5 µm的PC膜隔开，该膜允许促生长分子从下层腔室通过，从而支持细胞生长。上层腔室容纳组织构建物，在本例中为包含hFBs的纤维蛋白水凝胶上生长的hKCs单层。

通道的高度由每个通道中添加的粘合片层数决定。下层腔室由4层（380 µm）组成，上层腔室由10层单面胶带和1层双面胶带组成（962 µm）。芯片的尺寸为4 cm × 2 cm，便于操作。粘性乙烯基片材提供了良好的防水性和透明度，便于对装置进行目视检查。PDMS层有助于将管路牢固固定，防止管路插入孔处发生泄漏。

根据已发表的文献，迄今为止尚未见报道使用注射泵将含细胞水凝胶注入微流控腔室的可注射性研究。因此，必须评估纤维蛋白预凝胶的可注射性。我们观察到，在50 µL/min的流速下，注射器会发生堵塞；然而，高于200 µL/min的流速则可能对细胞造成损伤。为此，我们开展了流变学研究，以检测纤维蛋白预凝胶在选定流速范围（50–200 µL/min）内的剪切稀化行为，测得其黏度在10至50 cP之间。这些结果为确定该系统的工作条件...

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讨论

开发该方法的动机源于希望在高通量平台上模拟皮肤疾病，并研究新型和创新疗法的效果。迄今为止，本实验室通过将含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶浇铸到细胞培养插入板中（可手动操作或借助3D生物打印技术），并在其表面接种角质形成细胞，来制备这些真皮-表皮等效物。一旦角质形成细胞达到汇合状态，三维培养物即暴露于气-液界面，从而诱导角质形成细胞分化，形成分层的表皮，进而构建出完全分化的无毛囊人皮肤32,33,34。然而，尽管这些三维培养模型在临床上具有重要意义，但其成本高昂、耗时较长，且无法充分模拟生理条件。

器官芯片技术为细胞培养中生理条件的模拟提供了一个平台，从而有助于更好地理解候选药物的毒性、疗效及递送方式13,14,15<...

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披露

作者声明不存在利益冲突的财务关系。

致谢

我们衷心感谢 Javier Rodríguez 博士、María Luisa López 博士、Carlos Matellán 和 Juan Francisco Rodríguez 提供的宝贵建议、讨论和/或初步数据。我们还诚挚感谢 Sergio Férnandez、Pedro Herreros 和 Lara Stolzenburg 为本项目所做出的贡献。特别感谢 Marta García 博士提供 GFP 标记的人成纤维细胞（hFBs）和人角质形成细胞（hKCs）。最后，我们感谢 Guillermo Vizcaíno 和 Angélica Corral 提供的出色技术支持。本研究得到了中国台湾马德里自治区研究与开发研究团队间合作项目“"Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid"”（项目编号 S2018/BAA-4480，Biopieltec-CM）的资助。本研究还得到了“"Programa de excelencia"”项目（EPUC3M03，CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AmchafibrinRottafarm氨甲环酸
抗生素/抗真菌剂Thermo Scientific HyClone
氯化钙Sigma Aldrich
培养板Fisher
DMEMInvitrogen Life Technologies
双面乙烯基胶带ATP Adhesive SystemsGM 107CC，12 µm 厚
边缘绘图仪BrotherScanncut CM900
胎牛血清Thermo Scientific HyClone
纤维蛋白原Sigma Aldrich从人血浆中提取
玻璃载片Thermo Scientific
GFP-人真皮成纤维细胞-原代细胞，由Marta García博士惠赠
H2B-GFP-HaCaT细胞系ATCC永生化角质形成细胞，由Marta García博士惠赠
活/死细胞检测试剂盒Invitrogen
PBSSigma Aldrich
聚碳酸酯膜Merk TM5 µm 孔径
聚二甲基硅氧烷Dow CorningSylgard 184
氯化钠Sigma Aldrich
注射器Terumo5 mL
凝血酶Sigma Aldrich10 NIH/瓶
透明粘性乙烯基材料MactacJT 8500 CG-RT，95 µm 厚
胰蛋白酶/EDTASigma Aldrich
管路IDEX聚四氟乙烯，外径1/16”，内径0.020”

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