在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。
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本文内容
摘要
摘要
本研究展示了一种新型、经济高效且可靠的微流控平台，具有生成复杂多层组织的潜力。作为概念验证，构建了一个简化的、未分化的包含真皮（间质）和表皮（上皮）结构域的人类皮肤模型。为实现这一目标，开发了一种基于乙烯基、多功能且稳定的双腔室装置，克服了聚二甲基硅氧烷（PDMS）基微流控设备在生物医学应用中存在的一些局限性，例如需要昂贵且专用的设备，或对小分子疏水性物质及蛋白质的吸附问题。此外，还开发了一种基于平行流动的新方法，可实现 原位 真皮和表皮双层结构的构建。该皮肤模型由含有原代人成纤维细胞的纤维蛋白基质以及在其上方接种的永生化角质形成细胞单层组成，并在动态培养条件下维持。这一新型微流控平台为模拟人类皮肤疾病提供了可能，并可进一步拓展该方法以构建其他复杂的组织。
引言
近年来，在开发与生产方面已取得进展 体外 用于化妆品和药品毒性分析的人体皮肤模型1制药和护肤品行业的研究人员一直使用动物（其中小鼠最为常见）来测试其产品2,3,4,5然而，在动物身上测试产品并不总能预测人体反应，这常导致药物在人体中失效或产生不良反应，进而造成经济损失5,6英国是1998年首个禁止使用动物进行化妆品测试的国家。随后，欧盟于2013年禁止在动物身上进行化妆品测试及批准化妆品上市（欧盟化妆品法规第1223/2009号）。7.
这一禁令也正在被其他国家考虑，例如美国的《人道化妆品法案》（The Humane Cosmetics Act）8除了伦理方面的顾虑之外，动物皮肤与人类皮肤在解剖结构上的差异使得动物实验耗时、昂贵且常常无效。此外，全球 体外 毒理学检测市场规模预计到2025年将达到269.8亿美元
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方案
1. 芯片设计与微加工参数
- 使用开源设计软件 FreeCAD 设计微流控芯片的各层结构；通道尺寸请参见表1。在设计中包含四个直径为 2.54 mm 的孔，用于配合自制对准装置，实现各层的准确对位叠加。
| 长度 (μm) | 宽度 (μm) | |
| 下腔 | 28,400 | 800 |
| 上腔 | 31,000 | 800 |
表1：装置上通道与下通道的尺寸。
- 将95 µm厚的粘性透明乙烯基材料裁剪成30 cm × 30 cm的正方形，以适配绘图仪。
- 使用Brother CanvasWorkspace软件创建一个30 cm × 30 cm的工作....
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结果
设计的芯片由两个流体腔室组成，中间以孔径为5 µm的PC膜隔开，该膜允许促生长分子从下层腔室通过，从而支持细胞生长。上层腔室容纳组织构建物，在本例中为含有hFBs的纤维蛋白水凝胶上的hKCs单层。
通道的高度由每个通道中添加的粘合膜层数决定。下层腔室由4层（380 µm）构成，上层腔室由10层单面胶带和1层双面胶带构成（962 µm）。芯片的尺寸为4 cm × 2 cm，便于操作。粘性乙烯基薄膜提供了良好的密封性和透明度，便于对装置进行目视检查。PDMS层有助于将管路牢固固定，防止管路插入孔位时发生泄漏。
根据已发表的文献，迄今为止尚未见报道通过注射泵将含细胞水凝胶注入微流控腔室的可注射性研究。因此，必须评估纤维蛋白预凝胶的可注射性。我们观察到，在50 µL/min的流速下，注射器会发生堵塞；然而，高于200 µL/min的流速则可能对细胞造成损伤。为此开展了流变学研究，以检测纤维蛋白预凝胶在选定流速范围（50–200 µL/min）内的剪切稀化行为，测得其黏度在10至50 cP之间。这些结果有助于确定该系统的工作条件。
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讨论
开发该方法的动机源于希望在高通量平台上模拟皮肤疾病，并研究新型和创新疗法的效果。迄今为止，本实验室通过将含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶浇铸到细胞培养插入板中（可手动操作或借助3D生物打印技术），并在其表面接种角质形成细胞，来制备这些真皮-表皮等效物。一旦角质形成细胞达到汇合状态，三维培养物即暴露于气-液界面，从而诱导角质形成细胞分化，形成分层的表皮，进而构建出完全分化的无毛囊人皮肤32,33,34。然而，尽管这些三维培养模型在临床上具有重要意义，但其成本高昂、耗时较长，且无法充分模拟生理条件。
器官芯片技术为细胞培养中生理条件的模拟提供了一个平台，从而有助于更好地理解候选药物的毒性、疗效及递送方式13,14,15<.......
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披露
作者声明不存在利益冲突的财务关系。
致谢
我们衷心感谢 Javier Rodríguez 博士、María Luisa López 博士、Carlos Matellán 和 Juan Francisco Rodríguez 提供的宝贵建议、讨论和/或初步数据。我们还诚挚感谢 Sergio Férnandez、Pedro Herreros 和 Lara Stolzenburg 为本项目所做出的贡献。特别感谢 Marta García 博士提供 GFP 标记的人成纤维细胞（hFBs）和人角质形成细胞（hKCs）。最后，我们感谢 Guillermo Vizcaíno 和 Angélica Corral 提供的出色技术支持。本研究得到了中国台湾马德里自治区研究与开发研究团队间合作项目“"Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid"”（项目编号 S2018/BAA-4480，Biopieltec-CM）的资助。本研究还得到了“"Programa de excelencia"”项目（EPUC3M03，CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amchafibrin | Rottafarm | 氨甲环酸 | |
| 抗生素/抗真菌剂 | Thermo Scientific HyClone | ||
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | ||
| 培养板 | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| 双面乙烯基胶带 | ATP Adhesive Systems | GM 107CC，12 µm 厚 | |
| 边缘绘图仪 | Brother | Scanncut CM900 | |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific HyClone | ||
| 纤维蛋白原 | Sigma Aldrich | 从人血浆中提取 | |
| 玻璃载片 | Thermo Scientific | ||
| GFP-人真皮成纤维细胞 | - | 原代细胞，由Marta García博士惠赠 | |
| H2B-GFP-HaCaT细胞系 | ATCC | 永生化角质形成细胞，由Marta García博士惠赠 | |
| 活/死细胞检测试剂盒 | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| 聚碳酸酯膜 | Merk TM | 5 µm 孔径 | |
| 聚二甲基硅氧烷 | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | ||
| 注射器 | Terumo | 5 mL | |
| 凝血酶 | Sigma Aldrich | 10 NIH/瓶 | |
| 透明粘性乙烯基材料 | Mactac | JT 8500 CG-RT，95 µm 厚 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| 管路 | IDEX | 聚四氟乙烯，外径1/16”，内径0.020” |
参考文献
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U.
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