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通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

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DOI：

10.3791/62368

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2021年4月16日

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

本文内容

摘要

本文介绍了一种提取多种分枝杆菌细胞壁总脂质含量的方案。此外，还展示了不同类型分枝菌酸的提取与分析方案。同时提供了一种薄层色谱法用于监测这些分枝杆菌化合物。

摘要

分枝杆菌物种在生长速度、色素产生、在固体培养基上表现出的菌落形态以及其他表型特征方面可能存在差异。然而，它们都具有分枝杆菌最关键的共同特征：即其独特且高度疏水的细胞壁。分枝杆菌含有由阿拉伯半乳聚糖、肽聚糖以及链长和类型因菌种而异的长链分枝菌酸组成的膜共价连接复合物。此外，分枝杆菌还能在其细胞表面非共价结合地产生多种脂类，例如二分枝菌酰基苯酚二醇（PDIM）、酚糖脂（PGL）、糖肽脂（GPL）、酰基海藻糖（AT）和磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）等。其中一些脂类被认为是致病性分枝杆菌的毒力因子，或在宿主与分枝杆菌相互作用中发挥关键抗原作用的脂类。因此，由于分枝杆菌脂类在多个领域具有重要应用价值——从阐明其在分枝杆菌感染致病性中的作用，到作为免疫调节剂用于治疗感染性疾病及其他病理状态（如癌症）的潜在用途——人们对分枝杆菌脂类的研究具有显著兴趣。本文介绍一种简便的方法，利用有机溶剂混合物从固体培养基中培养的分枝杆菌细胞中提取并分析其总脂含量及分枝菌酸组成。获得脂质提取物后，采用薄层色谱法（TLC）对提取的化合物进行检测分析。本示例实验使用了四种不同的分枝杆菌：环境来源的快速生长 海分枝杆菌和偶然分枝杆菌， 减毒的慢生长型 Mycobacterium bovis 卡介苗（bacillus Calmette-Guérin, BCG）以及机会性致病的快速生长菌 脓肿分枝杆菌， 表明本方案中所示方法可广泛适用于多种分枝杆菌。

引言

分枝杆菌属 是一个包含致病性和非致病性物种的属，其特征是具有由特殊脂质构成的高度疏水且不可渗透的细胞壁。具体而言，分枝杆菌细胞壁含有分枝菌酸，这类物质为α-烷基、β-羟基脂肪酸，其中α-支链在所有分枝菌酸中均保持一致（长度除外），而β-链（称为全分枝菌酸链）是一条长链脂肪族链，可能含有多种不同的官能团，根据文献记载包括（α-、α'-、甲氧基-、κ-、环氧基-、羧基-和ω-1-甲氧基-分枝菌酸），因而形成七种类型的分枝菌酸（I–VII）1此外，分枝杆菌细胞壁中还含有其他具有明确重要性的脂质。例如，致病性分枝杆菌种类 结核分枝杆菌， 的 结核病的致病因子2 产生特定的脂质类毒力因子，例如分枝菌酚二霉菌酸酯（PDIMs）、酚糖脂（PGL）、二酰基、三酰基和五酰基海藻糖（DAT、TAT 和 PAT）或硫酸化脂质等3它们存在于分枝杆菌表面，被认为与调控宿主免疫反应的能力相关，因而影响分枝杆菌在宿主体内的演化与持续存在4例如，三酰甘油（TAG）的存在与北京谱系2-亚谱系的高毒力表型相关 M. tuberculosis 可能是因为其能够减弱宿主的免疫反应5,6其他相关脂质包括存在于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌中的脂寡糖（LOSs）。在以下情况下 Mycobacterium marinum，其细胞壁中脂寡糖（LOS）的存在与其滑行运动能力以及形成生物膜的能力相关，并可干扰巨噬细胞模式识别受体的识别，影响宿主吞噬细胞对细菌的摄取与清除7,8此外，某些脂质的缺失或存在可使同一物种的不同成员在与宿主细胞相互作用时表现出毒力或减毒特征，从而被划分为不同的形态型。例如，粗糙形态型中糖肽脂质（GPL）的缺失 脓肿分枝杆菌 与诱导吞噬体内部酸化以及随之发生的细胞凋亡能力相关9，而光滑型菌株的表面含有GPLs。此外，分枝杆菌细胞壁的脂质含量与其调控宿主免疫反应能力相关。这一点在利用某些分枝杆菌诱导针对不同疾病的保护性免疫应答时具有重要意义10,11,12,13. 例如，已有研究证明 Mycolicibacterium vaccae一种腐生性分枝杆菌，目前正处于作为结核病免疫治疗疫苗的III期临床试验阶段，表现出两种菌落形态型。含有表面聚酯的光滑型表型可触发Th2反应，而缺乏聚酯的粗糙型表型在与宿主免疫细胞相互作用时可诱导Th1反应。14分枝杆菌细胞中存在的脂质谱不仅取决于分枝杆菌的种类，还取决于分枝杆菌培养的条件：孵育时间15,16 或培养基的成分17,18事实上，培养基成分的改变会影响抗肿瘤和免疫刺激活性 M. bovis BCG 和 分枝杆菌属布鲁马埃菌体外实验17此外，由...引发的保护性免疫特征 M. bovis 卡介苗抗 M. tuberculosis 小鼠模型中的挑战也取决于所使用的培养基 M. bovis BCG 生长17这些结果可与不同培养条件下分枝杆菌的脂质组成相关联。基于上述原因，研究分枝杆菌的脂质含量具有重要意义。本文展示了一种用于提取和分析分枝杆菌细胞壁脂质组成的可视化实验方法。

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方案

1. 从分枝杆菌中提取总非共价结合脂质（图1）

  1. 从固体培养基上刮取0.2 g分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的玻璃试管中。加入5 mL氯仿和10 mL甲醇组成的溶液（氯仿:甲醇，1:2）。
    注意：使用有机溶剂时，必须使用玻璃容器，禁止使用塑料容器。此外，瓶子必须使用带PTFE衬垫的螺旋盖。
    警告：氯仿是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
    警告：甲醇是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  2. 将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。
    注意：若无轨道摇床，可尽可能频繁地进行定期手动搅拌以替代持续搅拌。
  3. 用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集至玻璃试管中。
  4. 使用氮气流蒸发试管中的液相。用氮气充满试管，盖好后于4 °C保存。
    注意：可将玻璃巴斯德吸管连接至氮气流，以精确对目标试管进行蒸发。此外，可将试管置于37 °C的干式恒温金属浴中。当溶剂完全蒸发后，在封闭前先用氮气充满试管。
  5. 向细胞残渣中加入15 mL氯仿:甲醇（2:1）溶液。将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。
    注意：若无轨道摇床，可尽可能频繁地进行定期手动搅拌以替代持续搅拌。
  6. 让混合物静置1小时。用巴斯德吸管回收有机溶剂。用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并收集至步骤1.3中 previously used 的同一玻璃试管中。使用氮气流蒸发试管中的液相。用氮气充满试管，盖好后再次于4 °C保存。

2. 通过酸性甲醇解提取分枝菌酸（图2A）

  1. 向一个带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的密闭玻璃管中加入 2–5 mL 酯化溶液。将 0.2 g 分枝杆菌生物量加入该玻璃管中。
    注意：酯化溶液由 30 mL 甲醇、15 mL 甲苯和 1 mL 硫酸混合而成。分枝杆菌细胞可来自固体培养物，或在提取分枝杆菌中全部非共价连接脂质后所得的脱脂细胞（步骤 1.6 过滤后剩余的细胞）。
    警告：甲苯为易燃且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
    警告：硫酸为腐蚀性且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  2. 通过涡旋混合内容物。将混合物置于 80 °C 干浴中静置过夜。
  3. 让试管冷却至室温，然后向试管中加入 2 mL 正己烷。涡旋振荡 30 秒以混合内容物，静置试管直至出现两个清晰的相层。
    警告：正己烷为潜在的易燃物，具有刺激性，对环境有害且高度危险。必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  4. 收集对应于正己烷相的上层相，并转移至新试管中。
  5. 重复步骤 2.3。再次收集上层相，并转移至步骤 2.4 中使用的同一试管中。
  6. 使用氮气气流吹干试管中的内容物。用氮气充满试管，密封后于 4 °C 保存。

3. 通过皂化和甲基化提取分枝菌酸（图2B）

  1. 从固体培养基上刮取 0.2 g 分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）螺旋盖的玻璃试管中。
  2. 加入 2 mL 含 5% 氢氧化钾的甲醇-苯溶液（80:20）。通过涡旋混合内容物。在 100 °C 下加热混合物 3 小时。
    警告：苯为易燃、致癌且有害物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  3. 让试管冷却至室温。加入 20% 硫酸将样品酸化至 pH = 1。
  4. 加入 3 mL 乙醚。通过涡旋轻轻混合内容物。
  5. 静置使两相分层。收集乙醚相并转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。
  6. 用 2 mL 蒸馏水洗涤乙醚提取物，将上层乙醚相转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。
  7. 在乙醚提取物中加入 2 g 无水硫酸钠以进行干燥。
  8. 过滤悬浮液。使用氮气流吹干内容物。
  9. 进行甲基化步骤时，将 3 g N-亚硝基-N-甲基脲溶解于预冷的溶液中，该溶液由 45 mL 乙醚和 9 mL 40% 氢氧化钾水溶液组成。
    警告：N-亚硝基-N-甲基脲为有毒、刺激性、致癌且有害物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  10. 将上清液（重氮甲烷）转移至另一已置于冰中冷却的烧瓶中，烧瓶内含氢氧化钾颗粒（约 30 g）。
    注意：若上清液未立即使用，可在 -20 °C 下保存最多 1 小时。
    警告：氢氧化钾颗粒为刺激性和腐蚀性物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
    警告：重氮甲烷具有高毒性且可能爆炸，必须在配备安全玻璃的层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。
  11. 将步骤 3.10 中获得的含重氮甲烷的 2 mL 乙醚溶液加入步骤 3.8 中获得的含分枝菌酸的干燥乙醚提取物中。在室温下孵育 15 分钟。
  12. 在 40 °C 下蒸发悬浮液。用氮气充满试管，密封后于 4 °C 保存甲基化脂质。
    ​注意：在层流罩中将乙醚溶液中的重氮甲烷完全蒸发，直至乙醚失去黄色。

4. 薄层色谱（TLC）分析

  1. 使玻璃薄层色谱（TLC）展开槽充分饱和。为此，将一张滤纸贴在TLC展开槽的一侧内壁上，并使其与由混合溶剂组成的流动相接触。将剩余的溶剂倒入TLC展开槽底部。
    注意：TLC展开槽底部必须至少覆盖1 cm深的流动相。在本实验中，使用了不同的流动相来展开TLC板。这些流动相包括：85 mL正己烷加15 mL乙醚；100 mL二氯甲烷；90 mL氯仿、10 mL甲醇和1 mL水；30 mL氯仿加8 mL甲醇和1 mL水；60 mL氯仿加35 mL甲醇和8 mL水；95 mL氯仿加5 mL甲醇；以及90 mL石油醚（60-80 °C）加10 mL乙醚。
    注意：在二维TLC分析中，第一向使用正己烷:丙酮（95:5）展开三次，第二向使用甲苯:丙酮（97:3）单次展开，用于分析分枝菌酸组成。分析磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIMs）时，第一向使用氯仿:甲醇:水（60:30:6）展开一次，第二向使用氯仿:乙酸:甲醇:水（40:25:3:6）展开。分析分枝菌酸二酯（PDIM）和阿拉伯半乳聚糖（AG）时，第一向使用石油醚（60-80 °C）:乙酸乙酯（98:2）展开三次，第二向使用石油醚（60-80 °C）:丙酮（98:2）单次展开。
    警告：乙醚为潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：二氯甲烷为潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：石油醚为易燃、对环境有害且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：乙酸为易燃且具有腐蚀性的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：乙酸乙酯为易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：丙酮为易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
  2. 关闭TLC展开槽，使其饱和至少20分钟。在此期间，将玻璃试管中的脂质溶解于0.2–1 mL氯仿中。
    注意：溶解脂质所用体积可根据样品预期浓度进行调整。
  3. 使用毛细玻璃管将每种悬浮液各取10 µL直接点样于TLC板上，并在室温下干燥5分钟。
    注意：样品应点在板的底部区域，两侧各留出1 cm空间。各样品点之间应至少间隔0.5 cm。样品点样完成后，试管可用氮气再次吹干，并于4 °C保存以备后续使用。
  4. 将TLC板插入含有流动相的饱和展开槽中，使流动相沿板展开。
    注意：任何对TLC展开槽的移动都会影响板上溶剂的运行，进而影响脂质的迁移。若进行二维TLC分析，则需要两个TLC展开槽分别容纳两种洗脱体系。
  5. 当溶剂前沿距离TLC板顶端约1 cm时，取出TLC板，并置于层流条件下直至硅胶完全干燥。
    注意：若分析分枝菌酸组成并使用正己烷:乙醚（85:15）作为流动相， 需重复步骤4.4和4.5两次，共进行三次展开。
  6. 使用所需的显色剂显色；如需加热，则对TLC板加热。
    注意：在本实验中，使用15–20 mL以下溶液喷雾显色：10%磷钼酸水合物乙醇溶液，喷至板面呈亮黄色，随后在120 °C加热；5% α-萘酚乙醇溶液（由20% α-萘酚硫酸溶液配制） 喷雾后于120 °C加热；钼蓝试剂（4.2 M硫酸中含1.3%三氧化钼），喷至出现磷酸酯条带，或使用1%蒽酮硫酸溶液显色。
    警告：磷钼酸水合物为易燃且具腐蚀性的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：乙醇为潜在易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：1-萘酚为易燃、具腐蚀性且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。
    警告：钼蓝喷雾试剂为具腐蚀性、有毒且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。

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结果

为了展示不同分枝杆菌种类中存在的多种脂质，选择了粗糙型且生长缓慢的牛分枝杆菌BCG（M. bovis BCG），并加入了粗糙型且生长迅速的堪萨斯分枝杆菌（M. fortuitum）和布鲁马埃分枝杆菌（M. brumae），最后还包括了脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的光滑型菌落形态。这四种菌种使我们能够观察到一系列来源于分枝杆菌的脂质，例如酰基海藻糖（AT）、糖脂（GPLs）、邻苯二甲酸二异丙酯（PDIM）、苯酚糖脂（PGL）、磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）、分枝菌酸二阿拉伯半乳聚糖（TDM）和分枝菌酸单阿拉伯半乳聚糖（TMM）。此外，这四种菌种具有不同的分枝菌酸图谱。

完成分枝菌酸提取实验步骤后，采用两种不同但同样有效的洗脱体系，通过一维薄层色谱（1D-TLC）对脂质提取物进行分析（图3A，B）。第一种流动相（图3A）由正己烷与乙醚（85:15）组成，...

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讨论

本文介绍了一种提取分枝杆菌细胞壁中非共价连接脂质化合物的简单方案，该方法被视为金标准。此外，还展示了从四种不同分枝杆菌提取的脂质通过一维和二维薄层色谱（TLC）进行的进一步可视化结果。

连续使用两种氯仿与甲醇的混合液来提取分枝杆菌细胞中的脂质成分，是目前最广泛使用的溶剂组合23,24,25,26,27,28,29。该混合液能够从细胞中回收多种非极性和极性脂质。然而，文献中也已报道其他用于提取总脂质或特定分枝杆菌脂质的方法，Hameed 等人近期对此进行了综述29。例如，Fol...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由西班牙科学、创新与大学部（RTI2018-098777-B-I00）、欧洲区域发展基金（FEDER Funds）以及加泰罗尼亚自治区政府（2017SGR-229）资助。Sandra Guallar-Garrido 获得了加泰罗尼亚自治区政府提供的博士研究生合同（FI）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Merck100063注意。用于分析的无水乙酸 EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
丙酮Carlo Erba400971N注意。丙酮 RPE-ACS-ISO 用于分析，1000 ml
蒽酮Merck8014610010用于合成的蒽酮。
苯Carlo Erba426113注意。苯 RPE - 用于分析 - ACS，2.5 L
毛细玻璃管MerckBR708709BRAND® 一次性 BLAUBRAND® 微量移液管，intraMark
氯仿Carlo Erba412653注意。氯仿 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 以乙醇稳定，2.5 L
干燥块式加热器J.P. Selecta7471200
二氯甲烷Carlo Erba412622注意。二氯甲烷 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 以烯烃稳定，2.5 L
乙醚Carlo Erba412672注意。乙醚 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 未稳定，2.5 L
乙酸乙酯Panreac1313181211注意。乙酸乙酯（Reag. USP, Ph. Eur.）用于分析，ACS, ISO
无水乙醇Carlo Erba4146072注意。无水乙醇 RPE - 用于分析 - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP，1 L
玻璃漏斗VidraFOCDURA.2133148 1217/1
玻璃试管VidraFOCVFOC.45066A-16125带聚四氟乙烯（PTFE）盖的玻璃试管
甲醇Carlo Erba412722注意。甲醇 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- GOLD - 超梯度级，2.5 L
钼磷酸水合物Merck51429-74-4注意。
钼蓝喷雾试剂，1.3%SigmaM1942-100ML注意。
正己烷Carlo Erba446903注意。正己烷 99% RS - ATRASOL - 用于痕量分析，2.5 L
N-亚硝基-N-甲基脲SigmaN4766注意
轨道摇床平台DDBiolab995018NB-205L 台式摇床培养箱
石油醚（60-80ºC）Carlo Erba427003注意。石油醚 60 - 80°C RPE - 用于分析，2.5 L
喷雾器VidraFOC712/1
无水硫酸钠Merck238597
硫酸 95-97%Merck1007311000注意。硫酸 95-97%
TLC 展开槽MerckZ204226-1EA矩形薄层层析（TLC）展开槽，完整尺寸 L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC 板Merck1057210001TLC 硅胶60- 20x20 cm x 25 u
TLC 板加热器CAMAG223306CAMAG TLC 板加热器 III
甲苯Carlo Erba488551注意。甲苯 RPE - 用于分析 - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP，1 L
涡旋振荡器Fisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-萘酚Sigma-Aldrich102269427注意。

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