薄层色谱分析分枝杆菌的脂质成分

Summary

提出一个协议，以提取各种分枝杆菌细胞壁的总脂质含量。此外，还显示了不同类型的肌酸的萃取和分析协议。还提供了一个薄层色谱协议来监测这些分形化合物。

Abstract

分枝杆菌物种在生长速度、色素递迫存在、固体介质上显示的群落形态以及其他表型特征方面可能各不相同。然而，它们都有一个共同的分枝杆菌最相关的特征:它独特的高度疏水细胞壁。分枝杆菌物种含有一种膜-共价连结复合物，包括阿拉比诺甘丹、多肽和长链的支肠酸，其类型不同于分枝杆菌物种。此外， 肌菌还可以在其细胞表面产生位于非共价链接的脂质，如邻苯二甲酸二酯（PDIM）、酚甘油脂（PGL）、甘油脂（GPL）、乙酰三聚醇（AT）或磷脂二恶英（PIM）等。其中一些被认为是致病性分枝杆菌的毒性因素，或宿主-分枝杆菌相互作用中的关键抗原脂。由于这些原因，对支点血脂的研究有着极大的兴趣，因为这种脂质在几个领域得到应用，从了解它们在分枝杆菌感染致病性中的作用，到可能暗示它们是治疗传染病和其他疾病（如癌症）的免疫调节剂。在这里，提出了一个简单的方法来提取和分析总脂质含量和用有机溶剂混合物生长在固体介质中的分枝杆菌细胞的肌酸成分。获得脂质提取物后，将执行薄层色谱 （TLC） 来监测提取的化合物。该示例实验采用四种不同的分枝杆菌进行:环境快速增长的肌 杆菌布鲁马和支原体杆菌， 生长缓慢的 肌杆菌博维斯 杆菌Calmette-Guérin（BCG）和机会型病原体快速生长的分 枝杆菌脓肿， 表明本协议中显示的方法可用于广泛的分枝杆菌。

Introduction

Mycobacterium 属包括致病性物种和非致病性物种，其特点是具有由其特有的脂质形成的高度疏水性和不透水性细胞壁。具体来说，分枝杆菌细胞壁含有霉菌酸， 这是α-烷基和β-羟基脂肪酸，其中α分支是恒定的所有肌酸（长度除外）和β链，称为中分子链，是一个长的碱性链，可能包含不同的功能化学组描述与文献（α，α'-，甲氧基， [-，环氧树脂，卡盒-和+-1-甲氧-肌酸），因此产生七种类型的肌酸（I-VII）¹.此外，其他具有毫无疑问重要性的脂质也存在于分枝杆菌物种的细胞壁中。致病物种，如 Mycobacterium tuberculosis, 结核病的致病剂² 产生特定的脂基毒性因子，如邻苯二甲酸二甲酸酯 （PDIM）、酚类糖脂 （PGL）、二、三和五氯乙酰丙烯酸酯 （DAT、TAT 和 PAT） 或硫化物等³.它们在分不育表面的存在与改变宿主免疫反应的能力有关，因此，宿主内部的分不分母的进化和持久性⁴.例如，三乙基甘油 （TAG） 的存在与血统 2- 北京子谱的超病毒表型有关 M. tuberculosis, 可能是因为它能够减弱宿主的免疫反应^5,6.其他相关的脂质是结块状和....

Protocol

1. 从分枝杆菌中提取总非同价相关脂质（图1）

1. 从固体介质中划出 0.2 克分枝杆菌，并加入带多氟乙烯 （PTFE） 衬里螺丝帽的玻璃管。添加由 5 mL 氯仿和 10 mL 甲醇（氯仿:甲醇，1:2）组成的溶液。
   注:使用有机溶剂时，只应使用玻璃接收器。不允许使用塑料容器。此外，需要为瓶子的PTFE衬里螺丝帽。
   警告:氯仿是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
   警告:甲醇是一种潜在的有毒和极其危险的物质。它必须使用层压流罩，佩戴适当的个人防护设备（实验室外套、防护眼镜和亚硝酸盐手套）。
2. 将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
   注:如果没有轨道摇晃平台，可以尽可能频繁地用周期性手动搅拌取代恒定搅拌。
3. 用滤纸盖住玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集在玻璃管中。
4. 使用氮气通量蒸发管中的液相。在管子中填充氮气，盖上盖子，将其储存在 4 °C 下。
   注:将玻璃巴斯德移液器连接到氮气流中，以专门蒸发所需的管子。此外，在 37 °C 的干块加热器内保持管子。 当溶剂蒸发时，在关闭管子之前，先用氮气填充管子。
5. 在细胞碎屑中加入 15 mL 的氯仿溶液:甲醇 （2:1）。将管子在持续搅拌中过夜，从分不育细胞表面提取非共价相关脂质。
   注:如果没有轨道摇晃平台，....

Results

为了显示不同分枝杆菌物种中的各种脂质 ，M. bovis BCG 被选中，因为它是粗糙和生长缓慢的分枝杆菌。在手术中增加了粗糙和快速增长的 M.偶然 和 M.布鲁马 ，最后，也包括 了M.脓肿 的光滑的死型。这四个物种使我们能够可视化广泛的分枝杆菌衍生脂质，如乙酰链球菌（AT）、GPL、PDIM、PGL、PIM、TDM和TMM。此外，所有四个物种都有不同的肌酸模式。

在执行肌酸提取协议后，通过两种不同、同样有效的脱脂系统（图3A，B）通过1D-TLC分析脂质提取物进行分析。第一个移动相（图3A）由n-六烷和二乙醚（85:15）组成，板运行三次。第二个移动相由100%的二氯甲烷组成，板块被拉起一次（图3B）。在这两个系统中，从样品应用的起源出发，肌酸大约位于 TLC 板的中间。图

Discussion

提出了一个简单的协议，被认为是从分不育细胞壁中提取非高血脂化合物的黄金标准方法。显示从四种不同分枝杆菌提取的脂质中，一维和二维 TLC 的进一步可视化。

氯仿和甲醇连续两次结合混合物来恢复支核细胞的脂质含量，是使用最广泛的溶剂混合物23、24、25、26、27、28、29。这种混合物允许从细胞中恢复广泛的极性和极性脂质。然而，文献中还描述了提取全部或特定的分体脂质的其他方法，哈米德等人最近对此进行了^审查。例如，Folch 方法是开发用于从^组.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
醋酸默	克	100063	注意。无水分析 EMSURE®ACS，ISO，Reag.Ph Eur
丙酮	Carlo Erba	400971N	注意。用于分析的丙酮 RPE-ACS-ISO ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone。
苯	Carlo Erba	426113	注意。苯 RPE - 用于分析 - ACS 2.5 l
毛细管玻璃管	Merck	BR708709	BRAND® 一次性 BLAUBRAND® 微量移液器，intraMark
Chloroform	Carlo Erba	412653	注意。氯仿 RS - 用于 HPLC - 等度级 - 用乙醇稳定 2.5 L
干体加热器	J.P. Selecta	7471200
二氯甲烷	Carlo Erba	412622	注意。二氯甲烷 RS - 用于 HPLC - 等度级 - 用 2.5 L 戊烯稳定
	Carlo Erba	412672	注意。二乙醚 RS - 用于 HPLC - 等度级 - 不稳定的 2.5 L
乙酸乙酯	Panreac	1313181211	注意。乙酸乙酯 （Reag.USP，欧洲博士。如需分析，ACS、ISO
Ethyl Alcohol Absolute	Carlo Erba	4146072	注意。乙醇无水 RPE - 分析用 - ACS - Reag.欧洲博士 - Reag.USP 1 L
玻璃漏斗	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
玻璃管	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	带 PTFE 回收盖的玻璃管
甲醇	Carlo Erba	412722	注意。甲醇 RS - 用于 HPLC - 金 - 超梯度级 2.5 L
钼磷酸水合物	Merck	51429-74-4	注意。
钼蓝喷雾试剂，1.3%	Sigma	M1942-100ML	注意。
正己烷	Carlo Erba	446903	注意。正己烷 99% RS - ATRASOL - 用于痕量分析 2.5 升
正亚硝基-n-甲基脲	Sigma	N4766	注意
轨道摇动平台	DDBiolab	995018	NB-205L 台式摇动培养箱
石油醚 （60-80ºC）	Carlo Erba	427003	注意。石油醚 60 - 80°;C RPE - 用于分析 2.5 L
喷雾器	VidraFOC	712/1
无水硫酸钠	Merck	238597
硫酸 95-97%	Merck	1007311000	注意。硫酸 95-97%
TLC 室	Merck	Z204226-1EA	矩形 TLC 显影罐，完整的 L & 次;H 倍（& 次）;宽 22 厘米 & 次;22 厘米 & 次10 cm
TLC 板	Merck	1057210001	TLC 硅胶 60- 20x20 cm x 25 u
TLC 板加热器	CAMAG	223306	CAMAG TLC 平台加热器 III
甲苯	Carlo Erba	488551	注意。甲苯 RPE - 用于分析 - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur.- Reag.USP 1 L
涡旋	费舍尔科学	10132562	IKA Agitador IKA vórtex 3
1-萘酚	Sigma-Aldrich	102269427	注意。