体外分析E3泛素连接酶功能

摘要

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌 培养。

摘要

泛素（Ub）共价连接至底物蛋白内部的赖氨酸残基，这一过程称为泛素化，是真核生物中最重要的一类翻译后修饰。泛素化由三类酶依次级联催化完成，包括泛素激活酶（E1酶）、泛素结合酶（E2酶）和泛素连接酶（E3酶），有时还包括泛素链延伸因子（E4酶）。此处， 体外 提供了泛素化检测的实验方案，可用于评估E3泛素连接酶活性、E2与E3配对之间的协同作用以及底物选择。通过监测游离多聚泛素链的生成和/或E3连接酶的自泛素化，可筛选协同作用的E2-E3配对。E3连接酶对底物的特异性结合决定了底物的泛素化，并可通过蛋白质印迹法进行检测。 体外 反应。此外，还描述了一种E2~Ub释放实验，该方法是直接评估E2与E3功能协同作用的有效工具。在此实验中，可追踪E3依赖性的泛素从相应的E2酶转移至游离的赖氨酸氨基酸（模拟底物泛素化）或E3连接酶自身内部的赖氨酸位点（自泛素化）。综上所述，三种不同的 体外 提供了快速且易于操作的实验方案，用于研究E3连接酶的催化功能。

引言

泛素化是指泛素（Ub）共价连接到底物蛋白的过程¹泛素化修饰由三种不同酶类连续催化的酶促反应完成， 即泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）以及可能的泛素链延伸因子（E4s）^2,3,4,5. 在三磷酸腺苷（ATP）和镁（Mg²⁺依赖ATP的Ub激活过程中，E1酶的活性位点半胱氨酸攻击Ub的C末端甘氨酸，形成硫酯复合物（Ub~E1）。ATP水解所提供的能量使Ub进入高能过渡态，并在后续的酶级联反应中维持该状态。随后，E2酶将其内部的催化半胱氨酸接受活化的Ub，形成短暂的Ub~E2硫酯键。最终，Ub被转移至底物蛋白。

这可以通过两种方式实现。一种是E3连接酶首先与E2结合，另一种是E3连接酶直接与泛素（Ub）结合。后一种方式会形成E3~Ub中间体。无论哪种情况，泛素均通过其C末端羧基与底物蛋白的赖氨酸ε-氨基之间形成异肽键，从而与底物蛋白共价连接⁶。人类基因组编码两种E1酶、约40种E2酶以及超过600种可能的泛素连接酶⁷。根据E3酶介导的泛素转移机制，泛素连接酶可分为三类：与E6AP C末端同源（HECT型）、真正有趣的新型基因（RING）/U-box型以及RING间RING（RBR型）连接酶⁸。本研究中，选用含有U-box结构域的连接酶——热休克蛋白70相互作用蛋白C末端（CHIP）作为代表性E3酶。与形成Ub~E3硫酯键的HECT型E3酶不同，CHIP的U-box结构域可结合E2~Ub复合物，并促进泛素从E2酶直接转移至底物蛋白^8,9。鉴于U-box结构域对酶功能的重要性，本研究使用一种无活性的CHIP U-box突变体CHIP(H260Q)作为对照。CHIP(H260Q)无法与其对应的E2酶结合，因而丧失E3连接酶活性¹⁰。

蛋白质泛素化在调控真核细胞中多种细胞事件中起着关键作用。泛素分子可逆地连接至底物蛋白，从而引发多样的细胞效应，这种多样性可归因于泛素的分子特性。由于泛素自身含有七个可用于进一步泛素化的赖氨酸（K）残基，因此可形成多种不同大小和/或拓扑结构的泛素链类型¹¹例如，底物可在单个赖氨酸位点被单个泛素分子修饰（单泛素化），或在多个赖氨酸位点被多个泛素分子修饰（多单泛素化），甚至可被泛素链修饰（多聚泛素化）¹¹泛素链可通过相同或不同的泛素赖氨酸残基以同型或异型方式形成，甚至可形成分支状泛素链⁹因此，蛋白质泛素化导致泛素分子形成多种多样的排列方式，从而提供特定的生物学信息， 例如用于共价结合蛋白的降解、活化或定位^12,13这些不同的泛素信号能够快速重编程细胞信号通路，这是细胞响应不断变化的环境需求的重要前提。

泛素化的一个核心作用与蛋白质质量控制相关。错误折叠或不可逆损伤的蛋白质必须被降解，并由新合成的蛋白质取代，以维持蛋白质稳态（proteostasis）。¹⁴质量控制E3连接酶CHIP与分子伴侣协同作用，介导受损蛋白质的泛素依赖性降解^9,15,16,17此外，CHIP 调控肌球蛋白定向伴侣蛋白 UNC-45B（Unc-45 同源物 B）的稳定性，该过程与肌肉功能紧密协调，其水平偏离最佳范围可导致人类肌病^18,19,20,21. 26S蛋白酶体通过K48连接的多聚泛素链介导UNC-45B的降解⁹在缺乏底物蛋白的情况下，CHIP 会进行自泛素化^10,22,23，这是RING/U-box E3泛素连接酶的特征^24,25 并被认为可调节连接酶活性²⁶应用 体外 本文所述的泛素化检测方法有助于系统性地鉴定与CHIP协同作用的E2酶，以促进游离多聚泛素链的形成和/或CHIP的自泛素化（方案部分2）。此外，还观察到CHIP依赖性的UNC-45B泛素化，该蛋白是已知的E3连接酶底物^18,19 （方案第3部分）。最终检测了依赖CHIP的活化泛素从泛素~E2硫酯键向下游分子的转移（方案第4部分）。

方案

1. 缓冲液和试剂的准备

注意：以下列出的是在实验室中手动配制的缓冲液和试剂。方案中使用的其他所有缓冲液和试剂均购自不同供应商，并按照生产商的说明使用。

1. 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）。为此，将1.37 M氯化钠（NaCl）、27 mM氯化钾（KCl）、80 mM二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·2H₂O）和1.5 mM磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶于去离子水中，调节pH至7.4，室温保存。₂HPO₄0.2 H₂O) 和 20 mM 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄) 加入1升双蒸水₂O (ddH₂O)₂O）。高压灭菌10x PBS，并用ddH₂O配制1x PBS溶液₂O.
   1. 在121 °C和98.9 kPa条件下进行高压灭菌15分钟。
      注意：所有缓冲液和溶液均在此条件下进行高压灭菌。若无特殊说明，溶液于室温（RT）保存。
2. 通过向1 L的1x PBS中加入0.1% Tween，制备1 L的PBS-Tween（PBS-T）溶液。
3. 通过将 L-赖氨酸溶解于 ddH₂O 中，配制 10 mL 0.5 M L-赖氨酸储备液。₂O. 将L-赖氨酸分装为1 mL等份，于-20 °C保存备用。
   注意：L-赖氨酸可反复冻融。
4. 配制0.25 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液：将EDTA溶解于200 mL去离子水中₂O.
   1. 用氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 8.0。
   2. 用ddH₂O定容至250 mL₂O.
   3. 对溶液进行高压灭菌。
5. 配制10 mL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，将BSA溶解于ddH₂O中₂O. 以200 µL分装，于-20 °C保存。
   注意：BSA 可以反复冻融。
6. 配制 1 L 的 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) 运行缓冲液：将 50 mM MES、50 mM Tris 碱、3.47 mM 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和 1.03 mM EDTA 溶于 0.9 L 去离子水 (ddH₂O) 中₂O. 充分混匀后，定容至 1 L。
   1. 1x 缓冲液的 pH 值为 7.6。请勿使用酸或碱调节 pH 值。
7. 配制200 mL封闭液（5%脱脂奶粉），即将10 g脱脂奶粉溶解于1×PBS-T中。封闭液于4 °C保存，可使用一周。
8. 配制 1 L 转膜缓冲液（参见 材料表按照制造商的说明进行。
9. 通过将125 mM Tris碱、4% SDS、4%甘油、0.03%溴酚蓝和50 µL/mL β-巯基乙醇溶解于50 mL ddH₂O中，配制2×SDS上样缓冲液。₂O. 分装为每份1 mL，-20 °C保存备用。

2. 体外 自身泛素化实验

1. 检测的准备与实施
   1. 根据蛋白质的给定摩尔浓度及蛋白溶液的实际浓度，计算每个反应所需各试剂的体积。每个自泛素化反应中使用 100 nM E1、1 µM E2、1 µM E3 和 50 µM Ub。用 ddH₂O 将反应体系调整至 20 µL。
      注意：ATP 溶液和泛素化缓冲液以 10x 储存液形式购入，使用时稀释为 1x。
   2. 为所有反应制定移液方案。测试九种不同的 E2 酶在以下三种条件下的功能活性：(I) 与 CHIP 联合使用，(II) 与催化失活的 CHIP(H260Q) 突变体联合使用，(III) 不添加 CHIP 的独立泛素化反应中。
   3. 为避免移液误差，在冰上配制主混合液（master mix），其体积应满足所有反应所需并额外增加一个反应的量。计算每个反应所需的主混合液体积。
      注意：主混合液的组分是每个反应中均等需要的试剂，i.e.，E1、E3、Ub、ATP 和泛素化缓冲液。
   4. 向聚合酶链式反应（PCR）管中加入 ddH₂O 和主混合液。保持试管置于冰上。
   5. 在加入 E2 酶启动泛素化反应前，设置 PCR 热循环仪程序如下：37 °C 孵育 2 小时，随后 4 °C 无限期保持。
   6. 向各对应试管中加入 1 µM 的 E2 酶，并将样品放入 PCR 热循环仪中孵育指定时间。
   7. 2 小时后，向每个反应体系中加入 SDS 上样缓冲液，并通过反复吹打数次混匀。
      注意：所需上样缓冲液体积取决于其储存浓度。此处，向每个反应中加入 20 µL 的 2x SDS 上样缓冲液。
   8. 立即在 95 °C 下煮沸样品 5 分钟，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。将变性后的蛋白质样品储存于 -20 °C。
2. 凝胶电泳与蛋白质印迹
   1. 解冻后，将样品短暂离心约 10 秒，然后上样至 SDS-PAGE 凝胶。使用蛋白分子量标记物作为大小参照。
      注意：此处使用 4–12% Bis-Tris 梯度凝胶，蛋白分子量标记物上样量为 3 µL。将样品体积均分，每块凝胶上样 20 µL，共使用两块凝胶。
   2. 以 160–200 V 电压电泳约 30–45 分钟，直至样品前沿迁移至凝胶底部。
   3. 将每块凝胶转移至盛有半干转印缓冲液的塑料容器中，室温孵育 2–5 分钟。去除浓缩胶。
   4. 为每块 SDS 凝胶准备两片与凝胶大小相同的转印滤纸和一张硝酸纤维素膜，并预先在半干转印缓冲液中浸泡。在转印槽中自下而上组装蛋白质印迹（WB）“三明治”结构：转印滤纸、硝酸纤维素膜、SDS-PAGE 凝胶、转印滤纸。
   5. 去除“三明治”各层之间可能夹带的气泡。为此，使用滚轮轻轻滚动数次。
   6. 盖上转印槽盖，使多余的转印缓冲液排出。
   7. 将转印槽放入相应的转印装置中，采用以下程序进行半干转印：25 V，1.0 A，30 分钟。
   8. 将转印后的膜转移至盛有封闭液的塑料容器中，室温孵育 30 分钟。
   9. 将一抗加入含封闭剂的 10 mL PBS-T 溶液中，配制一抗溶液（参见材料表）。
      注意：一抗的工作浓度因抗体而异。本实验中，单克隆小鼠抗泛素抗体以 1:5,000 稀释使用；第二块凝胶则使用单克隆兔抗-CHIP 抗体，以 1:5,000 稀释于 PBS-T/封闭剂中。
   10. 用一抗溶液替换封闭液，于 4 °C 摇床上孵育过夜。
   11. 用 PBS-T 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
   12. 将相应的二抗加入 10 mL PBS-T 溶液中，配制二抗溶液。
       ​注意：此处使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体和鼠抗兔抗体，均以 1:10,000 稀释。
   13. 将膜在二抗溶液中于室温摇床上孵育 1 小时。
   14. 用 PBS-T 洗涤膜三次，每次 5 分钟。
3. 数据分析
   1. 根据制造商说明，向洗涤后的膜上添加用于辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体的蛋白质印迹检测试剂，并使用 X 射线胶片或电荷耦合器件相机捕获 HRP 信号（图 1）。

3. 体外 底物泛素化检测

1. 检测的准备与实施
   1. 根据蛋白质的给定摩尔浓度及蛋白溶液的实际浓度，计算每个反应所需各试剂的体积。每个底物泛素化反应中使用 100 nM E1、1 µM E2、1 µM E3、1 µM 底物和 50 µM Ub。使用 10x ATP 溶液和 10x 泛素化缓冲液，使其终浓度为 1x。用 ddH₂O 将底物泛素化反应体系调整至 20 µL。
   2. 为所有反应制定移液方案。应包含适当的对照反应，以验证底物的泛素化依赖于 E3。以蛋白 UNC-45B 作为 CHIP 的代表性底物，使用催化失活的 CHIP 突变体（H260Q）作为对照。准备以下反应体系：E1、E2、Ub 混合液（包含 Ub、ATP 和泛素化缓冲液）；E1、E2、Ub 混合液、UNC-45B；E1、E2、Ub 混合液、CHIP(H260Q)、UNC-45B；以及 E1、E2、Ub 混合液、CHIP、UNC-45B。
   3. 为避免移液误差，于冰上配制主混合液，其体积应满足所有反应所需并额外增加一个反应的量。计算每个反应所需的主混合液体积。
      注：本检测的主混合液组分包括 E1、E2、Ub、ATP 和泛素化缓冲液。
   4. 按以下顺序加入反应组分：ddH₂O、底物、E3 连接酶。
   5. 在加入主混合液启动泛素化反应前，设置 PCR 仪的程序如下：37 °C 孵育 2 小时，随后 4 °C 无限期保持。
   6. 将主混合液加入各管中，并将样品置于 PCR 仪中按指定时间孵育。
   7. 反应 2 小时后，向每个反应体系中加入 2x SDS 上样缓冲液，并通过反复吹打混匀数次。
   8. 反应结束后，立即在 95 °C 下煮沸样品 5 分钟，随后进行 PAGE 分析。或者，可将变性后的蛋白样品储存于 -20 °C。
2. 凝胶电泳与蛋白质印迹
   1. 按照第 2.2 节所述方法进行凝胶电泳和蛋白质印迹。分别使用特异性抗体检测底物和 E3 连接酶。
      注：此处 UNC-45B 融合了来源于 c-myc 基因产物的多肽标签，因此可使用单克隆小鼠抗-MYC 抗体进行检测。抗-MYC 抗体使用稀释比例为 1:10,000。
3. 数据分析
   1. 按照第 2.3 节所述方法进行数据分析（图 2）。

4. 赖氨酸释放实验

1. 实验准备与操作
   1. E1酶介导E2酶与泛素（Ub）的结合
      1. 根据各蛋白质的摩尔浓度及蛋白溶液的实际浓度，计算每反应所需各试剂的体积。每个结合反应中使用2 µM E1、4 µM E2和4 µM 无赖氨酸泛素（Ub K0）。10x ATP和10x 泛素化缓冲液按1x终浓度使用。用ddH₂O将结合反应体系调整至20 µL。
         注意：使用无赖氨酸的Ub K0突变体可确保仅生成单泛素化的E2。也可使用野生型Ub，但可能导致E2出现多种修饰形式（例如，E2的多聚泛素化），分析更为困难。首次使用或使用新的E2酶时，应确定E1介导E2泛素化结合的效率。可通过考马斯亮蓝染色比较未结合与已结合Ub的E2条带以评估结合产率。在此条件下，当UBE2D2与Ub K0以等摩尔比使用时，约一半的Ub K0可稳定地转化为UBE2D2~Ub（补充图S2A）。
      2. 制定结合反应的加样方案。根据后续选择的释放反应调整结合反应的总体积，例如，分别在独立的释放反应中使用CHIP和CHIP(H260Q)。因此，应准备单个结合反应两倍体积的反应液。
         注意：首次使用时，建议测试不同浓度的E3连接酶以确定最佳释放条件，并通过Western blot进行分析。理想情况下，Ub从E2上的释放将随时间逐渐增加，直至E2~Ub蛋白条带完全消失。
      3. 在37 °C孵育结合反应15分钟。
   2. 终止结合反应
      1. 通过加入apyrase至终浓度1.8 U/mL终止结合反应。室温下继续孵育5分钟，随后加入EDTA至终浓度30 mM。用ddH₂O将反应体系调整至30 µL。
         注意：apyrase用于将ATP分子转化为ADP（二磷酸腺苷）分子。由于E1酶的活性依赖于ATP，因此E1无法继续催化E2的泛素化。此外使用EDTA可螯合E1所需的辅助因子Mg²⁺离子，进一步确保E1被抑制。终止反应所需的apyrase体积可能因实验条件而异。尽管仅使用apyrase即可有效消耗ATP，但在E1-UBE2D2配对中，apyrase与EDTA联用对终止结合反应更为有效。 由于反应终止是实验可重复性的关键因素，应对新的E1-E2配对测试其终止效率。为此，可设置一个结合反应，终止后在特定时间点（例如，2、5、10和15分钟）取样。若E2~Ub水平保持不变，则表明反应已完全停止，且硫酯键在此期间保持稳定（补充图S2B）。
   3. E3介导E2~Ub的释放
      1. 准备四个对应不同时间点（t_0, t_1, t_2, t₃）的离心管，每管中加入非还原性上样缓冲液（4x 十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液，6.7 µL）。
         注意：样品缓冲液中不得添加还原剂。
      2. 从已终止的结合反应中取出6 µL作为t₀样品， 并用ddH₂O将体积调整至20 µL。
      3. 将t₀样品在70 °C孵育10分钟。
         注意：避免延长孵育时间导致样品沸腾，因硫酯键在较高温度下不稳定。
      4. 计算每个释放反应所需各试剂的体积。使用剩余的24 µL已结合Ub的E2，加入10 mM L-赖氨酸、1 mg/ml BSA和500 nM E3连接酶。泛素化缓冲液按1x终浓度使用，并用ddH₂O将反应体系调整至80 µL。
      5. 为所有释放反应制定加样方案，并同时使用CHIP(H260Q)作为对照，以及CHIP(WT)。
      6. 在冰上设置释放反应，按以下顺序依次加入各组分：ddH₂O、泛素化缓冲液、BSA、赖氨酸、E3连接酶，最后加入已结合Ub的E2以启动反应。
      7. 在室温下孵育释放反应。
      8. 分别在5、30和60分钟时取样，将20 µL释放反应液转移至相应的样品管中。
         注意：适合有效监测释放过程的时间点可能因E2-E3配对而异。
      9. 立即涡旋混匀样品，并在70 °C孵育10分钟。
      10. 直接进行PAGE电泳。
          注意：即使在样品缓冲液中变性后，E2~Ub硫酯键仍可能不稳定。因此，应在实验完成后立即进行凝胶电泳。
2. 凝胶电泳与Western blot
   1. 按照第2.2节所述方法进行凝胶电泳和Western blot。使用特异性识别泛素的抗体；若条件允许，同时使用在不同物种中制备的E3特异性抗体，以便同时检测泛素和E3连接酶信号。
3. 数据分析
   1. 按照第2.3节所述方法进行数据分析（图3）。

结果

为了鉴定与泛素连接酶CHIP协同作用的E2酶，对一组E2候选蛋白进行了 individually 测试 体外 泛素化反应。通过检测依赖于E3的泛素化产物的形成来监测协同作用的E2-E3配对。 即E3连接酶的自泛素化以及游离泛素多聚体的形成。通过蛋白质印迹法分析泛素化产物。结果解读基于所得蛋白条带与分子量标记物的大小比较。蛋白质泛素化导致特异性条带模式的出现，其特征为双条带或多条重复条带，相邻条带间分子量差异约为8.6 kDa（即单个泛素分子的大小）。

在此，检测了九种E2在野生型CHIP存在下促进泛素化产物形成的能力图1A)，无活性的U-box突变体CHIP(H260Q)（图1B），或无CHIP（补充图 S1）。在无活性CHIP存在或缺失CHIP的情况下均形成了不依赖E3的泛素化产物（图1B 和 补充图 S1

讨论

本文描述了基础 体外 用于分析E3连接酶功能的泛素化方法。在进行 体外 泛素化实验中，应考虑到某些E2酶能够发生自泛素化，这是由于其活性半胱氨酸攻击位于活性位点附近自身的赖氨酸残基所致³⁰为解决这一问题，建议使用一种E2突变体，其中相应的赖氨酸残基被精氨酸取代，从而获得具有催化活性且抗自泛素化的E2酶。³²这一点在通过赖氨酸释放实验监测泛素转移时尤为重要，以确保实验的可重复性。另一个关键因素是E2~Ub硫酯键的不稳定性。如果硫酯键的稳定性限制了实验的可行性，则可能影响后续步骤的准确性。 体外 应用中，可将E2的活性半胱氨酸残基替换为丝氨酸，以生成更稳定的E2~Ub氧酯³³首次使用或使用新的E2酶时，需确定E1介导的E2泛素化（Ub charging）水平。E2的泛素化效率可能受多种因素影响，包括E1的物种来源、泛素化反应的温度以及泛素（Ub）与E2的摩尔比。为确定泛素化反应的产率，可通过检测未修饰的E2 与通过考马斯亮蓝染色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amershan Protran 0.1 µm NC	GE Healthcare	10600000	硝酸纤维素膜
Anti-CHIP	Cell Signaling	2080	单克隆兔抗CHIP抗体，克隆株 C3B6
Anti-MYC	Roche	OP10	单克隆鼠抗MYC抗体，克隆株 9E10
Anti-ubiquitin	Upstate	05-944	单克隆鼠抗Ub抗体，克隆株 P4D1-A11
Apyrase	Sigma	A6535-100UN
ATP (10x)	Enzo	12091903
BSA	Sigma	A6003-10G
EDTA	Roth	8043.2
KCl	Roth	6781.1
K2HPO4	Roth	P749.2
KH2PO4	Roth	3904.1
LDS 样品缓冲液 (4x)	novex	B0007
L-赖氨酸	Sigma	L5501-5G
MES	Roth	4256.4
MeOH	VWR Chemicals	2,08,47,307	100%
脱脂奶粉	Roth	T145.3
NaCl	Roth	P029.3
NuPAGE 抗氧化剂	invitrogen	NP0005
NuPAGE 转膜缓冲液 (20x)	novex	NP0006-1
Page Ruler Plus	Thermo Fisher	26619	蛋白分子量标准
RotiBlock	Roth	A151.1	封闭试剂
SDS (20%)	Roth	1057.1
S1000 梯度PCR仪	Bio Rad	1852196
Trans-Blot Turbo	Bio Rad	1704150EDU	转膜系统
Tris 碱	Roth	4855.3
Tween 20	Roth	9127.2
UbcH 酶试剂盒	BostonBiochem	K-980B	E2 酶
泛素	BostonBiochem	U-100H
泛素激活酶 E1	Enzo	BML-UW941U-0050
泛素化反应缓冲液 (10x)	Enzo	BML-KW9885-001
Whatman 转印滤纸	Bio Rad	1703969	超厚滤纸