体外分析E3泛素连接酶功能

摘要

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌 培养。

摘要

泛素（Ub）共价连接至底物蛋白内部的赖氨酸残基，这一过程称为泛素化，是真核生物中最重要的一类翻译后修饰。泛素化由三类酶依次级联催化完成，包括泛素激活酶（E1酶）、泛素结合酶（E2酶）和泛素连接酶（E3酶），有时还包括泛素链延伸因子（E4酶）。此处， 体外 提供了泛素化检测的实验方案，可用于评估E3泛素连接酶活性、E2与E3配对之间的协同作用以及底物选择。通过监测游离多聚泛素链的生成和/或E3连接酶的自泛素化，可筛选协同作用的E2-E3配对。E3连接酶对底物的特异性结合决定了底物的泛素化，并可通过蛋白质印迹法进行检测。 体外 反应。此外，还描述了一种E2~Ub释放实验，该方法是直接评估E2与E3功能协同作用的有效工具。在此实验中，可追踪E3依赖性的泛素从相应的E2酶转移至游离的赖氨酸氨基酸（模拟底物泛素化）或E3连接酶自身内部的赖氨酸位点（自泛素化）。综上所述，三种不同的 体外 提供了快速且易于操作的实验方案，用于研究E3连接酶的催化功能。

引言

泛素化是指泛素（Ub）共价连接到底物蛋白的过程¹泛素化修饰由三种不同酶类连续催化的酶促反应完成， 即泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）以及可能的泛素链延伸因子（E4s）^2,3,4,5. 在三磷酸腺苷（ATP）和镁（Mg²⁺依赖ATP的Ub激活过程中，E1酶的活性位点半胱氨酸攻击Ub的C末端甘氨酸，形成硫酯复合物（Ub~E1）。ATP水解所提供的能量使Ub进入高能过渡态，并在后续的酶级联反应中维持该状态。随后，E2酶将其内部的催化半胱氨酸接受活化的Ub，形成短暂的Ub~E2硫酯键。最终，Ub被转移至底物蛋白。

这可以通过两种方式实现。一种是E3连接酶首先与E2结合，另一种是E3连接酶直接与泛素（Ub）结合。后一种方式会形成E3~Ub中间体。无论哪种情况，泛素均通过其C末端羧基与底物蛋白的赖氨酸ε-氨基之间形成异肽键，从而与底物蛋白共价连接⁶。人类基因组编码两种E1酶、约40种E2酶以及超过600种可能的泛素连接酶⁷....

方案

1. 缓冲液和试剂的准备

注意：以下列出的是在实验室中手动配制的缓冲液和试剂。方案中使用的其他所有缓冲液和试剂均购自不同供应商，并按照生产商的说明使用。

1. 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）。为此，将1.37 M氯化钠（NaCl）、27 mM氯化钾（KCl）、80 mM二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·2H₂O）和1.5 mM磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶于去离子水中，调节pH至7.4，室温保存。₂HPO₄0.2 H₂O) 和 20 mM 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄) 加入1升双蒸水₂O (ddH₂O)₂O）。高压灭菌10x PBS，并用ddH₂O配制1x PBS溶液₂O.
   1. 在121 °C和98.9 kPa条件下进行高压灭菌15分钟。
      注意：所有缓冲液和溶液均在此条件下进行高压灭菌。若无特殊说明，溶液于室温（RT）保存。
2. 通过向1 L的1x PBS中加入0.1% Tween，制备1 L的PBS-Tween（PBS-T）溶液。
3. 通过将 L-赖氨酸溶解于 ddH₂O 中，配制 10 mL 0.5 M L-赖氨酸储备液。₂O. 将L-赖氨酸分装....

结果

为了鉴定与泛素连接酶CHIP协同作用的E2酶，对一组E2候选蛋白进行了 individually 测试 体外 泛素化反应。通过E3依赖性泛素化产物的形成来监测协同作用的E2-E3配对。 即，E3连接酶的自泛素化以及游离泛素（Ub）多聚体的形成。通过蛋白质印迹法分析泛素化产物。结果解读基于所得蛋白条带与分子量标记物的大小比较。蛋白质泛素化导致出现特征性的条带模式，表现为双条带或多个重复条带，其相对分子量差异为8.6 kDa（单个Ub分子的大小）。

在此，检测了九种E2酶在野生型CHIP存在下促进泛素化产物形成的能力图1A），无活性的U-box突变体CHIP(H260Q)（图1B），或无 CHIP（补充图 S1）。在无活性CHIP存在的情况下以及在缺失CHIP的情况下均形成了不依赖E3的泛素化产物（图1B 和 补充图 S1<.......

讨论

本文描述了基础 体外 用于分析E3连接酶功能的泛素化方法。在进行 体外 泛素化实验中，应考虑到某些E2酶能够发生自泛素化，这是由于其活性半胱氨酸攻击位于活性位点附近自身的赖氨酸残基所致³⁰为解决这一问题，建议使用一种E2突变体，其中相应的赖氨酸残基被精氨酸取代，从而获得具有催化活性且抗自泛素化的E2酶。³²这一点在通过赖氨酸释放实验监测泛素转移时尤为重要，以确保实验的可重复性。另一个关键因素是E2~Ub硫酯键的不稳定性。如果硫酯键的稳定性限制了实验的可行性，则可能影响后续步骤的准确性。 体外 应用中，可将E2的活性半胱氨酸残基替换为丝氨酸，以生成更稳定的E2~Ub氧酯³³首次使用或使用新的E2酶时，需确定E1介导的E2泛素化（Ub charging）水平。E2的泛素化效率可能受多种因素影响，包括E1的物种来源、泛素化反应的温度以及泛素（Ub）与E2的摩尔比。为确定泛素化反应的产率，可通过检测未修饰的E2 与通过考马斯亮蓝染色.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amershan Protran 0.1 µm NC	GE Healthcare	10600000	硝酸纤维素膜
Anti-CHIP	Cell Signaling	2080	单克隆兔抗CHIP抗体，克隆株 C3B6
Anti-MYC	Roche	OP10	单克隆鼠抗MYC抗体，克隆株 9E10
Anti-ubiquitin	Upstate	05-944	单克隆鼠抗Ub抗体，克隆株 P4D1-A11
Apyrase	Sigma	A6535-100UN
ATP (10x)	Enzo	12091903
BSA	Sigma	A6003-10G
EDTA	Roth	8043.2
KCl	Roth	6781.1
K2HPO4	Roth	P749.2
KH2PO4	Roth	3904.1
LDS 样品缓冲液 (4x)	novex	B0007
L-赖氨酸	Sigma	L5501-5G
MES	Roth	4256.4
MeOH	VWR Chemicals	2,08,47,307	100%
脱脂奶粉	Roth	T145.3
NaCl	Roth	P029.3
NuPAGE 抗氧化剂	invitrogen	NP0005
NuPAGE 转膜缓冲液 (20x)	novex	NP0006-1
Page Ruler Plus	Thermo Fisher	26619	蛋白分子量标准
RotiBlock	Roth	A151.1	封闭试剂
SDS (20%)	Roth	1057.1
S1000 梯度PCR仪	Bio Rad	1852196
Trans-Blot Turbo	Bio Rad	1704150EDU	转膜系统
Tris 碱	Roth	4855.3
Tween 20	Roth	9127.2
UbcH 酶试剂盒	BostonBiochem	K-980B	E2 酶
泛素	BostonBiochem	U-100H
泛素激活酶 E1	Enzo	BML-UW941U-0050
泛素化反应缓冲液 (10x)	Enzo	BML-KW9885-001
Whatman 转印滤纸	Bio Rad	1703969	超厚滤纸