采用自动组织切割的数字注释为低肿瘤含量样本中富集肿瘤细胞提供了创新性方法，且适用于石蜡和冷冻两种组织类型。所述工作流程可提高准确性、可重复性和通量，可广泛应用于科研和临床环境。
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本文内容
摘要
摘要
对于肿瘤含量较低的组织（根据方法不同，通常指肿瘤含量低于20%的组织），为了在多种下游检测（如新一代测序）中稳定地获得高质量数据，必须进行肿瘤富集。自动化组织切取是一种新兴技术，通过将数字图像注释叠加至未染色切片上，实现对这类常见低肿瘤含量组织的自动化和优化富集。该方法克服了传统大体解剖法因操作者依赖导致的不精确性，以及激光捕获显微切割在时间、成本和专业技术方面的限制。本方案中，利用数字苏木精-伊红（H&E）注释，在未染色的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻切片（厚度不超过20 µm）上识别微小肿瘤区域，并使用直径为250 µm2的切割刀片进行自动化肿瘤富集，随后开展核酸提取和全外显子组测序（WES）。自动化切取可从单张或多张切片中采集低肿瘤含量组织中标注的区域用于核酸提取，同时支持在采集前后收集大量定量指标，在减少切片使用量的同时提升准确性、可重复性和通量。本方案适用于对动物和/或人类的低肿瘤含量FFPE或新鲜冷冻组织进行数字注释结合自动化切取，也可用于富集任意感兴趣区域，以提升临床或科研工作流程中下游测序应用的样本充分性。
引言
下一代测序（NGS）在患者诊疗和癌症研究中日益广泛应用，有助于指导治疗方案并推动科学发现。由于组织样本通常有限，临床上常使用肿瘤含量不一的小样本进行检测。因此，肿瘤的充分性和完整性仍是获得有意义数据的主要障碍。肿瘤比例较低的样本可能难以区分真实的基因变异与测序过程中的技术假象，通常不符合NGS检测的纳入标准1。对于肿瘤含量低于20%的低肿瘤含量样本，进行肿瘤富集已被证明有助于获得足够的起始材料，从而生成可重复的测序数据，并确保不遗漏低频变异2,3。然而，具体的检测下限会因所使用的测序平台及数据预期用途的不同而有所差异。
传统上，为提取而富集肿瘤区域的方法是通过手工大体解剖或激光捕获显微切割（LCM）对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行操作。手工大体解剖，即从切片上刮取特定组织区域，可将肿瘤区域分离用于后续检测，成本相对较低，但准确性和精确度较差2,4。在肿瘤含量较高、存在大片肿瘤组织和/或组织损失对结果影响不大的情况下，较低的技术准确性仍可能有效；但对于肿瘤含量较低或肿瘤分布较分散的样本，则需要更高的精确度。因此，激光捕获显微切割（LCM）于20世纪90年代被发明，并成为一种能够从福尔马林固....
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方案
在开始之前，根据机构审查委员会（IRB）的规程获取适当的组织样本。本文所述所有方法均已获得基因泰克公司（Genentech, Inc.）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 组织和切片制备
- 选择福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻组织块，并采用下述相应的处理方法。
- 将组织块切片至带正电荷的玻璃载玻片上，厚度按需设定。连续切取FFPE组织成带状，第一张参考切片厚度应适用于苏木精和伊红（H&E）染色（例如4 µm），随后根据需要和组织可用性，再切取1–4张厚度为4–20 µm的切片。将组织切片收集至带正电荷的显微镜载玻片上。
注意：新鲜冷冻参考组织切片应立即采用常规冷冻切片染色方案进行苏木精和伊红（H&E）染色，未染色的冷冻切片则应保存于-20 °C，直至需要时用于后续提取。 - 将所有FFPE切片在室温下干燥过夜。
- 将FFPE参考切片在60 °C下烘烤30分钟，然后采用常规方案进行H&E染色。
- 使用全切片成像仪以20倍或更高放大倍数对H&E染色切片进行扫描。
- 使用供应商提供的查看平台或开源查看器，对扫描图像中标注的肿瘤感兴趣区域进行注释。将这些注释导出为低倍率截图，或保存为包含对应多边形顶点X-Y像素坐标的元数据文件。
注意：前者在技术操作上较为简便，但后者在流程自动化方面具有优....
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结果
选取含有异种移植模型中转移性结直肠癌的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）及新鲜冷冻（FF）小鼠肝脏切片。切片经苏木精-伊红（H&E）染色（图 1A、E、I），并在全切片成像仪上以20倍放大倍率进行扫描。由病理学家对肿瘤感兴趣区域进行数字标注，并使用商业软件生成数字PNG格式的参考掩膜图像（图 1B、F、J）。将连续的10 µm和20 µm未染色样本切片置于载物台上，按前述方法进行自动化切割。新鲜冷冻组织收集至商用试剂盒提供的裂解缓冲液中，并依照制造商说明书直接进行核酸提取。FFPE样本使用分子级矿物油收集，切割后的样本合并后在4 °C下以25,000 × g 离心20分钟。弃去上清液，加入所需最小量的矿物油重新悬浮组织，转移并收集至单个收集管中。样本在室温下运送至第三方服务商，依照制造商说明书进行核酸提取，并测定RNA和DNA的片段大小、浓度、完整性及纯度。根据制造商说明书，构建测序文库并使用商业试剂进行杂交与捕获。切割后剩余的.......
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讨论
本文介绍了一种结合数字标注与自动化切割技术的实验方案，用于从肿瘤含量较低的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻组织中分离肿瘤区域，以实现肿瘤富集并用于全外显子组测序（WES）。通过将数字标注与掩模创建同自动化切割相结合，显著减少了传统肿瘤富集方法（包括手工大切片和激光显微切割）所必需的操作时间与专业技术要求。该方案提供了一种具有潜在重要意义的中等精度肿瘤富集策略，不仅适用于低肿瘤含量样本的富集，还可用于在高通量条件下，将弥散分布的肿瘤灶从邻近正常组织中有效分离，从而实现有意义的肿瘤富集。尽管本方案在此处以低肿瘤含量的异种移植组织为例进行展示，但研究发现该流程同样适用于多种组织类型，包括人类、小鼠及异种移植来源的多种正常组织与肿瘤组织。
因此，该方法也可广泛应用于多种场景，例如在无需显著污染背景组织的情况下富集特定目标区域（如富集特定脑区），或在使用传统大体解剖法进行核酸提取前去除特定组织区域。
市场上存在多种用于切片扫描和数字注释的平台。因此，需要注意的是，平台兼容性可能存在限制，且任何方案中指定的平台未必在所有实验室中.......
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披露
Charles A Havnar、Oliver Zill、Jeff Eastham、Jeffrey Hung、Jennifer Giltnane、Nicolas Lounsbury、Daniel Oreper、Sarajane Saturnio 和 Amy A Lo 是基因泰克（Genentech）和罗氏（Roche）的员工及股东，Mana Javey 和 Emmanuel Naouri 是罗氏（Roche）的员工及股东。
致谢
作者谨此感谢 Carmina Espiritu 和 Robin E. Taylor 在自动化解剖技术开发方面的支持，同时感谢为本研究提供支持的基因泰克病理学核心实验室工作人员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect 填充工作站 | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect 仪器底座 | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect 仪器头部 | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect 小型研磨头 | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect 电脑系统 | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | 微型离心机 |
| 孵育缓冲液 | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | 全自动染色机 |
| 分子级矿物油 | Sigma | M5904-500ML | |
| 蛋白酶K | Promega | V302B | 消化缓冲液 |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA 小量提取试剂盒 | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus 缓冲液 | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus 带正电荷显微镜载玻片 | Thermo Scientific | 6776214 |
参考文献
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al.
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重印与许可
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