本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质构象动力学在调控酶催化、配体结合、变构效应和信号转导等重要生物学过程中发挥着基础性作用。理解结构与动力学之间的平衡如何调控生物学功能，是现代结构生物学的一个新兴前沿领域，并推动了多项技术和方法的发展。其中，CPMG弛豫色散溶液核磁共振方法能够提供关于发生在微秒至毫秒时间尺度上的蛋白质构象平衡的结构、动力学和热力学信息，具有独特的原子分辨率。 µ微秒至毫秒时间尺度。本文介绍了15N弛豫弥散实验数据采集与分析的详细方案。 15N 弛豫弥散实验。以细菌酶I的C端结构域在微秒至毫秒时间尺度上的动力学分析为例，展示了该分析流程。 µ细菌酶I的C端结构域中的μs-ms动力学被展示。
引言
Carr-Purcell Meiboom-Gill（CPMG）弛豫色散（RD）实验被常规用于表征发生在 µs通过溶液核磁共振波谱法在毫秒时间尺度上1,2,3,4,5与其他研究构象动态的方法相比，CPMG技术在现代核磁共振波谱仪上相对容易实现，无需特殊的样品制备步骤（如结晶、样品冷冻或取向排列，以及与荧光或顺磁性标签的共价偶联），并可对构象平衡进行全面表征，提供有关交换过程的结构、动力学和热力学信息。要使CPMG实验能够报告构象平衡，必须满足两个条件：（i）发生构象交换的状态（微观态）中被观测的核磁共振自旋必须具有不同的化学位移；（ii）交换过程必须发生在约~的时间尺度范围内50 µs 约10毫秒。在这些条件下，观测到的横向弛豫速率（
) 是内在R的总和2 （R2 在不存在的情况下测量 µs-ms dynamics, 
）以及横向弛豫（Rex）。Rex 对 R 的贡献2观察 可通过减小间距逐步淬灭 180° 构成脉冲序列CPMG模块的脉冲，所得的弛豫色散（RD）曲线可通过Bloch-McConnell理论进行建模，以获得微态之间的化学位移差异、各微态的分数分布以及微态之间的交换速率（图1)1,2,3.
文献中已报道了多种用于15N CPMG实验的脉冲序列和分析方法。本文描述了本实验室所采用的实验方案。具体将介绍核磁共振（NMR）样品制备、NMR实验的设置与采集，以及NMR数据的处理与分析等关键步骤（图2）。为便于该方案在其他实验室的推广应用，提供了脉冲程序、数据处理与分析脚本以及一个示例数据集作为补充文件，可从以下网址下载：(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)。所提供的脉冲序列在CPMG模块中采用了四步相位循环，以抑制与偏置相关的伪影6，并编码支持多个交错实验的采集。这些交错实验具有相同的弛豫时段，但再聚焦脉冲的次数不同，从而实现不同的CPMG场强7。还需特别注意，所述脉冲程序测量的是NMR信号TROSY组分的15N R28。总体而言，该方案已成功应用于中等及较大尺寸蛋白质构象交换的表征4,5,9,10。对于较小的体系（<20 kDa），建议采用基于异核单量子相干（Heteronuclear Single Quantum Coherence, HSQC）的脉冲序列11,12。
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方案
1. 核磁共振样品的制备
- 表达并纯化目标蛋白的2H,15N标记样品。
注意：尽管可以使用15N标记的蛋白样品进行CPMG弛豫弥散（RD）实验的数据采集，但全氘代（在可行的情况下）可显著提高所获数据的质量。有关全氘代蛋白制备的实验方案可参见文献13。 - 将纯化的蛋白样品置换至已脱气的核磁共振（NMR）缓冲液中。
- 将NMR样品转移至NMR管中。
注意：NMR样品的浓度需仔细优化，以最大化信噪比并尽量减少蛋白质-蛋白质相互作用的发生。通常情况下，CPMG实验的典型浓度范围为0.1–1.0 mM。
2. 核磁共振实验的首次设置
- 下载并解压缩补充文件。
- 将文件 bits.vv 和 trosy_15N_cpmg.vv（位于名为 pulseprogram 的文件夹中）复制到脉冲程序目录（
- 打开采集软件，并使用命令edc将先前运行的1H-15N HSQC实验复制为新实验。
- 使用命令pulprog，将脉冲程序 trosy_15N_cpmg.vv 加载至新创建的实验中。
- 根据脉冲程序文件（trosy_15N_cpmg.vv）末尾提供的说明设置 CPMG 实验。
3. 核磁共振实验的常规设置
- 将样品放入磁体中，并执行所有核磁共振实验的基本采集步骤：对样品进行锁场和匀场；匹配并调谐1H和15N通道。
- 将p1和p7分别设置为1H和15N硬脉冲90°的持续时间。
注意：为获得最佳结果，必须仔细校准15N的90°脉冲。通常使用DMSO中100 mM的15N标记尿素样品，按照波谱仪手册所述方法完成校准。此外，还可以在实际使用的NMR样品上直接验证校准结果：采集一段1H-15N HSQC谱的第一组数据点，其中第一个INEPT模块中的15N 90°脉冲改为180°脉冲。若校准正确，则应得到一个零信号（null）。 - 在采集窗口中，设置1H和15N维的中心频率和谱宽。
注意：为实现最优的水信号抑制，应将1H谱的中心频率设在水信号的共振频率处。 - 将弛豫延迟（d30）设为0.7 T2，其中T2为蛋白质预期的15N横向弛豫时间。
注意：d30的值可通过实验经验优化，以获得最佳结果。 - 使用命令vclist创建一个整数列表，对应于图1A和图1B中的参数n。确保列表中的每个数值对应不同的CPMG场强（νcpmg），关系为νcpmg = 4 × n / d30。列表中的第一个数值必须为0（这对应于跳过CPMG模块的参考实验，此时d30 = 0 s），且不得使用大于1,000 × d30 / 4的数值。超过该阈值可能导致νcpmg > 1 kHz，从而损坏探头。
- 将l8设为vclist中的条目数，l3设为间接维的实数点数（通常l3设置在64–200范围内），并将td设为l8 × l3 × 2。
注意：执行步骤3.7–3.11以优化水信号抑制。 - 将接收增益（rg）设为1；打开脉冲程序文件（edcpul），跳转至第91行，删除goto 999前的分号，并保存文件。
- 使用命令gs调节参数spdb0（或spdw0），以最小化FID信号的强度。
- 在脉冲程序文件的第91行重新添加分号，并保存文件。
- 重复步骤3.7–3.9，以优化脉冲程序文件中第168行的spdb11、第179行的spdb2以及第184行的pldb2。
- 运行命令rga以优化接收增益。
- 将扫描次数（ns）设为8的倍数。
- 运行命令zg以启动实验。
4. NMR 数据的处理与分析
- 将名为 Process 的文件夹（补充文件）复制到包含 ser 文件的目录中。
- 使用 sep_fid.com 和 ft2D.com 文件处理核磁共振（NMR）数据。
注意：sep_fid.com 和 ft2D.com 文件中提供了如何编辑处理脚本的说明。 - 在 Sparky 中打开 CPMG_Sparky_files 目录中包含的 ucsf 文件。
注意：ucsf 文件由处理脚本生成。每个 vclist 条目对应一个 ucsf 文件。第一个 ucsf 文件（test_1.ucsf）包含参考实验数据。后续的 ucsf 文件（test_2.ucsf、test_3.ucsf，…，test_n.ucsf）按 νcpmg 值从低到高排序。 - 在参考 NMR 谱图（test_1.ucsf）上选取 NMR 交叉峰。
- 使用 Sparky 命令 pa 选中所有已选取的交叉峰。
- 运行 Sparky 命令 rh。该命令将打开一个对话窗口。选择选项 在每个谱图的相同位置提取信号强度。点击 Setup 并勾选所有 NMR 谱图。点击 Update，并将输出文件保存至工作目录。输出文件包含所有已打开 NMR 谱图的信号强度矩阵。
注意：文献中已描述了使用线型拟合方法从交错式伪三维实验中更精确地提取信号强度的方案14。可用于线型拟合的免费软件可在以下网址获取：https://pint-nmr.github.io/PINT/（PINT）、https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/（FUDA），以及 NMRPipe（nLinLS 模块）和 SPARKY（it 模块）中。 - 对于每个 CPMG 场，使用公式
将信号强度转换为 R2 率，其中 I0 和 Id30 分别为参考谱图（vc = 0）和弛豫谱图（vc > 0）的信号强度。
注意：在 补充文件 中，提供了用于将信号强度转换为 R2 率并可视化弛豫弥散（RD）曲线的电子表格模板文件（R2_calc.xls）。 - 使用 Sparky 命令 st 读取参考谱图中的噪声水平，并对 R2 率进行误差传递。
注意：在 补充文件 中，提供了用于对测量得到的 R2 率进行误差传递的电子表格模板文件（R2_calc.xls）。
5. 拟合RD曲线
- 复制名为 RD_fitting 的文件夹（补充文件) 到工作目录中。
- 针对每个指定的 NMR 峰，估算 Rex 通过计算
. 
和 
是 R2 在最低和最高ν下测得的速率cpmg 在 vclist 中. - 使用 R 可视化检查 RD 曲线ex 大于估计误差两倍的数据点，并剔除所有噪声过大而无法准确建模的RD曲线。
注意：R 上的噪声ex 可由误差传播得到 和 . - 使用所有带有 R 的 RD 曲线准备拟合脚本的输入文件ex 大于估计误差的两倍。
注意：输入文件准备的详细说明包含在拟合脚本中。示例输入文件作为 补充文件通常，RD 数据在两个不同的静态磁场下进行测量，并同时拟合。在本方案中，需要两个不同的输入文件（补充文件). - 使用提供的脚本拟合RD数据 补充文件.
注意：提供了两个不同的脚本，分别用于对 RD 曲线进行基于残基的拟合或全局拟合。两个脚本均使用两态交换模型和 Carver-Richards 方程对 RD 曲线进行拟合。拟合脚本中提供了更详细的说明。此外，还可使用其他软件包（如 Chemex（https://github.com/gbouvignies/ChemEx）和 CATIA（https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/））基于 Block-McConnell 方程进行数据拟合。 - 检验拟合参数估计值的可靠性，以降低 χ2 作为 p 的函数b 和 kex.
注意：降低的 χ2 在输出文件中提供。b 和 kex 可通过拟合过程中的下限和上限将参数限制为特定值。在我们的脚本中，参数 p 的下限和上限b 分别为 k 的下界 lb(2) 和上界 ub(2)ex 分别为 lb(3) 和 ub(3)。 - 估算拟合参数的误差。可通过将脚本中的 MC_fac 值设为 1，并多次重复拟合过程（通常 >20 次重复）。每个参数的误差估计为该分布的标准差。
注意：将 MC_fac 设置为 1 时，会生成一个合成数据集，其中向实验数据添加了基于实验误差计算的高斯分布误差。
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结果
本方案可获得每个峰的RD谱型 1H-15N TROSY 谱图3A）。从获得的RD谱图中，可以估算交换作用对弛豫的贡献 15每条主链酰胺基团的N横向弛豫图3A3B）。通过绘制 Rex 根据所研究蛋白质的三维结构，可以鉴定出在构象交换过程中发生改变的结构区域 µs毫秒时间尺度（图3C）。使用Carver-Richards方程对RD曲线进行建模，可获得交换过程的热力学和动力学参数，例如各状态在平衡状态下的摩尔分数以及这些状态之间的交换速率（图1, 图3D）。这些热力学和动力学参数的温度依赖性（通过在多个实验温度下进行RD实验获得）可分别利用范特霍夫（van't Hoff）方程和艾林（Eyring）方程进行建模，从而获得关于构象交...
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讨论
本文描述了实验室中用于获取和分析蛋白质15N RD 数据的实验方案。特别涵盖了核磁共振（NMR）样品制备、NMR 数据采集以及RD谱图分析中的关键步骤。下文讨论了RD实验获取与分析过程中的一些重要方面。然而，若需更深入地了解该实验及数据分析方法，强烈建议仔细研读原始文献3,8,11,15,16。
在制备核磁共振（NMR）样品时，必须充分考虑：任何微量（<1% 比例）的状态，若与主要的、在 NMR 上可观测的物种在微秒至毫秒（µs-ms）时间尺度上发生交换，均会产生可检测的弛豫色散（RD）谱图1。因此，建议使用高度纯化的蛋白质储备液（>90% 纯度），以避免污染物与被研究体系形...
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披露
所有作者均已阅读并批准了该稿件。我们声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了NIGMS R35GM133488基金以及Roy J. Carver慈善信托基金对V.V.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低温探头 | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | 提高灵敏度 |
| 重水 | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% 纯度，用于制备核磁共振样品和氘代培养物 |
| 手动离心机 | United Scientific supply | CENTFG1 | 用于去除核磁共振管壁上附着的气泡或残留液体 |
| 高场核磁共振波谱仪 | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | 采集核磁共振数据 |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | 核磁共振数据建模 |
| 核磁共振巴斯德移液管 | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex 玻璃巴斯德移液管，用于将液体样品转移至核磁共振管中 |
| 核磁共振管 | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5 mm 薄壁 7 英寸圆柱形玻璃管 |
| NMRPipe | 生物科学与生物技术研究所 | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | 核磁共振数据处理 |
| SPARKY | 加利福尼亚大学旧金山分校 | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | 核磁共振数据分析 |
| Tospin 3.2（或更新版本） | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | 数据采集软件 |
参考文献
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