本文详细描述了在实验室中通过溶液核磁共振波谱法获取和分析15N弛豫色散谱的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质构象动力学在调控酶催化、配体结合、变构效应和信号转导等重要生物学过程中发挥着基础性作用。理解结构与动力学之间的平衡如何调控生物学功能，是现代结构生物学的一个新兴前沿领域，并推动了多项技术和方法的发展。其中，CPMG弛豫色散溶液核磁共振方法能够提供关于发生在微秒至毫秒时间尺度上的蛋白质构象平衡的结构、动力学和热力学信息，具有独特的原子分辨率。 µ微秒至毫秒时间尺度。本文介绍了15N弛豫弥散实验数据采集与分析的详细方案。 15N 弛豫弥散实验。以细菌酶I的C端结构域在微秒至毫秒时间尺度上的动力学分析为例，展示了该分析流程。 µ细菌酶I的C端结构域中的μs-ms动力学被展示。
引言
Carr-Purcell Meiboom-Gill（CPMG）弛豫色散（RD）实验被常规用于表征发生在 µs通过溶液核磁共振波谱法在毫秒时间尺度上1,2,3,4,5与其他研究构象动态的方法相比，CPMG技术在现代核磁共振波谱仪上相对容易实现，无需特殊的样品制备步骤（如结晶、样品冷冻或取向排列，以及与荧光或顺磁性标签的共价偶联），并可对构象平衡进行全面表征，提供有关交换过程的结构、动力学和热力学信息。要使CPMG实验能够报告构象平衡，必须满足两个条件：（i）发生构象交换的状态（微观态）中被观测的核磁共振自旋必须具有不同的化学位移；（ii）交换过程必须发生在约~的时间尺度范围内50 µs 约10毫秒。在这些条件下，观测到的横向弛豫速率（
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方案
1. 核磁共振样品的制备
- 表达并纯化目标蛋白的2H,15N标记样品。
注意：尽管可以使用15N标记的蛋白样品进行CPMG弛豫弥散（RD）实验的数据采集，但全氘代（在可行的情况下）可显著提高所获数据的质量。有关全氘代蛋白制备的实验方案可参见文献13。 - 将纯化的蛋白样品置换至已脱气的核磁共振（NMR）缓冲液中。
- 将NMR样品转移至NMR管中。
注意：NMR样品的浓度需仔细优化，以最大化信噪比并尽量减少蛋白质-蛋白质相互作用的发生。通常情况下，CPMG实验的典型浓度范围为0.1–1.0 mM。
2. 核磁共振实验的首次设置
- 下载并解压缩补充文件。
- 将文件 bits.vv 和 trosy_15N_cpmg.vv（位于名为 pulseprogram 的文件夹中）复制到脉冲程序目录（
- 打开采集软件，并使用命令edc将先前运行的1H-15<....
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结果
本方案可获得每个峰的RD谱型 1H-15N TROSY 谱图3A）。从获得的RD谱图中，可以估算交换作用对弛豫的贡献 15每条主链酰胺基团的N横向弛豫图3A3B）。通过绘制 Rex 根据所研究蛋白质的三维结构，可以鉴定出在构象交换过程中发生改变的结构区域 µs毫秒时间尺度（图3C）。使用Carver-Richards方程对RD曲线进行建模，可获得交换过程的热力学和动力学参数，例如各状态在平衡状态下的摩尔分数以及这些状态之间的交换速率（图1, 图3D）。这些热力学和动力学参数的温度依赖性（通过在多个实验温度下进行RD实验获得）可分别利用范特霍夫（van't Hoff）方程和艾林（Eyring）方程进行建模，从而获得关于构象交.......
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讨论
本文描述了实验室中用于获取和分析蛋白质15N RD 数据的实验方案。特别涵盖了核磁共振（NMR）样品制备、NMR 数据采集以及RD谱图分析中的关键步骤。下文讨论了RD实验获取与分析过程中的一些重要方面。然而，若需更深入地了解该实验及数据分析方法，强烈建议仔细研读原始文献3,8,11,15,16。
在制备核磁共振（NMR）样品时，必须充分考虑：任何微量（<1% 比例）的状态，若与主要的、在 NMR 上可观测的物种在微秒至毫秒（µs-ms）时间尺度上发生交换，均会产生可检测的弛豫色散（RD）谱图1。因此，建议使用高度纯化的蛋白质储备液（>90% 纯度），以避免污染物与被研究体系形.......
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披露
所有作者均已阅读并批准了该稿件。我们声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了NIGMS R35GM133488基金以及Roy J. Carver慈善信托基金对V.V.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低温探头 | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | 提高灵敏度 |
| 重水 | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% 纯度，用于制备核磁共振样品和氘代培养物 |
| 手动离心机 | United Scientific supply | CENTFG1 | 用于去除核磁共振管壁上附着的气泡或残留液体 |
| 高场核磁共振波谱仪 | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | 采集核磁共振数据 |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | 核磁共振数据建模 |
| 核磁共振巴斯德移液管 | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex 玻璃巴斯德移液管，用于将液体样品转移至核磁共振管中 |
| 核磁共振管 | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5 mm 薄壁 7 英寸圆柱形玻璃管 |
| NMRPipe | 生物科学与生物技术研究所 | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | 核磁共振数据处理 |
| SPARKY | 加利福尼亚大学旧金山分校 | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | 核磁共振数据分析 |
| Tospin 3.2（或更新版本） | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | 数据采集软件 |
参考文献
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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