基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

摘要

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D₂O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。

摘要

为减缓并防止耐药性感染的传播，迫切需要快速的抗菌药物敏感性试验（AST）以 定量确定 病原体的抗菌效应 传统方法依赖长时间培养，通常需要数天才能完成抗菌药物敏感性试验，且无法直接用于临床样本。本文报道了一种快速的抗菌药物敏感性试验方法 由重水（D2O）刺激拉曼散射（SRS）成像技术实现的方法₂O)代谢掺入。通过SRS成像监测单个细菌水平下D₂O向生物量中的代谢掺入及其在抗生素作用下的代谢活性抑制情况。₂O进入生物量以及单个细菌在接触抗生素后代谢活性受到抑制的情况，通过受激拉曼散射（SRS）成像进行监测。 细菌在接触抗生素后，经过总计2.5小时的样品制备与检测，即可获得单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）。此外，该快速AST方法可直接应用于复杂生物环境中的细菌样本，如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对临床快速单细胞表型AST具有变革意义。

引言

抗菌药物耐药性（AMR）对传染病的有效治疗构成了日益严重的全球性威胁¹据预测，若不采取行动应对耐药菌，到2050年，抗菌素耐药性（AMR）每年将额外导致1000万人死亡，并造成全球经济损失100万亿美元。^1,2这强调了对快速且创新的诊断方法的迫切需求 传染病细菌的抗生素敏感性试验（AST），以减缓耐药细菌的出现并降低相关死亡率³为确保最佳临床治疗效果，必须在24小时内启动有效治疗。然而，目前的金标准方法（如纸片扩散法或肉汤稀释法）通常需要至少24小时的临床样本预培养过程，以及额外16至24小时以获得最低抑菌浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法耗时过长，无法为临床感染性疾病的即时治疗决策提供指导，从而导致抗菌药物耐药性的出现与传播⁴.

基因型AST方法（如基于聚合酶链式反应（PCR）的技术）⁵已用于快速检测。此类技术通过检测特定的耐药基因序列来提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养；然而，仅能检测已知的特定耐药基因序列。因此，其应用范围局限于特定种类的细菌或特定的耐药机制。此外，这些方法无法提供用于治疗决策的MIC结果^6,7。此外，为克服这些局限性，多种新型表型快速AST方法正在研发中⁸，包括微流控装置^{9,10,11,12,13}、光学设备^14,15,16、定量核酸拷贝数的表型AST方法^17,18，以及拉曼光谱技术^{19,20,21,22,23,24}。这些方法缩短了获得AST结果所需的时间，但大多数仅适用于细菌分离株，不能直接用于临床标本，且仍需要长时间的预培养。

在本研究中，我们提出了一种通过SRS成像监测细胞代谢活性，快速测定尿液和全血中细菌敏感性的方法。水（H₂O）参与了活细胞中绝大多数重要的生物分子合成过程。作为水的一种同位素体，通过NADPH中的氧化还原活性氢原子与D₂O中的D原子之间的酶催化H/D交换反应，D₂O可被引入细胞代谢产物中。₂氧，氘可以掺入细胞内的生物量中^25,26. 氘标记的NADPH介导了氘代脂肪酸的合成反应。D₂氨基酸（AAs）反应中O的掺入导致氘化蛋白质的生成²⁶ (图1通过这种方法，单个微生物细胞中新合成的含碳-氘键（C-D）的生物分子可作为通用的代谢活性标志物进行检测。为了读取 从头合成 合成的C-D键，拉曼光谱作为一种提供生物分子特异性与定量化学信息的多功能分析工具，被广泛用于测定抗菌药物敏感性，并可将检测时间显著缩短至数小时内^27,28,29,30然而，由于拉曼散射过程本身效率较低，自发拉曼光谱的检测灵敏度较低，因此使用自发拉曼光谱获取实时成像结果具有挑战性。相干拉曼散射（CRS），包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），由于利用相干光场产生比自发拉曼光谱高数个数量级的信号，因而实现了高灵敏度检测，从而能够实现高速、特异性的 单细胞水平的定量化学成像^{31,32,33,34,35,36,37,38,39}.

本文基于我们最近的研究⁴⁰，介绍了一种通过飞秒受激拉曼散射（SRS）C-D成像技术，在单细胞水平上快速测定细菌在常规培养基、尿液及全血环境中掺入重水（D₂O）后的代谢活性和抗菌药物敏感性的实验方案。飞秒SRS成像技术可在2.5小时内实现对抗生素作用下单个细菌代谢失活浓度（SC-MIC）的监测。SC-MIC结果通过标准的肉汤微量稀释法MIC试验进行了验证。与传统方法相比，本方法显著缩短了检测时间，适用于尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）病原菌的抗菌药物敏感性测定，为临床中实现单细胞水平的快速表型抗菌药物敏感性试验提供了新的可能。

方案

使用人血标本符合波士顿大学机构审查委员会（IRB）和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体而言，这些标本来源于血库，且已完全去标识化。根据机构审查委员会（IRB）的判定，此类标本不被视为人类受试者。 波士顿大学办公室

1. 细菌和抗生素储备液的制备

1. 在1.5 mL离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）溶剂配制抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备液，浓度为1 mg/mL。将硫酸庆大霉素溶解于 无菌PBS溶液中，阿莫西林溶解于无菌DMSO溶剂中。随后，按照建议将抗生素溶液储存于2–8 °C。
2. 为制备含D₂O的阳离子调节穆勒-欣顿肉汤（MHB）培养基，将220 mg MHB肉汤基础成分加入10 mL D₂O中，以制备含100% D₂O的培养基。使用孔径为200 nm的滤器过滤溶液以实现灭菌。
   注意：在后续步骤中配制和灭菌培养基溶液时，请始终采用本方案。
3. 为准备用于SRS成像的细菌样品，向无菌圆底培养管中加入2 mL不含氘的普通MHB培养基，并在37 °C下预热。
4. 使用无菌接种环从胰蛋白胨大豆琼脂平板上的新鲜培养物中挑取单个细菌菌落（Escherichia coli BW 25113 或 Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085），然后将其悬浮于预热的培养基中，轻轻涡旋混匀以制备细菌悬液。
5. 将细菌在37 °C、200转/分钟（rpm）的摇床中孵育，直至达到对数生长期。

2. 在抗生素存在下进行D₂O掺入处理（图2a）

1. 使用分光光度计在600 nm波长下测量光密度（OD），检测细菌浓度。
2. 使用不含氘的普通MHB培养基稀释细菌溶液，使最终细胞浓度达到8 × 10⁵ CFU/mL。轻轻涡旋以混匀细菌细胞。
3. 将细菌溶液分别分装为每管300 µL，共七管，放入1.5 mL微量离心管中；另取一管分装600 µL细菌溶液。
4. 向含有600 µL细菌溶液的微量离心管中加入4.8 µL抗生素（庆大霉素或阿莫西林）储备液（1 mg/mL），使最终抗生素浓度为8 µg/mL。
5. 从含8 µg/mL抗生素的细菌溶液中取出300 µL，加入另一管含300 µL细菌溶液的管中，配制出抗生素浓度为4 µg/mL的两倍稀释溶液。
6. 对测试抗生素（庆大霉素或阿莫西林）进行连续两倍梯度稀释，直至达到最低浓度（0.25 µg/mL）的微量离心管，并从中弃去300 µL。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。
   1. 保留一管不加抗生素作为空白对照。该管作为阳性对照，用于检测在无抗生素处理但有D₂O处理条件下的细菌代谢活性。
   2. 保留一管既不加抗生素也不含 D₂O，作为阴性对照。
7. 将细菌分装液与含特定抗生素（庆大霉素或阿莫西林）的MHB培养基在37 °C下孵育1小时。
8. 在孵育期间，使用含100% D₂O的培养基，按照步骤2.6中制备的相同抗生素浓度梯度，准备抗生素的系列稀释液。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围均为0.25 µg/mL – 8 µg/mL。
9. 抗生素处理1小时后，将梯度稀释的抗生素与含100% D₂O的MHB培养基各700 µL，分别加入300 µL经相应浓度抗生素预处理的细菌溶液中（该溶液在步骤 2.6中已制备）。
   1. 例如，向经8 µg/mL抗生素预处理的300 µL细菌溶液中加入700 µL含8 µg/mL抗生素的100% D₂O-MHB培养基。以相同方式依次向对应浓度的各管转移，并通过反复吹打混匀。
   2. 向300 µL不含抗生素的细菌溶液（步骤2.6.1中制备）中加入700 µL不含抗生素的100% D₂O-MHB培养基，作为空白对照。
   3. 在37 °C、200 rpm的摇床中继续孵育30分钟。
      注：此步骤中，测试体系中D₂O的最终浓度为70%。
10. 首先将1 mL经抗生素和D₂O处理的细菌样品在4 °C下以6200 × g离心5分钟，然后用纯化水洗涤两次。最后将样品固定于10%福尔马林溶液中，并在4 °C下保存。

3. 尿液环境中细菌的制备（图2b）

1. 为制备处于对数生长期的 E. coli BW 25113，请按照步骤 1.4 和 1.5 进行操作。
2. 使用分光光度计在 600 nm 波长下测定 OD ，以检测细菌浓度。
3. 为模拟临床尿路感染（UTI）样本^14,18,41，将 E. coli 溶液加入 10 mL 去标识尿液中，使最终细胞浓度达到 10⁶ CFU/mL。
4. 使用 5 µm 滤膜过滤接种了 E. coli 的尿液，然后将菌液分装为每管 300 μL，共七管，另取一管分装 600 µL 菌液至 1.5 mL 微量离心管中。
5. 在抗生素存在条件下进行 D₂O 掺入处理，并按照之前 2.4 至 2.10 步骤所述进行样品采集 。

4. 血液环境中细菌的制备（图2c）

1. 为制备处于对数生长期的Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085，请按照步骤1.4和1.5进行操作。
2. 为模拟临床血流感染样本^42,43，将P. aeruginosa接种至1 mL去标识人血中，使其浓度达到 10⁷ CFU/mL。
3. 加入9 mL无菌纯化水以裂解血液。
4. 使用5 µm滤膜过滤接种了P. aeruginosa的血液样本，然后在4 °C下以6200 × g离心5分钟，将细菌收集至1 mL体积。向细菌悬液中加入9 mL预温的普通MHB培养基，并轻轻涡旋混匀，最终细菌浓度为10⁶ CFU/mL。 
5. 将接种了P. aeruginosa的血液样本按每份300 μL分装至7个1.5 mL微量离心管中，将细菌悬液按每份600 µL分装至1个1.5 mL微量离心管中。
6. 按照之前2.4至2.10步骤所述，进行D₂O掺入处理，在抗生素存在条件下进行处理并收集样本。

5. 单个细菌中D₂O代谢掺入的SRS成像

1. 取1 mL固定后的细菌溶液，用纯化水洗涤，然后在4 °C下以6200 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细菌溶液浓缩至约20 µL。
2. 将细菌溶液滴加到预先涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上，夹片并封片，用于SRS成像。
3. 使用SRS显微镜在C-D振动频率2168 cm^-1处对细菌进行成像。
   1. 通过计算机上的控制软件输入并调节泵浦激光波长至852 nm。
   2. 使用功率计测量激光功率，通过调节激光输出端前的半波片，将样品处的泵浦激光功率设为约8 mW，斯托克斯激光功率设为约40 mW。
      注意：在SRS显微镜中，一台重复频率为80 MHz的可调谐飞秒激光器提供泵浦光（680 至 1300 nm）和斯托克斯光（1045 nm）激发光源。
4. 通过调节反射镜上的螺丝，对泵浦光束和斯托克斯光束进行空间准直，并将两束光导入配备二维振镜扫描系统的正置显微镜中。
   1. 使用60倍水浸物镜将泵浦激光和斯托克斯激光聚焦到样品上。
   2. 使用油浸聚光镜从前向收集样品发出的信号。
   3. 在信号进入光电二极管之前，使用带通滤光片滤除斯托克斯激光。
   4. 通过锁相放大器提取受激拉曼信号，并由光电二极管检测信号。
5. 在软件控制面板中设置每幅SRS图像为200 × 200像素，像素驻留时间为30 µs，单幅图像总采集时间约为1.2秒。将步进距离设为150 nm，使图像尺寸约为30 × 30 µm²。每份样品至少采集三个不同视野。

6. 图像处理与数据分析（ 图3）

1. 为获得平均的C-D信号强度，使用ImageJ软件打开并处理SRS图像。
2. 首先，在ImageJ软件中点击图像 | 类型 | 8位，将SRS图像转换为8位图像，并通过点击编辑 | 反转按钮实现颜色反转。
3. 然后，点击处理 | 滤波 | 高斯模糊对图像进行高斯模糊滤波，并将标准差（半径）设置为1。
4. 使用图像阈值调整来选择细菌区域。点击图像 | 调整 | 阈值，确保所选细菌的大小与原始SRS图像中的一致。通过调整大小阈值以排除微小颗粒，点击应用。
5. 点击分析 | 颗粒分析按钮，对细菌进行标记并确定其面积。
6. 在ROI管理器中点击显示全部按钮，将其应用于原始未处理的SRS图像，标记相同的细菌区域，并在ROI管理器中点击测量按钮，确定每个数据点的平均强度。
7. 在原始SRS图像中圈出背景区域并测量其平均强度。每个细菌的平均C-D强度通过减去背景信号强度获得。

7. 通过 SC-MIC 定量测定抗菌敏感性

注意：根据细菌在不同药物浓度暴露下代谢活跃状态与代谢受抑制状态的SRS C-D强度的统计学分析，确定以0.60作为判断SC-MIC的截断值⁴⁰。抗生素敏感组和耐药组的C-D强度均符合正态分布。

1. 绘制受试者工作特征（ROC）曲线，并在0.60处评估截断阈值。基于该截断值，可将SC-MIC定义为抗生素疗效的指标，用于区分代谢失活组与代谢活跃组。
2. 为定量分析SRS成像数据，绘制经系列稀释抗生素浓度处理后各细菌组的C-D信号强度直方图。彩色数据点代表 不同单个细菌。
3. 将经抗生素处理组的C-D强度归一化至未接受抗生素处理对照组的平均强度。通过在C-D区域量化不同抗生素浓度下的SRS信号强度，并采用0.60作为截断值，确定不同细菌与抗生素组合的SC-MIC结果。
4. 将SC-MIC检测结果与采用传统肉汤微量稀释法测定的MIC进行验证和比较。
5. 根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准，基于SRS代谢成像结果，对每种测试菌株的敏感性类别判定为"敏感"、"耐药"或"中介"。

结果

通过自发拉曼显微光谱在C-D（2070至2250 cm^-1）和C-H（2800至3100 cm^-1）区域测量孵育时间对氘掺入的影响（图4a）。在含70% D₂O的培养基中培养的P. aeruginosa单细胞的时间序列拉曼光谱显示，随着孵育时间从0延长至180分钟，CD/CH峰强度逐渐增加（图4b）。单个微生物细胞中C-D信号的增强表明D₂O已掺入细胞内的氘化生物分子中。

在23小时的孵育期间，D₂O标记浓度超过50%会显著影响细菌代谢²⁷。我们观察到，在25小时孵育期间，当D₂O标记浓度高于70%时，细菌生长受到抑制（图S1）。我们采用金标准肉汤稀释法进行了最低抑菌浓度（MIC）测定，并在两种P. aeruginosa

讨论

通过单细胞SRS代谢成像，在2.5小时内从样本获取快速药敏试验（AST）结果，即测定细菌代谢活性对抗生素处理的响应，从而获得单细胞最低抑制浓度（SC-MIC）。通过监测细菌对氘代化合物（D）的代谢掺入，可检测细菌代谢活性的响应及抗菌药物敏感性。₂利用C-D键的SRS成像进行生物分子合成的O研究。由于水在活细胞中普遍存在，SRS代谢成像为快速药敏试验（AST）提供了一种通用方法。该快速AST方法可用于在复杂的生物环境（如尿液或全血）中单细菌水平检测细菌。在尿液和血液中培养细菌1.5小时后即可确定单细胞MIC（SC-MIC），这一进展被认为将彻底改变尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）的诊断模式，从耗时的依赖培养的方法转变为不依赖培养的新范式。 原位 因此，与传统的肉汤微量稀释法相比，该方法显著缩短了诊断时间，为临床转化铺平了道路，有助于及时确定合适的抗菌药物，实现精准治疗。

本文所述的抗生素处理方案遵循 CLSI 指南，其中推荐的 MHB 培养基通常可用于多种微生物的培养。一个关键参数是，用于抗菌药物敏感性试验的细菌细胞数量应保持在约 5 ×...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
声光调制	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	调制斯托克斯激光束
氨苄西林	Sigma Aldrich	A8523-5G
带通滤光片	Chroma	HQ825/150m	在光电二极管前阻断斯托克斯激光束
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016-100G	阳离子调节
阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤	Fisher Scientific	B12322	通过肉汤稀释法进行微生物的抗菌药物敏感性试验
离心机	Thermo Scientific	75002542
盖玻片	VWR	16004-318
带卡扣盖的培养管	Fisher brand	149569B
达托霉素	Acros	A0386346
重水		151882	用于溶解抗生素的有机溶剂
氘代重水（d6）	Sigma Aldrich	156914	作为标准品用于校准受激拉曼散射（SRS）成像系统
大肠杆菌 BW 25113	大肠杆菌遗传保藏中心	7636
Eppendorf 聚丙烯微量离心管 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
硫酸庆大霉素	Sigma Aldrich	G4918
亲水性聚偏二氟乙烯滤膜	Millipore-Sigma	SLSV025NB	孔径 5 µm
ImageJ 软件	NIH	版本：2.0.0-rc-69/1.52t	图像处理与分析
设定为 37 °C 的恒温振荡培养摇床	VWR	97009-890
接种环	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee 飞秒脉冲激光器	Spectra-Physics	型号：insight X3	可调谐激光源及固定于 1045 nm 的激光源，用于 SRS 成像
锁相放大器	Zurich Instrument	HF2LI	解调 SRS 信号
油浸聚光镜	Olympus	U-AAC	数值孔径 1.4
铜绿假单胞菌 ATCC 47085 (PAO1)	美国模式培养物集存库	ATCC 47085
光电二极管	Hamamatsu	S3994-01	探测器
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Falcon	14-959-53A
聚丙烯滤膜	Thermo Scientific	726-2520	孔径 0.2 µm
无菌培养皿	Corning	07-202-031
10 mL 注射器	Fisher brand	14955459
紫外/可见光分光光度计	Beckman Coulter	型号：DU 530	在 600 nm 波长下测量光密度
涡旋混合器	VWR	97043-562
水镜物镜	Olympus	UPLANAPO/IR	60×，数值孔径 1.2