基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

摘要

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D₂O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。

摘要

为减缓并防止耐药性感染的传播，迫切需要快速的抗菌药物敏感性试验（AST）以 定量确定 病原体的抗菌效应 传统方法依赖长时间培养，通常需要数天才能完成抗菌药物敏感性试验，且无法直接用于临床样本。本文报道了一种快速的抗菌药物敏感性试验方法 由重水（D2O）刺激拉曼散射（SRS）成像技术实现的方法₂O)代谢掺入。通过SRS成像监测单个细菌水平下D₂O向生物量中的代谢掺入及其在抗生素作用下的代谢活性抑制情况。₂O进入生物量以及单个细菌在接触抗生素后代谢活性受到抑制的情况，通过受激拉曼散射（SRS）成像进行监测。 细菌在接触抗生素后，经过总计2.5小时的样品制备与检测，即可获得单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）。此外，该快速AST方法可直接应用于复杂生物环境中的细菌样本，如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对临床快速单细胞表型AST具有变革意义。

引言

抗菌药物耐药性（AMR）对传染病的有效治疗构成了日益严重的全球性威胁¹据预测，若不采取行动应对耐药菌，到2050年，抗菌素耐药性（AMR）每年将额外导致1000万人死亡，并造成全球经济损失100万亿美元。^1,2这强调了对快速且创新的诊断方法的迫切需求 传染病细菌的抗生素敏感性试验（AST），以减缓耐药细菌的出现并降低相关死亡率³为确保最佳临床治疗效果，必须在24小时内启动有效治疗。然而，目前的金标准方法（如纸片扩散法或肉汤稀释法）通常需要至少24小时的临床样本预培养过程，以及额外16至24小时以获得最低抑菌浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法耗时过长，无法为临床感染性疾病的即时治疗决策提供指导，从而导致抗菌药物耐药性的出现与传播⁴.

基因型AST方法（如基于聚合酶链式反应（PCR）的技术）⁵已用于快速检测。此类技术通过检测特定的耐药基因序列来提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养；然而，仅能检测已知的特定耐药基因序列。因此，其应用范围局限于特定种类的细菌或特定的耐药机制。此外，这些方法无法提供用于治疗决策的MIC结果

方案

使用人血标本符合波士顿大学机构审查委员会（IRB）和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体而言，这些标本来源于血库，且已完全去标识化。根据机构审查委员会（IRB）的判定，此类标本不被视为人类受试者。 波士顿大学办公室

1. 细菌和抗生素储备液的制备

1. 在1.5 mL离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）溶剂配制抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备液，浓度为1 mg/mL。将硫酸庆大霉素溶解于 无菌PBS溶液中，阿莫西林溶解于无菌DMSO溶剂中。随后，按照建议将抗生素溶液储存于2–8 °C。
2. 为制备含D₂O的阳离子调节穆勒-欣顿肉汤（MHB）培养基，将220 mg MHB肉汤基础成分加入10 mL D₂O中，以制备含100% D₂O的培养基。使用孔径为200 nm的滤器过滤溶液以实现灭菌。
   注意：在后续步骤中配制和灭菌培养基溶液时，请始终采用本方案。
3. 为准备用于SRS成像的细菌样品，向无菌圆底培养管中加入2 mL不含氘的普通MHB培养基，并在37 °C下预热。
4. 使用无菌接种环从胰蛋白胨大豆琼脂平板上的新鲜培养物中挑取单个细菌菌落（Escherichia coli BW 25113 或 Pseudomonas aeruginosa ....

结果

通过自发拉曼微光谱在 C-D（2070 至 2250 cm^-1）和 C-H（2,800 至 3,100 cm^-1）区域测量孵育时间对氘掺入的影响（图 4a）。在含 70% D₂O 培养基中培养的P. aeruginosa单细胞随时间变化的拉曼光谱显示，随着孵育时间从 0 延长至 180 分钟，CD/CH 峰强度逐渐增强（图 4b）。单个微生物细胞中 C-D 丰度的增加表明 D₂O 已被掺入细胞内生成的氘标记生物分子中。

在23小时的孵育期间，D₂O标记浓度超过50%会显著影响细菌代谢²⁷。我们观察到，在25小时孵育期间，当D₂O标记浓度高于70%时，细菌生长受到抑制（图S1）。我们采用金标准肉汤稀释法进行了最低抑菌浓度（MIC）测定，并.......

讨论

通过单细胞SRS代谢成像，在2.5小时内从样本获取快速药敏试验（AST）结果，即测定细菌代谢活性对抗生素处理的响应，从而获得单细胞最低抑制浓度（SC-MIC）。通过监测细菌对氘代化合物（D）的代谢掺入，可检测细菌代谢活性的响应及抗菌药物敏感性。₂利用C-D键的SRS成像进行生物分子合成的O研究。由于水在活细胞中普遍存在，SRS代谢成像为快速药敏试验（AST）提供了一种通用方法。该快速AST方法可用于在复杂的生物环境（如尿液或全血）中单细菌水平检测细菌。在尿液和血液中培养细菌1.5小时后即可确定单细胞MIC（SC-MIC），这一进展被认为将彻底改变尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）的诊断模式，从耗时的依赖培养的方法转变为不依赖培养的新范式。 原位 因此，与传统的肉汤微量稀释法相比，该方法显著缩短了诊断时间，为临床转化铺平了道路，有助于及时确定合适的抗菌药物，实现精准治疗。

本文所述的抗生素处理方案遵循 CLSI 指南，其中推荐的 MHB 培养基通常可用于多种微生物的培养。一个关键参数是，用于抗菌药物敏感性试验的细菌细胞数量应保持在约 5 ×.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
声光调制	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	调制斯托克斯激光束
氨苄西林	Sigma Aldrich	A8523-5G
带通滤光片	Chroma	HQ825/150m	在光电二极管前阻断斯托克斯激光束
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016-100G	阳离子调节
阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤	Fisher Scientific	B12322	通过肉汤稀释法进行微生物的抗菌药物敏感性试验
离心机	Thermo Scientific	75002542
盖玻片	VWR	16004-318
带卡扣盖的培养管	Fisher brand	149569B
达托霉素	Acros	A0386346
重水		151882	用于溶解抗生素的有机溶剂
氘代重水（d6）	Sigma Aldrich	156914	作为标准品用于校准受激拉曼散射（SRS）成像系统
大肠杆菌 BW 25113	大肠杆菌遗传保藏中心	7636
Eppendorf 聚丙烯微量离心管 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
硫酸庆大霉素	Sigma Aldrich	G4918
亲水性聚偏二氟乙烯滤膜	Millipore-Sigma	SLSV025NB	孔径 5 µm
ImageJ 软件	NIH	版本：2.0.0-rc-69/1.52t	图像处理与分析
设定为 37 °C 的恒温振荡培养摇床	VWR	97009-890
接种环	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee 飞秒脉冲激光器	Spectra-Physics	型号：insight X3	可调谐激光源及固定于 1045 nm 的激光源，用于 SRS 成像
锁相放大器	Zurich Instrument	HF2LI	解调 SRS 信号
油浸聚光镜	Olympus	U-AAC	数值孔径 1.4
铜绿假单胞菌 ATCC 47085 (PAO1)	美国模式培养物集存库	ATCC 47085
光电二极管	Hamamatsu	S3994-01	探测器
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Falcon	14-959-53A
聚丙烯滤膜	Thermo Scientific	726-2520	孔径 0.2 µm
无菌培养皿	Corning	07-202-031
10 mL 注射器	Fisher brand	14955459
紫外/可见光分光光度计	Beckman Coulter	型号：DU 530	在 600 nm 波长下测量光密度
涡旋混合器	VWR	97043-562
水镜物镜	Olympus	UPLANAPO/IR	60×，数值孔径 1.2