超声与剪切波弹性成像在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型中的应用

摘要

本方案描述了一种增强型超声技术的使用方法，用于无创性地观察和量化非酒精性脂肪性肝病啮齿类动物模型中肝组织的变化。

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病谱中的一种疾病，其特征是肝脏脂肪积聚（脂肪变性）以及炎症，进而导致纤维化。在药物研发中，能够紧密模拟人类NASH/NAFLD的临床前模型至关重要。目前在临床实践中，肝活检是评估NAFLD/NASH进展和诊断的金标准；而在临床前研究中，则需要在研究期间的多个时间点采集全肝组织样本，或进行肝活检，以开展组织学分析来评估疾病阶段。

在研究过程中进行肝脏活检是一种侵入性且劳动密集型的操作，收集肝脏样本以评估疾病程度会增加研究所需的实验动物数量。因此，在这些临床前模型中，迫切需要一种可靠、可转化的非侵入性影像学生物标志物来检测NASH/NAFLD。基于超声的非侵入性B型超声图像和剪切波弹性成像（SWE）可用于测量肝脏脂肪变性以及肝纤维化。为了评估SWE在NASH临床前啮齿类动物模型中的应用价值，将动物置于促NASH饮食 下，并在NAFLD/NASH研究过程中多个时间点进行非侵入性超声B型成像和剪切波弹性成像，以测量肝肾（HR）指数和肝脏弹性，分别反映肝脏脂肪积聚和组织硬度的进展情况。

HR指数和弹性数值与脂肪变性和纤维化的组织学标志物进行了比较。结果显示，HR指数与肝脏油红O（ORO）染色百分比之间，以及弹性值与天狼星红（PSR）染色之间均存在强相关性。经典的离体（ex vivo）方法与体内（in vivo）成像结果之间的高度相关性表明，剪切波弹性成像/基于超声的成像可用于评估NAFLD/NASH临床前模型中的疾病表型及进展。

引言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种代谢性疾病，其特征是肝脏内脂肪过度积聚，现已成为全球主要的肝脏疾病之一，最近报告的全球患病率高达25%¹。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是NAFLD疾病谱中更为进展的阶段，其特征是在肝脏脂肪过多的基础上，出现进行性的肝细胞损伤、炎症和纤维化。这些疾病通常隐匿发生，通过血液检测或常规检查难以发现，往往在患者的肝脏已发生显著损伤后才被诊断。目前，诊断NASH的金标准是通过对患者肝脏活检样本进行组织病理学检查。同样，致力于研究NASH/NAFLD发病机制的临床前研究人员以及药物研发行业也依赖于对动物模型进行体内肝组织楔形活检，或通过卫星队列动物的终末安乐死获取肝脏组织，进而通过组织学方法评估脂肪变性、炎症和纤维化程度。

例如，在使用GUBRA NASH模型评估脂肪性肝炎和肝纤维化时，肝楔形活检一直是一种标准技术²。然而，肝楔形活检方法在小型动物中具有侵入性且操作繁琐³。在研究过程中间阶段使用楔形肝活检会为疾病模型引入额外的实验变量，通常会增加所需动物的数量。考虑到这些因素，能够在早期时间点可靠评估NASH/NAFLD动物模型中脂肪变性和纤维化的非侵入性成像技术显得尤为有价值。剪切波弹性成像（SWE）是一种基于超声的技术，用于测量软组织的弹性。该技术通过测量由指向组织目标的超声速超声脉冲所产生的剪切波传播速度，并据此计算出一个称为E模量的数值⁴。剪切波的传播速度与组织硬度程度成正比。

图1 和 图2 展示了成像区域的设置以及SWE仪器。SWE仪器为一个带轮子的独立装置，配有两块屏幕和一个控制面板，如 图2A 所示。上方的显示器（图2B）作为计算机显示器，用于显示图像和患者目录。控制面板（图2C）由一组按钮和旋钮组成，用于控制图像采集的常规操作：冻结屏幕、保存图像、在不同模式之间切换。下方的屏幕（图2D）为触摸屏，提供额外的设置控制功能，并可根据需要作为键盘输入数据。仪器配备了一支触控笔，可根据需要在触摸屏上使用。超声探头连接在设备的下部前面板上。在啮齿类动物的B模式和SWE成像中，使用了6至20 MHz的超线性换能器。这种无创测量组织硬度的能力使SWE成为识别和分期NASH患者肝纤维化的一种有价值工具⁵，减少了对更具侵入性方法的需求。事实上，SWE已被用于测量患者的肝纤维化程度，并且是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床纤维化评分的方法之一⁶。在疾病动物模型中使用SWE监测NASH进展，将为治疗手段的开发提供一种可转化的工具，同时通过减少实验动物数量以及优化in vivo操作以最大程度减轻疼痛与痛苦，从而改善动物福利。

在人类患者中，剪切波弹性成像（SWE）采用低频超声换能器⁴，这种设备并不适用于小型动物。值得注意的是，高频SWE技术已被用于评估乙酰辅酶A羧化酶抑制在大鼠NASH发病机制中的疗效⁷，并且该技术在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中的应用价值已有报道，与传统的METAVIR组织学评分方法相比取得了成功的结果⁸。然而，现有文献缺乏关于SWE成像在NASH临床前模型中应用的详细技术与方法学描述。如上所述，肝脂肪变性是NAFLD/NASH疾病的关键特征之一，也是可考虑进行干预的重要阶段。因此，在NASH/NAFLD临床前模型中，利用影像学手段评估肝脏脂肪积聚的重要性与评估肝纤维化同等重要。

一种称为HR指数的超声技术，即肝脏组织亮度与肾皮质亮度的比值，已在临床中被用作脂肪变性的替代标志物^9,10。然而，该方法在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的临床前动物模型中尚未得到广泛应用。本文介绍了一种在胆碱缺乏、高脂饮食（CDAHFD）诱导的NAFLD/NASH大鼠模型中，分别通过测量肝脏弹性及HR指数来评估肝纤维化和脂肪变性的方法。该模型可在小鼠中6周内快速诱导出可测量的脂肪变性、肝脏炎症和纤维化¹¹。在该饮食中添加胆固醇（1%）已被证明可促进大鼠的纤维生成过程¹²，使该模型成为适用于剪切波成像验证研究的理想候选模型。总体而言，该成像技术也可应用于多种NASH模型或饮食方案，只要脂肪变性和/或纤维化是研究关注的终点指标。

方案

所有涉及动物的实验程序均经辉瑞公司机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并在获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。

1. 疾病诱导

1. 使用雄性Wistar Han大鼠（150–175 g；约6–7周龄；共40只），确保无已知的大鼠间质性病原体。将大鼠成对饲养于独立通风笼具中，垫料为纸屑（参见 材料表在22 ± 1 °C、相对湿度40–70%、12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。
2. 将体重为150–175 g（约6–7周龄）的大鼠根据实验设计分为两组，分别饲喂含1%胆固醇的胆碱缺乏高脂饮食（n = 20）或标准实验室啮齿类动物饲料（n = 20）。
   ​注意：本研究共纳入40只大鼠，每组20只。6周实验结束时^th 周，每组中一半的动物被处死，以进行中期肝脏样本的组织学分析。因此，每组样本量为10只动物，用于第9周^th 和 12^th 周时间点。

2. 仪器设置

1. 按如下方式设置成像区域：配备加热表面，以在成像过程中保持动物体温（见图1中的c）；固定麻醉鼻罩，以持续输送吸入性麻醉气体，确保整个操作过程中维持适当的麻醉深度（见图1中的b）。
2. 使用超声探头支架，便于将超声探头移动至目标位置，并避免探头直接压迫动物。
   1. 在获取超声图像的皮肤区域使用预热的超声耦合剂。
   2. 整个操作过程中保持以下参数设置不变（可在触摸屏上进行调节）：声功率 0.0 dB；组织调谐速度 1540 m/s；动态范围 60 dB；弹性范围（SWE模式）< 30 kPa。
3. 将超声探头安装至专用支架的导轨系统上（见图1中的a）。
4. 打开仪器电源并等待系统启动。显示器开启后，注意观察已连接换能器的B模式图像。

3. 受试者准备

1. 确保动物在成像操作前至少禁食 4 小时，以防止肠道内容物干扰图像采集。
   1. 禁食至少 4 小时后，将大鼠放入异氟烷麻醉诱导室，直至达到适当的麻醉深度，通过夹趾无反应确认。以 3–5% 异氟烷暴露动物 3–5 分钟以诱导麻醉。
   2. 维持麻醉期间，在图像采集过程中保持动物处于 2–3% 异氟烷环境中。涂抹眼药膏以保护动物眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
2. 达到麻醉状态后，将动物从诱导室中取出，置于温热的循环水毯上。将麻醉鼻罩罩住动物口鼻部，并剃除其右侧从肋骨至骨盆区域的毛发。使用化学脱毛膏彻底清除该区域残留的所有毛发。
3. 脱毛完成后，将动物置于左侧卧位，前肢用胶带固定于头部上方，放置在温热的成像平台（图 3A）上。
4. 按下仪器控制面板上的 患者 键，并根据研究设计识别受试对象。
   1. 通过触摸屏点击图标，在仪器上打开 键盘 功能。按需输入名称。
   2. 点击 退出 以退出患者姓名输入界面。观察显示器上重新打开 B 模式图像。

4. 用于肝肾指数（HR指数）测量的图像采集

1. 在动物脱毛的皮肤区域涂抹少量温热的超声耦合剂。
2. 移动超声探头使其接触覆盖有耦合剂的部位（图3B）。当监视器上出现受试动物内脏器官的实时B型图像后，将超声探头移至髋部稍上方区域，刚好与腰椎平行（矢状面）。
3. 通过监视器上的B型图像，识别肾动脉和皮质/髓质分界，定位右肾（图4A）。此外，在同一图像平面中观察部分肝脏。
   1. 确保图像中几乎没有伪影，例如阴影或气泡。
4. 测量B型图像比值以获得肝肾（HR）指数。
   1. 确保肾皮质和肝实质处于同一焦平面。如有需要，调节焦点和增益控制以获得清晰图像。
      1. 通过旋转控制面板上的Focus旋钮调节焦点。按下Auto TGC按钮一次以调节增益。
   2. 按下控制面板上的Freeze键。冻结屏幕时应确保动物处于呼吸间歇期，以避免图像模糊。
   3. 屏幕冻结后，轻触触摸屏上的Measurement Tools。选择内置的B-mode Ratio工具，该工具用于测量感兴趣区域组织的相对亮度。创建一个直径为2 mm的圆圈以选定感兴趣区域（ROI）。通过手指沿控制面板轨迹球外缘移动来调整圆圈大小。
   4. 将2 mm的圆圈置于肝脏图像的感兴趣区域，该区域应位于肾脏右侧。根据肝脏组织均匀的回声强度和光滑的轮廓进行识别。
   5. 圆圈定位完成后，按下控制面板上的Select按钮，并观察新出现的圆圈。
   6. 将新圆圈调整为2 mm，并将其置于肾皮质图像上。务必保持肝脏和肾皮质圆圈的深度一致。定位完成后，按下控制面板上的Select按钮。观察系统内置工具显示的HR指数（即B型图像比值）。
   7. 按下Save Image保存图像，并观察出现在监视器右侧缩略图区域的已保存图像。
   8. 按下控制面板上的Freeze按钮解除图像冻结，返回实时B型图像模式。
5. 在不同深度和组织平面重复B型图像比值测量3次。对每只动物在每个时间点的三次B型图像比值取平均值。

5. 剪切波弹性成像的图像采集

1. 在右侧肋缘下区域横向移动探头，使用B模式定位肝脏。选择一个主要为肝实质且无门静脉、肝动脉等大血管的区域。找到清晰的肝组织区域后，按下控制面板上的SWE 按钮，生成该组织的剪切波弹性图。
2. 将SWE框调整至肝包膜下方，确保位于无阴影干扰的区域。肝包膜在图像顶部附近表现为一条明亮的强回声线，需准确识别。
3. 观察SWE框在5–10秒内转变为彩色弹性图。当SWE框完全填充且图像稳定时，在动物呼吸间歇期间按下控制面板上的Freeze 按钮。
   注意：SWE框的覆盖范围至少应达到60–80%，以准确评估肝脏弹性。
4. 在触摸屏上点击QBox，该为系统内置工具，用于从剪切波弹性图的感兴趣区域（ROI）计算弹性值。观察显示器上出现的圆形区域和数据框。通过触摸屏上的位置图标调整QBox至所需位置。
5. 通过沿控制面板轨迹球外缘移动手指，将圆形区域大小调整为3 mm。使用轨迹球将圆形置于颜色均匀且无阴影的区域（图5A,B）。注意避开已知的硬度区域，如血管或肝包膜，以及这些结构引起的声影干扰。
6. 找到合适区域后，按下控制面板上的Save Image按钮保存图像。在肝脏不同区域重复此操作3次。通过在腹部上下或左右移动探头，获取肝脏多个区域的SWE弹性图。
7. 完成所有图像采集后，按下控制面板上的End Exam按钮，并记录显示器上出现的患者信息界面内容。
8. 移除动物脚掌上的胶带，擦去多余的耦合剂，并将动物从成像平台取出。将其单独放置于温暖干燥的笼中，直至完全从麻醉中恢复。需密切观察每只动物，确保其完全恢复，恢复标志为能够维持胸卧位。
9. 对队列中的每只待成像动物，重复第4–5节中的步骤。

6. 图像数据的获取与分析

1. 当所有动物的图像采集完成后，关闭麻醉设备。
2. 要从仪器中导出图像数据，请按下控制面板上的Review按钮，查看显示器上显示的该仪器执行的所有扫描。使用屏幕右上角的搜索窗口查找所需的扫描图像。
3. 使用轨迹球和Select按钮，勾选患者名称旁的复选框，选择数据分析所需的所有扫描图像。当所有需要的扫描图像被选中后，在触摸屏上选择Export JPEGs。将数据导出至网络驱动器或便携式通用串行总线（USB）驱动器。USB端口位于仪器背面。
4. 文件导出后，在工作站计算机上打开每个扫描的独立jpg文件。观察图像右侧的所有数据：B Mode Ratio——记录B Ratio数值；Q Box——记录平均弹性模量（kPa）值。
5. 将所有数据输入电子表格或其他数据库管理软件，并进行所需的统计分析。

7. 肝脏样本的组织学分析

1. 6 结束时^th 周时，对每组中一半的动物进行解剖，以开展中期肝脏样本的组织学分析。同样，在第12周时，对剩余的动物实施安乐死，并采集肝脏样本进行组织学分析^th 周时间点。
2. 对于油红O染色，将肝组织切片用10%中性缓冲甲醛固定，并使用4℃条件下至少过夜的30%蔗糖溶液进行蔗糖脱水冷冻保存。将切片用最佳切割温度化合物包埋，进行冷冻切片并贴附于带电荷的载玻片上，以备油红O染色使用。
3. 将冷冻切片置于100%丙二醇中2分钟，随后在0.5% ORO溶液中孵育过夜。从ORO溶液中取出切片后，用85%丙二醇分化1分钟，去离子水中漂洗，再用Mayer's苏木精-Lillie改良液复染1分钟。
   1. 将盖玻片用含水封片剂封固于载玻片上，并在室温下干燥。
4. 对于PSR染色，将福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织切片进行脱蜡处理，置于Bouin液中过夜，随后根据制造商说明书并结合部分优化步骤，使用全自动切片染色机进行染色（1%磷钼酸处理5分钟；0.1% Sirius Red溶于饱和苦味酸中染色90分钟；0.5%乙酸溶液洗涤2次，每次30秒）。自动脱水后，用永久性封片剂封片。
5. 使用数字显微镜扫描仪以20倍放大倍数拍摄ORO和PSR染色切片的图像，保存为.svs格式，并存储至切片管理图像数据库中。
6. 使用数字病理学软件中自定义的算法分析图像。统一应用数字病理学软件及其阈值参数，识别并量化肝组织切片区域以及油红O（ORO）和天狼星红（PSR）染色区域。将测量结果导出至电子表格，用于计算面积百分比。

8. 统计分析

1. 采用双向方差分析（two-way ANOVA）结合Sidak多重比较检验对成像数据进行统计分析，以评估不同时间点各组之间的差异。当概率值 p ≤ 0.001 时，认为组间差异具有显著性。此外，对成像读数与组织学分析结果进行相关性分析。
2. 采用非参数统计方法分析本研究中的组织学分析结果。以中位数 ± 四分位距的一半（semi-interquartile range, sIQR）表示各组数值。当概率值 p ≤ 0.001 时，认为组间差异具有显著性。使用Mann-Whitney检验比较不同组间PSR和ORO组织化学染色的量。

结果

饲喂CDAHFD饮食的动物一个典型特征是脂肪变性。肝脏中脂肪的积聚会改变组织的回声特性，这种特性可通过测量肝脏亮度，并将其与同一平面B型超声图像中肾皮质的亮度进行归一化来量化。该量化值表示为HR指数，是脂肪变性的间接衡量指标。在图4A中，对照组动物的代表性肝脏图像显示其亮度（回声性）与肾皮质大致相等或更低，因此正常动物的HR指数<1。在本研究中，对照组动物在3周时间点的平均HR指数为0.645 ± 0.03。相比之下，CDAHFD饮食动物的代表性B型超声图像（图4A）显示肝脏亮度高于肾皮质。因此，CDAHFD饮食组动物在6周和12周时间点的代表性图像HR指数分别为1.91和1.79。

图4C 显示了对照组和CDAHFD饮食动物随时间变化的心率（HR）指数曲线图。对照饮食组动物的HR指数值从基线开始变化很小，而CDAHFD饮食组动物在研究开始后的前3至6周内迅速上升，随后趋于平稳。在疾病诱导后12周时...

讨论

基于超声的成像技术（包括剪切波弹性成像，SWE）可作为非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎（NAFLD/NASH）临床前模型中肝脏脂肪变性和硬度纵向评估的宝贵工具。本文详细描述了如何利用高脂高胆固醇饮食（CDAHFD）诱导的NASH大鼠模型，获取高质量的B型及SWE肝脏图像，以测量肝衰减比（HR指数）和弹性模量。此外，结果表明HR指数和弹性模量与组织学评估这一金标准之间具有极好的相关性。尽管该操作本身看似简单，但实验方案中存在若干关键环节，对确保成功结果至关重要。

探头的位置至关重要，尤其是在B型超声下寻找肾脏以测量HR指数时。若将探头放置位置过于靠近肋骨，可能会产生肋骨声影，从而导致超声衰减的测量出现假象。此外，使用剃刀和脱毛膏彻底清除所有体毛非常重要，因为残留的毛发可能截留气泡，进而在B型超声图像上形成阴影。最后，由于胃肠道内存在食物可能遮蔽肝脏，特别是在喂食普通饲料的动物中，因此对所有动物进行充分禁食对于成功实现肝脏成像至关重要。

尽管剪切波弹性成像（SWE）测得的肝脏弹性值和HR指数是评估NASH临床前模型中肝纤维化...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aixplorer	Supersonic Imagine		剪切波弹性成像仪器
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 探头	Supersonic Imagine		剪切波弹性成像换能器
Alpha-dri 垫料			大鼠笼具
Aperio AT2 扫描仪	Leica Biosystems		数字病理学明场扫描仪
Compac 6 麻醉系统	VetEquip		麻醉蒸发器及输送系统。可使用任何麻醉输送系统。
管理成像仪数据库	Leica Biosystems		数字病理学
Mayer's 苏木精	Dako/Agilent		H&染色与组织学
Nair	教堂 &安普 & 德怀特		脱毛剂
油红O溶液	Poly Scientific		脂质染色/组织学
苦味酸-天狼星红染色（PSR）	罗利生化	F-357-2	胶原染色/组织学
Puralube 眼用软膏	德克拉动物保健产品		麻醉期间防止眼部干燥的润滑措施
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		全自动切片染色机
VISIOPHARM 软件	Visiopharm		数字病理学软件
	研究用饮食	A06071309i	NASH 诱导饮食
	普瑞纳	5053	对照动物饲料
Vevo 成像系统	富士胶片 VisualSonics		Vevo 成像站用于在成像过程中固定超声换能器。
Wistar Han 大鼠	查尔斯河实验室