利用荧光激活细胞核分选技术从新鲜冷冻皮层中分离成人人类星形胶质细胞群体

摘要

我们开发了一种方法，可从新鲜冷冻组织中富集并分离人星形胶质细胞群体，用于后续分子分析。

摘要

在原代人类组织中，星形胶质细胞的复杂性仍缺乏明确界定，亟需更优的工具以实现其分离和分子表征。荧光激活细胞核分选（FANS）可用于成功分离和研究来自冷冻保存组织的人类神经元细胞核（NeuN+）群体，从而避免处理 新鲜组织所伴随的问题。然而，目前尚缺乏类似方法用于从非神经元（NeuN-）成分中有效分离星形胶质细胞。一种近期开发并经过验证的免疫标记策略，利用三种转录因子抗体，可同时从非疾病状态的新鲜（未固定）速冻 人死后颞叶新皮质组织中，富集分离出神经元（NeuN+）、星形胶质细胞（配对盒蛋白6（PAX6）+NeuN-）以及少突胶质细胞前体（OLIG2+NeuN-）细胞核群体。

该技术已被证明可用于表征原发性病理性癫痫新皮层中细胞类型特异性的转录组改变。转录组分析证实，PAX6+NeuN-分选群体显著富集了泛星形胶质细胞标志物，并能够在静息和反应性状态下捕获星形胶质细胞。本文描述了从新鲜冷冻的人类皮层组织中分离富集星形胶质细胞核群体的FANS方法，包括将组织解离为单核（sn）悬液；使用荧光标记的抗NeuN和抗PAX6抗体对细胞核进行免疫标记；FANS分选过程中的门控策略及质量控制指标，以优化分选的灵敏度和特异性，并确认星形胶质细胞的富集效果；以及推荐用于后续批量或单核分辨率的转录组和染色质可及性测序的样本制备方案。该方案适用于多种病理状态下的非坏死性新鲜冷冻人类皮层标本，建议死后组织采集时间在24小时内完成。

引言

在原代组织中，人类星形胶质细胞的分子复杂性仍缺乏明确界定，迫切需要更优的工具以在健康和疾病状态下对其高分辨率地进行分离与表征。由于新鲜脑组织样本获取受限、胶质细胞与神经元突起之间高度互联，以及处理过程中不可避免的细胞活化，将完整的人类神经元和胶质细胞从其微环境中分离出来一直十分困难，这些因素均限制了对这些细胞类型进行离体（ex vivo）分子表征的能力¹。荧光激活细胞核分选（FANS）作为一种替代活细胞分选的方法应运而生，可实现从冷冻组织中解离并进行细胞核群体的免疫标记。在过去十年中，FANS 已被广泛用于从多种脑组织样本和解剖区域中分离并分子表征人类神经元（NeuN+）细胞核群体^1,2,3,4。

然而，用于从人类大脑皮层中分离特定胶质细胞核亚群的类似方法仍十分有限，导致对正常和病变组织中星形胶质细胞复杂性的理解相对不足。为此，研究人员改进了一种先前发表的利用FANS⁴分离人类神经元群体的方案，并验证了一种使用三种抗体组合的方法，以富集星形胶质细胞（以及少突胶质前体细胞），从而捕获处于静息状态和反应状态的星形胶....

方案

注意：西奈山伊坎医学院（ISMMS）人类受试者保护项目及其机构审查委员会（IRB）确保研究的伦理合规性，并遵守联邦、州及机构的各项规定。本研究中使用的所有尸检样本均为去标识化样本，通过生物样本库在适当的知情同意下获取，且经ISMMS的IRB（HS#14-01007）认定，豁免于"人类研究"的监管范畴。 

1. 缓冲液的配制

注意： 若进行后续RNA测序，需使用RNase去污染溶液彻底处理所有工作区域和工具，以防止mRNA降解。

1. 制备裂解缓冲液。
   1. 将以下成分溶于去离子 H₂O 中并定容至 50 mL：5.47 g 蔗糖（终浓度 0.32 M）、250 µL 1 M CaCl₂ （终浓度 5 mM）、150 µL 1 M Mg(CH₃COO)₂ （终浓度 3 mM）、10 µL 500 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 0.1 mM）、500 µL 1 M Tris-HCl（pH 8）（终浓度 10 mM）、50 µL Triton X-100（终浓度 0.1%）以及 17 µL 3 M 二硫苏糖醇（DTT，终浓度 1 mM，现用现加）（参见材料表

结果

从死后12小时采集的新鲜（未固定）速冻颞叶新皮层组织中分离出细胞核。组织经解离形成细胞核悬液后，样本与针对NeuN、PAX6和OLIG2的抗体孵育，并根据图1和图2所示的设门策略进行分选。从NeuN+、PAX6+NeuN-和OLIG2+NeuN-分选的细胞群中收集细胞核（图1E、F和图2F）。靶向qPCR检测结果显示，在PAX6+(NeuN-)细胞群中，泛星形胶质细胞标志物GFAP和ALDH1L1显著富集（图1G和图2H）。此外，OLIG2+细胞群中少突胶质前体细胞（OPC）标志物PDGFRA表达富集（图1G）。对分选细胞群进行的批量RN.......

讨论

在考虑若干生物学和实验技术因素后，应最终确定遵循本方案的实验设计。起始组织样本应为新鲜冷冻样本，未经固定处理，并且最好具有较短的死后采集时间间隔，以最大化细胞核的回收率。根据经验，死后间隔（PMI）不超过24小时可实现足够的细胞核回收；然而，为优化完整细胞核的回收，建议PMI控制在12小时或更短。除PMI外，其他因素如尸体储存温度和组织pH值也可能影响细胞核得率，但本研究未对此进行评估¹⁴。根据非正式经验，相同组织在-80 °C下储存长达五年时，FANS回收效果仍可保持相当水平，但尚未开展对照实验以评估储存条件对细胞类型特异性表达变异的影响。抗体孵育后的洗涤步骤是另一个可能需要考虑的变量。通常情况下，洗涤步骤会降低总体得率，但可能改善不同免疫标记细胞群的分离效果。在本研究中，无论是否包含抗体孵育后的洗涤步骤，NEUN/PAX6细胞群的分离效果均未观察到差异；但在使用其他一抗和二抗时（尤其是未预偶联的抗体），该步骤可能具有优势。

由于分选设备的灵敏度存在差异，每次分选操作时都必须设置适当的对照。若在血细胞计数板上观察到重悬样本中存在过多.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS pH 7.2	Invitrogen	70013073
抗NeuN抗体 克隆A60	Millipore	MAB377A5MI	小鼠抗NeuN抗体与荧光化合物AF555偶联（激发波长553 nm；发射波长568 nm）
抗OLIG2抗体 克隆211	Millipore	MABN50A4MI	小鼠抗OLIG2抗体，偶联荧光染料AF488（激发波长499 nm；发射波长520 nm）
牛血清白蛋白	Fisher	BP9704-100
亮线计数室	豪泽科学	3110V
无水氯化钙	Fisher	C614-3
细胞滤网，40 µM	SP Scienceware	136800040
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
DL-二硫苏糖醇	Sigma	43815-1G
DNA文库试剂盒	Illumina，Nextera	FC-121–1030
DNA酶I	沃辛顿	LS002139
邓氏组织研磨器	WHEATON	357542
FACS 分选仪	BD 生物科学		BD FACSAria III
四水合乙酸镁	Fisher	M13-500
PAX6（PAX6/496）- 100 次检测	Novus	NBP234705J
RNA纯化 &和浓缩器	Zymo Research	R1013
RNaseZap RNase 去污染溶液	Invitrogen	AM9780
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input 哺乳动物	Clontech Laboratories	635005	片段化时间为2.5分钟，适用于RIN值较低的RNA。
蔗糖，结晶级，ACS，500 mg	Fisher	S5500
SW 41 Ti 摇摆桶转子	贝克曼库尔特	331362
Tris-HCl，1 M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯	赛默飞世尔科技	J22638AE
TritonX-100	Fisher	BP151-500	裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂
TRIzol LS 试剂	Invitrogen	10296028
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026	RNA提取试剂
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250061
超速离心机	贝克曼库尔特 Optima XE-100	A94516
超速离心管 PP 9/16 × 3-1/2	Beckman Coulter	331372
超纯去离子水（无RNA酶、无DNA酶）	Invitrogen	10977023	称为蒸馏水
超纯EDTA	Life Technologies	15576-028