单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

摘要

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。

摘要

冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种通过单颗粒分析（SPA）测定大分子复合物结构的强有力技术。整个流程包括：i）将样品在冷冻电镜载网上支撑的薄冰层中进行玻璃化；ii）对样品进行筛选，以评估颗粒分布和冰层质量；iii）若载网符合要求，则采集用于分析的单颗粒数据集；以及 iv）图像处理以获得电镜密度图。本方案概述了上述每一步骤，重点介绍用户在工作流程中可调整的变量以及常见问题的排查方法。随着远程操控显微镜在许多机构中成为常规操作，本文还将介绍成像方案的若干改进措施，以帮助用户在无法直接接触显微镜的情况下高效地完成操作与成像。

引言

单颗粒冷冻电镜（Single particle CryoEM）
要在分子水平上研究生命，我们必须理解其结构。目前已有多种技术可用于探测蛋白质结构，例如核磁共振（NMR）、X射线晶体学、质谱法以及电子显微镜技术（EM）。迄今为止，大多数提交至蛋白质数据库（PDB）的结构是通过X射线晶体学解析的。然而，自2012年左右以来，冷冻电子显微镜（cryoEM）逐渐成为蛋白质结构测定的主流技术，其应用迅速增长。截至2020年12月，提交至电子显微镜数据库（EMDB）的EM图谱总数已达13,421份，而2012年仅为1,566份（图1，www.ebi.co.uk）。2012年，提交至PDB的基于cryoEM密度图建模的原子坐标结构仅有67个，而截至2020年12月，已提交的此类结构达到2,309个，增长了35倍。这种cryoEM密度图在质量和数量上的根本性提升，有时被称为“分辨率革命”¹，其背后原因是多个领域技术进步的共同作用：包括用于成像的新型相机——直接电子探测器的开发、新软件的出现，以及更加稳定的显微镜系统^2,3,4。

图1：2012年至2020年12月期间向EMDB提交的数据累积数量。 请点击此处查看此图的放大版本。

单颗粒分析（SPA）是一种强大的工具，可通过解析分离复合物的高分辨率结构，为多种类型的样本提供生物学见解^{5, 6}，包括病毒^7,8、膜蛋白^{9, 10}、螺旋组装体¹¹以及其他动态且异质的大分子复合物^{12, 13}，其大小跨越多个数量级（从39 kDa^{14, 15}到数兆道尔顿）。本文描述了一种从样本到结构的冷冻电镜单颗粒分析标准流程的操作方案。

在启动该流程之前，应对纯化后的样品进行生化分析，以评估其后续实验成功的可能性。制备合适的样品可以说是进行单颗粒冷冻电镜（SPA）最大的障碍，特别是对于瞬时存在且具有异质性（包括组成和构象上的异质性）的复合物而言。大分子复合物样品应尽可能减少杂质，在足够高的浓度下确保每张冷冻电镜图像中能获得大量颗粒，并且缓冲液成分应适合冷冻电镜分析。某些缓冲液成分，如蔗糖、甘油以及高浓度（约>350 mM，具体取决于样品大小、性质及其他缓冲液成分）的盐类，可能会干扰玻璃化过程，或降低图像的信噪比，从而阻碍结构解析¹⁶。

通常，至少应使用尺寸排阻色谱（SEC）和SDS-PAGE凝胶分析来评估样品纯度^{17， 18}，但圆二色光谱、功能检测、SEC联用多角度激光散射以及热稳定性检测等方法，均为在进行冷冻电镜（cryoEM）分析前对大分子复合物样品进行定性分析的有用工具。然而，这些生化分析的结果可能难以揭示样品在结构上的异质性及其在冷冻电镜载网上行为的表现。因此，负染电镜被常规用作一种快速、经济且强大的工具，用于评估样品的组成和构象异质性，从而有助于确定纯化过程中哪个洗脱组分最具前景，或用于筛选不同的缓冲液组成^{19， 20}。一旦确定了有前景的样品，即可进入单颗粒冷冻电镜（SPA cryoEM）流程。需要注意的是，负染结果并不总是与后续的冷冻电镜结果一致；有时样品在负染中表现不佳，但在冷冻电镜的玻璃态冰中却有所改善。相反，有时样品在负染过程中表现极佳，但在进入冷冻电镜阶段时仍需大量进一步优化。然而，在大多数情况下，负染仍是一个有效的质量控制步骤。

玻璃化冷冻
电子显微镜真空系统内的严苛环境会导致未固定的生物样品发生脱水和辐射损伤²¹。因此，为了以接近天然的状态对样品进行成像，必须在成像前对生物样品进行保存。对于纯化的生物大分子复合物样品，玻璃化冷冻是首选的制备方法，可在利用冷冻电镜（cryoEM）对其进行观察的同时，保持该复合物的原子级细节。玻璃化冷冻作为样品制备方法的发现，是生物样品电子显微技术的一项根本性进步，杜博歇（Dubochet）也因此贡献获得了2017年诺贝尔化学奖。样品的玻璃化冷冻过程包括在冷冻电镜载网支撑膜上形成一层极薄的溶液层，其厚度通常仅为数十纳米，并将目标样品悬浮于其中。随后，该薄层在约-175 °C的液态乙烷等冷冻剂中被极速冷冻。冷冻速率可达约10⁶ °C/s，足够快以形成非晶态（即玻璃态）冰，从而使样品悬浮于一层薄而固态的玻璃态冰中²²。

需要考虑的首要变量是所选择的冷冻电镜载网支撑材料²³。电子显微镜载网通常由带有穿孔（规则或不规则）的无定形碳膜构成，并附着于支撑结构之上。该支撑结构通常为直径3.05 mm的圆形金属载网，多由铜制成，但也可使用其他金属，如金或钼（后者具有理想的热膨胀性能²⁴）。有时会在载网上额外覆盖一层薄而连续的支撑材料，例如石墨烯、氧化石墨烯，或一层薄的（约1–2 nm）无定形碳层。尽管迄今为止报道的绝大多数结构均使用标准冷冻电镜载网（最常见的是400–200目铜网，带穿孔碳支撑膜，如1.2 µm圆形孔洞间隔1.3 µm（r1.2/1.3），或2 µm孔洞间隔2 µm碳层（r2/2）；尽管存在多种不同的孔型模式），但已有研究报道了具有更高导电性并能减少样品漂移的新型载网技术²⁵。所选载网需经过辉光放电/等离子清洗处理，以使其表面亲水，便于样品加载²⁶。

辉光放电处理后，下一步是形成薄冰膜。最常用的方法是使用滤纸从载网上去除多余的液体以形成该薄冰膜。虽然此步骤可手动操作，但目前已有多种商用冷冻 plunge 设备可供选择，包括 Vitrobot Mk IV（Thermo Fisher Scientific）、EM GP II（Leica）和 CP3（Gatan）。使用这些设备时，将约 3–5 µL 溶液状态的样品加到电镜载网上，随后用滤纸吸去多余溶液。载网表面形成一层薄冰膜后，迅速将其浸入由液氮（LN₂）冷却至约 -175 °C 的液态乙烷中进行冷冻。冷冻完成后，载网需始终保持在玻璃化转变温度以下（-137 °C），直至成像前及成像过程中均不得升温。

样品筛选与数据采集
在冷冻电镜载网玻璃化后，下一步是对其进行筛选，以评估其质量，并确定该载网是否适合进行高分辨率数据采集。理想的冷冻电镜载网应具有非晶态冰（而非结晶冰），冰层厚度应刚好足以容纳样品最长维度，从而确保周围冰层对最终图像的噪声贡献尽可能小。冰层中的颗粒应具有与生物化学性质一致的大小和（若已知）形态，理想情况下为单一分散状态，并且颗粒取向呈随机分布。最后，载网上应存在足够多的高质量区域，以满足预期的数据采集时长需求。根据样品的不同，可能需要经过多次玻璃化和筛选迭代，才能获得最佳载网。幸运而又不幸的是，存在大量可经验测试的变量，可用于改变冷冻电镜载网上颗粒的分布情况（详见文献^16,27）。本文中展示了一个膜蛋白项目¹⁰的代表性结果。

一旦确定了合适的载网，即可开始数据采集。目前有多种用于生物样品的冷冻透射电子显微镜型号，均已优化为可自动采集高分辨率数据。通常在300 kV或200 kV系统上进行数据采集。可使用包括EPU（Thermo Fisher Scientific）²⁸、Leginon²⁹、JADAS³⁰和SerialEM^31,32在内的软件实现自动化数据采集。借助现代探测器进行自动化数据采集，通常在24小时内可产生数太字节（TB）的原始数据（平均数据集大小约为4 TB）。

由于全球大部分地区（撰写本文时为2020年12月）实施了与COVID-19相关的限制措施，许多显微镜平台已转向提供远程访问服务。一旦载网被装入显微镜的自动进样器，即可进行远程数据采集。

图像处理与模型构建
单次数据采集通常持续0.5至4天，而后续的图像处理则可能耗时数周甚至数月，具体时长取决于计算资源的可用性。初始图像处理步骤（即运动校正和对比度传递函数（CTF）估计）通常采用“实时处理”方式完成^{33, 34}。对于后续处理，目前有多种软件套件可供选择。颗粒从显微照片中被“挑选”并提取出来^{35, 36}。一旦完成颗粒提取，标准流程通常包括对颗粒进行多轮分类（包括二维（2D）和三维（3D）分类，或聚焦于特定感兴趣区域），以获得一组均一的颗粒子集。该均一颗粒子集随后被平均合并，生成三维重构结构。在此阶段，数据通常还需进一步校正以获得尽可能高质量的密度图，例如通过CTF精修、畸变校正³⁷和贝叶斯抛光（Bayesian polishing）³⁸。图像处理的最终结果是获得目标生物样本的三维冷冻电镜（cryoEM）密度图。在使用300 kV电镜系统、从质量足够的载网进行“标准”自动化单颗粒实验时，通常可达到的分辨率范围为10 Å至2 Å，具体取决于蛋白质复合物的大小和柔性。对于理想样本，目前利用单颗粒分析（SPA）工作流程已实现约1.2 Å的分辨率⁵。尽管本方案重点描述了获得电镜密度图的步骤，但在获得密度图后，还可进一步通过拟合和精修蛋白质结构模型（若分辨率< 3.5 Å）或从头构建（de novo）模型进行解析³⁹。与结构解析实验相关的数据可提交至在线公共数据库，包括电镜密度图（Electron Microscopy Data Bank）⁴⁰、所得原子坐标（Protein Data Bank）⁴¹以及原始数据集（Electron Microscopy Public Image Archive）⁴²。

在本实验方案中，以牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的外膜蛋白复合物RagAB（约340 kDa）作为大分子复合物的示例¹⁰（EMPIAR-10543）。对于初次接触冷冻电镜（cryoEM）的研究人员，可通过iNEXT Discovery和Instruct等资助获取计划，在经过同行评审的前提下，获得从样品制备到结构解析全过程的技术支持。

方案

1. 网格玻璃化法

注意：在执行步骤1和步骤2中的所有操作时，确保所有工具清洁、干燥，并在冷却至液氮温度前保持室温₂ 温度，使用新倾倒的液氮（LN）₂ 以减少冰污染。尽可能在湿度可控的环境中操作 < 20% 相对湿度。确保穿戴适当的个人防护装备和 H&在开始工作之前，必须确保所有文件记录已准备就绪。

1. 确保目标样本已准备好进行样品制备。
2. 选择合适的冷冻电镜载网，并确保这些载网已通过辉光放电或等离子体处理使其表面具有亲水性。尽管存在多种系统和方案变体，但其基本步骤均包括将载网放入辉光放电/等离子清洗系统中，运行程序使腔室抽至所需真空度，随后向系统中引入特定的气体混合物/化学蒸气或空气。通过系统施加电流，使气体粒子电离，从而改变载网表面性质，增强其亲水性。
3. 打开设备背面的电源开关，启动用于载网玻璃化的浸入式冷冻装置，并等待触摸屏加载完成。
4. 使用提供的触控笔或手指，在 控制台设定腔室的所需工作温度（可调范围为4-60 °C，大多数大分子建议使用4-6 °C）。
5. 使用注射器通过加湿器底部的橡胶管向其中注入50 mL II型实验室用水。注水前需确保注射器内无残留气泡。注意不要过度填充，以免水渗入腔室。加湿器注满后，将注射器活塞回抽5–10 mL，以形成真空密封。
6. 在 控制台设定腔室所需的相对湿度（可调范围为0-100%，通常使用95-100%的湿度）。在制备载网前请保持湿度设置为“关闭”，以免腔室过湿。
7. 获取冷冻固定装置的镊子，以及裁剪成合适尺寸的滤纸（滤纸尺寸需与样品台垫片匹配），可直接购买或使用打孔器裁切出适当大小的孔径。
8. 准备用于浸入式冷冻的冷冻剂。
   1. 将金属冷冻载网盒架、冷冻剂杯和金属蜘蛛腿放入冷却剂容器中。
   2. 通过向外部腔室注入液氮来冷却容器₂保持外室液面覆盖冷冻载网盒支架的顶部，再加入约 1 cm 深的额外液氮₂ 向冷冻杯中加入液氮以帮助系统达到液氮温度平衡₂ 温度
      注意：防污染环可用于减少湿气在液氮杯周围凝结，从而避免冷冻剂/乙烷被污染。在湿度受控的环境中通常无需使用防污染环。若使用防污染环，需注意不要将液氮容器过度填充₂ 或者在后续步骤中将环压入容器时可能发生溢出。
   3. 等待3-5分钟，观察蜘蛛腿沸腾情况，随后再等待3分钟，以确保冷冻剂杯足够冷，能够使玻璃化冷冻介质凝结。
9. 将冷冻剂（液态乙烷）汽化至冷冻剂杯中。
   1. 使用带有细管和喷嘴的乙烷气瓶管道来释放气体。此处理想的工具是将P200移液器吸头的尖端用剃刀片切掉以扩大开口。需要较大的开口以防止乙烷在尖端固化并堵塞气体流动。
   2. 确保冷冻剂杯中不含任何残留的液氮₂将乙烷气体喷嘴放入低温杯中。通过气体钢瓶调节器开启低流量，向低温杯中释放低温气体以使气体冷凝。使气体流出的喷嘴尖端紧贴低温杯内壁，并轻轻前后往复敲击杯壁表面。调节气体流量，使气体以较低且稳定的流速在低温杯内开始受控地冷凝/液化。
   3. 将杯子填充至银色蜘蛛状边缘稍下方，停止气体流动，然后小心移除气体管路，避免污染周围的液氮。₂ 乙烷。
   4. 用液氮（LN）加满冷却剂容器₂，需格外小心，避免将任何物质溅入液态乙烷中。
   5. 将蜘蛛的腿保持在原位约3-5分钟，以确保液态乙烷充分冷却至足够低的温度。此时冷冻剂会开始呈现浑浊或微不透明状，表明其已接近凝固点。在此阶段，使用镊子将蜘蛛取出。只要液氮₂ 保持在围绕冷冻剂杯的容器内时，乙烷可保持液化状态，并适用于玻璃化冷冻1-2小时。然而，应尽快完成操作，尤其是在未控制湿度的环境中，以减少冰污染。
      注意：如果蜘蛛似乎“粘住”了，可使用金属物体（如螺母）接触蜘蛛的腿部，使其略微受热，然后取下腿部。
10. 准备用于样品玻璃化的冷冻固定装置及配件。
11. 将网格储存盒加入金属液氮网格盒支架中，并在整个操作过程中确保液氮（LN₂）的持续供应。₂ 保持液面略高于网格盒的水平（通常每约5分钟添加一次）。
12. 在冷冻载网制备仪屏幕上，在 工艺参数 输入所选参数，包括：印迹时间（冷冻装置压块闭合的时间）、力度（印迹压块与载网之间的距离，可改变冰层形成的梯度）以及次数（印迹压块闭合的总次数）。应根据具体的冷冻装置及大分子的行为选择这些参数。典型参数值为：印迹力度0至5，印迹时间1至6秒，印迹次数1次。典型的等待时间（启动印迹至印迹开始之间的时间）和排液时间（印迹完成后至 plunge 冷冻前的时间）为0至2秒。
    注意：根据用户偏好，此处可提供其他选项 选项，杂项 可以选择特定区域，包括 使用脚踏板 每次按下时进入下一步， 跳过网格转移 （跳过最后一步中镊子臂略微抬起的操作），转动 处理过程中关闭湿度 （在加样过程中，停止对腔室进行主动加湿，这可能导致网格更难观察）且 自动升降乙醇提拉装置 （将镊子提升至腔室与提升冷却容器的步骤合并——跳过） 升高乙烷容器 步骤）。此处所有这些选项均处于开启状态。
13. 将冷却剂容器牢固地放置在腔室下方的移动平台臂上
14. 将新的吸水纸插入每个印迹臂上，并确保塑料环形夹固定牢固。每张滤纸可进行16次点样（印迹臂可旋转滤纸）。按下 重置印迹纸 按钮在 对照组 部分
15. 运行一次冷冻载网装置玻璃化冷冻程序的完整循环，以确保各运动部件均按预期工作。
    1. 按压（或使用脚踏板）以 放置新网格，然后 开始流程，然后 过程 然后 继续此时应观察并确保印迹臂按预期相互接触。
16. 打开加湿器。只要设定的湿度高于腔室当前湿度，就会产生水蒸气。
17. 现在可以对目标样品进行玻璃化冷冻。使用脚踏板或 放置新网格 冲压杆将从腔室中下降，从而可将镊子安装到支架上。
    1. 使用冷冻电镜载网镊子夹取所需辉光放电或等离子清洗后的冷冻电镜载网，注意根据载网制造商的说明确认用于加样的一侧。应夹取载网边缘，避免镊子与支撑膜发生过多或不必要的接触，以免损坏支撑膜。通过将黑色卡扣向下移动至镊子的带纹部分，将载网固定在镊子上。载网需被牢固夹持，但卡扣位置不宜过低，否则会接触滤纸片，导致不可重复的 blotting 效果；此外，在后续操作中释放卡扣时，需在该位置以下持握镊子。
    2. 将夹持冷冻电镜载网的冷冻装置镊子放置在气动臂上，确保正确的一面朝向你的惯用手。该冷冻装置镊子和腔室的设计允许用户根据自身利手选择从腔室的左侧或右侧加入样品。
       注意：使用相同的印迹参数在不同侧施加样本时，很少能得到可比较的结果，因此左利手研究人员可能需要独立优化其印迹参数，而不能沿用右利手同事的参数。
    3. 按压 开始流程 镊子夹持的载网将被放入腔室，随后提升冷却剂容器。
    4. 按压 过程 镊子将网格移至可使用移液枪将样品施加到网格的位置。打开朝向网格正确一侧的侧口，通过移液施加样品，注意移液枪尖端不要接触网格，以免损坏网格支撑或导致网格弯曲，但需将液体释放得足够近，使液滴能够滴落到网格上。通常施加3-5 µL。
18. 按压 继续 用户预设参数将控制网格的点样，随后将载有网格的镊子迅速浸入冷却剂杯中，以实现样品的玻璃化冷冻。镊子将随同承载冷却剂容器及冷却剂的机械臂一同下降，确保网格始终浸没在冷冻剂中。
19. 将载网从冷冻剂杯转移至浸没在液氮中的载网储存盒₂.
    1. 将镊子从镊子臂上取下，务必小心，避免玻璃化网格接触到冷冻剂杯的侧壁。调整握持方式，使镊子握持舒适。尽快且小心地将网格从冷冻剂转移至液氮中_2. 一只手用手指夹紧镊子使其闭合，另一只手将黑色卡扣向上滑动移开，保持镊子处于闭合状态。调整握持姿势，将网格放入网格储存盒中。
    2. 重复步骤 1.10–1.19，直至完成所有载网的制备（一次常规实验通常制备 4–12 个载网）。将所有装有载网的载网储存盒存放在液氮中₂ 杜瓦瓶中保存，直至进入下一阶段。

2. 将网格剪切用于装入自动进样显微镜

1. 根据先前所述的方案²⁸，将载网插入自动载网组装装置中。

3. 显微镜的安全远程登录

注意：在撰写本文时，由于 COVID-19 的防控措施以及国际旅行相关的环境问题，越来越多的显微镜设施开始提供远程操作服务。各设施的具体实施方式将根据其本地 IT 配置以及内部和外部用户群体的需求而有所不同。本文描述了远程访问电子生物成像中心（eBIC）的冷冻电镜（cryoEM），并通过 EPU 软件控制显微镜的操作流程。

1. 远程登录至冷冻电镜系统。远程登录通过 NoMachine 软件实现，用于访问显微镜支持计算机，并且仅允许通过用户访问期间注册的 FedID 登录凭据进行访问。访问权限仅在会话持续期间有效。
2. 启动 NoMachine 并通过密码认证，新建一个连接至 nx-cloud.diamond.ac.uk 的 NX 连接。
3. 打开连接，使用用户名 fedid@fed.cclrc.ac.uk 和 FedID 密码登录。从可用选项中双击对应显微镜的图标，以连接至相应的支持计算机。
4. 在 Windows 登录界面输入用户名 clrc\FedID 和密码。
5. 从桌面图标启动 TeamViewer 软件，并使用提供的密码连接至 PartnerID: TEM。此操作将建立支持计算机与透射电镜（TEM）计算机之间的连接。在 TeamViewer 功能区中，可使用 下一个显示器 按钮在显微镜用户界面与 EPU 窗口之间切换。
6. 随后，用户可通过 EPU 界面直接控制显微镜功能。

4. 将样品载入自动进样显微镜并筛选冰晶及样品质量

注意：本节使用配备自动进样器和 EPU 软件的显微镜进行样品筛选，但也可使用其他软件、侧插式系统以及来自其他制造商的冷冻电镜实现相同目的。

1. 按照先前所述方法将切好的载网装入显微镜自动进样器中²⁸。
2. 在显微镜用户界面的自动进样器选项卡中，使用箭头键切换至选项对话框，然后点击库存按钮。系统将依次检查卡匣中的每个位置，以确定是否存在样品盒。已占用的插槽将以蓝色标记。若所有已占用插槽均已完成映射，请再次点击库存按钮以在当前位置后停止；否则请保持运行，直至所有已占用插槽均被映射。在提供的输入框中为所有已占用插槽标注相应的样品信息。
3. 选中需转移至显微镜镜筒的载网，然后点击加载。当载网成功加载到载物台上后，插槽标签将由蓝色变为黄色。随后开始对载网进行筛选。
   1. 打开 EPU 软件。在准备页面中，选择采集光学参数与设置，然后从下拉菜单中选择图谱预设。选择合适的电子束设置预设（例如，64倍标称放大倍数，束斑大小5，微探针模式，Falcon探测器使用平行范围的照明区域；有关电子束设置预设的选择详情，请参见²⁸）。点击设置以将参数推送至显微镜。
   2. 点击打开镜筒阀门并插入荧光屏。检查是否可见电子束，且其扩散程度和中心位置是否足以覆盖整个探测器。如有必要，使用操纵杆或载物台菜单控制X和Y方向的载物台移动，导航至载网较薄的区域。
   3. 升起荧光屏，然后在 EPU 中点击预览按钮获取图像。根据所获得的图像，可通过选择更小编号的束斑大小来增加剂量，反之亦然。
   4. 在EPU中，进入图谱页面并点击新建会话。选择 MRC 图像格式，并输入用于保存筛选会话的合适文件夹名称和路径，然后点击应用。
   5. 在左侧菜单中选择筛选。勾选每个需要采集图谱拼接图像的载网对应的复选框。在 EPU 中点击开始以启动筛选会话。每个被选中的载网将生成一幅图谱，完成后将列出可用的网格方格数量。可通过在筛选页面上选中对应图谱进行查看，图谱上将以不同颜色标注预测冰层厚度相似的网格方格。
4. 完成后，回顾所采集的图谱，识别出适合在更高放大倍数下评估样品质量的载网（即具有适当数量、既不干燥又未被厚冰遮蔽的网格方格的载网）。在 EPU 筛选菜单中高亮选中目标载网，然后点击加载样品。
   1. 使用电子束设置预设（参见²⁸ 了解各阶段所需电子束设置预设的说明）以及预览功能，对目标网格方格进行更详细的观察。
   2. 在图谱筛选菜单中，选择当前已加载的载网，通过在载网图像上的目标位置右键点击并选择“移动至网格方格”，将载物台移至包含完整孔洞的网格方格。
   3. 返回至EPU，准备页面，并选择网格方格预设。
   4. 打开EPU，自动功能页面，使用网格方格预设运行通过载物台倾斜自动调中，以将样品移至同心高度。
      注：也可使用通过电子束倾斜自动调中功能，该方法速度更快，但通常精度低于通过载物台倾斜自动调中。
   5. 在EPU，准备页面中，获取新的网格方格预览图像。注意不同孔洞间灰度值的差异，这反映了冰层厚度的不同。使用右键点击 > 将载物台移至此处将载物台移动至某一孔洞上方。选择孔洞/同心高度预设并进行预览。
      注：根据目标颗粒的分子量和形状，可能可在孔洞/同心高度放大倍数下识别出颗粒。
   6. 选择数据采集预设，设置一个便于清晰识别颗粒的放大倍数（通常对应于每像素采样间距 <2 Å/像素）。将离焦量设为约 -3 至 -5 µm，电子曝光剂量设为约 40–80 e^-/Ų。
5. 重复步骤 4.4，评估载网上不同冰层厚度区域的颗粒分布、取向及污染情况。颗粒分布可能在孔洞边缘附近与中心区域存在差异，因此有必要在孔洞内不同位置进行调查。
6. 对所有在图谱中显示具有足够可用网格方格的载网进行筛选。可选择将这些载网保留在显微镜中并使用 EPU 进行后续数据采集，或从显微镜中卸下载网并在液氮（LN₂）中保存，直至安排数据收集。

5. 单颗粒冷冻电镜数据采集（侧重于远程操作）

注意：使用 EPU 进行数据采集的详细方案在制造商手册及其他文献中有详细描述²⁸。此处重点介绍该方案在远程操作方面的修改（即减少使用手动控制面板执行任务，转而采用基于软件的替代方法）。

1. 除非在本次会话中已采集过网格的图谱，否则需为网格采集一张图谱。
2. 根据项目的实验需求，定义每个光束设置预设项。
3. 执行图像偏移校准²⁸。
4. 设置 EPU 会话。
   1. 在 EPU 中，选择 EPU 页面，然后 会话设置，选择新建会话 ，然后选择 从偏好设置新建。
   2. 选择 新建会话 后将弹出窗口，提供使用先前设置的选项。是将自动从上一次 EPU 会话中加载设置（例如样品载网、离焦范围、自动对焦设置、网格类型）至当前 EPU 会话。选择 从偏好设置新建 可让用户选择一个保存了偏好设置的文件（例如离焦范围、自动对焦设置、网格类型），这些信息将被预加载到 EPU 中。
   3. 填写具有描述性的会话名称。本地设施可能建议采用特定的命名规范。
   4. 在 类型 中，选择 手动。
   5. 对于 采集模式，选择 精确孔中心定位 或 快速采集。
   6. 在 图像格式 中，选择所需的格式。
   7. 选择合适的 存储文件夹，EPU 将创建一个以会话名称命名的目录。
   8. 根据所使用的网格类型和孔间距，选择合适的 样品载网 （例如 Quantifoil 1.2/1.3），然后点击 应用。本方案描述了为规则排列的孔阵列生成模板的过程。
5. 选择初始网格方格并设置采集模板。
   1. 进入 方格选择，若所有方格均为绿色，请点击左上角的“取消全选”。
   2. 打开瓦片图像（右键 > 打开瓦片）。选择一个方格（右键 > 添加，右键 > 将载台移至网格方格）。
   3. 进入 孔选择 并点击 自动同心。等待操作完成并获取一张网格方格图像。如果自动功能失败，可能是由于高度偏差较大；此时可在网格方格放大倍数下使用 FluScreen 手动调整。
   4. 测量孔的尺寸。移动并调整黄色圆圈，使其覆盖孔洞，并正确反映孔的大小和间距。
   5. 点击 查找孔。检查孔是否被正确识别。若未正确识别，请更改孔的尺寸后再次查找孔。重复此步骤直至正确识别孔。若始终失败，可考虑在网格方格放大倍数下改用较小编号（更亮）的光斑尺寸。
   6. 使用右侧的 冰层质量过滤 直方图调整孔的选择。这有助于排除冰层过厚或过薄的区域。该设置将在本次会话中后续选择的网格方格中被记住。
   7. 使用顶部 选择 菜单中的工具优化孔的选择。例如，点击 移除靠近网格条的孔。
   8. 进入 模板定义 并点击 采集。
   9. 点击 查找并居中 孔。此时将显示一个孔的图像，孔周围带有黄色圆圈。
      注：如果难以找到孔，可插入物镜光阑。若仍无法找到孔，可尝试增加孔/同心高度预设的曝光时间，或增加该预设的离焦量，或对图像进行 binning 处理。较大的离焦变化可能影响图像偏移的对准。
   10. 将 载台移动后延迟 和 图像偏移后延迟 时间设置为 1–5 秒。
   11. 检查 最大图像偏移 值（如该选项可用）是否符合预期。若使用无像差图像偏移采集，该值在 EPU 配置文件中定义；否则，5 µm 为标准值。
   12. 点击 添加采集区域，然后在图像任意位置点击。将采集区域移动至目标位置（例如孔边缘），以避免采集区域被电子束重复曝光（绿色圆圈内的方块代表探测器区域，绿色圆圈代表电子束直径）。
   13. 在右上角添加离焦范围，然后添加其他采集区域。膜蛋白项目的典型离焦范围为 -0.8 至 -3 µm。
   14. 点击 添加自动对焦区域，然后在图像任意位置点击。将自动对焦区域移至孔周围的碳膜区域。标准做法是在使用 AFIS 时对中后进行自动对焦，或每 5–15 µm 进行一次自动对焦，具体取决于方格内 z 轴高度的变化情况。
   15. 点击 添加漂移测量区域，每个网格方格进行一次漂移测量，设定阈值为 0.05 nm/s 是标准设置。漂移测量区域可以（且建议）与自动对焦区域完全重叠。请确保漂移测量区域和自动对焦区域均不与采集区域重叠。
       注：可使用模板执行功能检查模板。这有助于判断采集区域是否需要调整（例如图像中碳膜过多或过少），但并非必需步骤。
   16. 返回 方格选择，在网格上选择用于采集的方格。根据采集区域数量和预期的数据采集速率（由设施根据探测器和实验设置提供）预估所需采集区域的数量。
   17. 当所有目标方格均被选中后，点击 准备所有方格。
   18. 每个方格采集完成后，在各网格方格之间切换，并使用 选择画笔 对孔进行微调。
6. 将载台移至样品上方的某一位置，使用自动功能设定同心高度。按照先前所述方法进行显微镜对准²⁸，但无需手动执行无彗差对准和校正物镜像散，而应利用软件内的对准工具。简要步骤如下：设定采集光束条件，确保已移除物镜光阑（OA），并将载台置于同心高度下样品中电子束稳定的区域。在重新插入并居中物镜光阑之前，先在自动功能中完成无彗差对准，然后使用 EPU 校正物镜像散。确保两项对准均收敛至合理数值（<150 nm 彗差，像散接近零）。
   1. 在开始自动采集运行前，确保自动进样器的涡轮泵已关闭，并已插入物镜光阑。
7. 在 自动采集 中，点击 开始运行 以启动自动数据采集。

6. 图像处理以获得电镜密度图

注意：大多数冷冻电镜设施提供显微照片电影的“实时”预处理。可用于此目的的软件包和方法有多种，包括 RELION 流程^28,33、cryoSPARC⁴³、Scipion³⁴ 和 WarpEM⁴⁴。本文描述的是基于 RELION 的流程，并假设用户已将显微照片电影文件移至具备计算资源访问权限的适当存储位置。文中提供了一个膜蛋白项目的流程概述和代表性结果，详细的说明和分步教程可在 RELION 官网获取：https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion。

1. 执行显微照片的实时运动校正与CTF估计分析。在项目目录内启动RELION，安排导入、运动校正和CTF估计任务形成循环，使其与数据采集和传输过程同步进行。显微照片分析脚本²⁸ 提供关于散光和估计离焦值的实时视觉反馈（参见代表性结果）。
2. 从预处理的显微照片中选取颗粒。可选择多种自动颗粒挑选软件包。在 RELION 的自动挑选选项卡中，提供无参考和基于模板的颗粒挑选方法。³⁷. 其他程序也可用于各个步骤，例如使用 crYOLO 进行颗粒挑选³⁵.
3. 从CTF校正后的显微照片中提取颗粒。
   注意：为了减少早期“清理”处理步骤所需的计算时间，在提取粒子时可进行降采样（下采样）或合并像素（binning）。有关如何运行提取任务的详细信息，请参见 RELION 3.1 教程。在本项目中，粒子初始时按因子 2 进行了合并像素处理。
4. 进行二维分类平均。对于包含 ≥100,000 个颗粒的大多数数据集，划分为 100–200 个类别效果良好。除非样品具有高对称性（例如二十面体病毒），否则不建议使用超过 200 个类别或少于 50 个类别；在样品对称性较高的情况下，即使类别少于 50 个，仍可能获得良好结果。设置的掩膜直径应足够大，以容纳颗粒的最长维度，同时又足够紧凑，以排除邻近颗粒（这可能需要多次尝试和调整）。
5. 使用子集选择任务筛选优质类别（即具有结构细节的类别）。优质和劣质的二维类别平均图像示例可参见代表性结果部分。
6. 生成初始模型 从头合成 使用 RELION 中的 3D 初始模型任务从数据中生成。
   注意：纯度较低的颗粒堆栈可通过多参考方法获益 从头算 由于SGD（随机梯度下降）优化能够进一步筛选出无用或次优的颗粒，因此建议进行SGD优化。选择一个能够容纳目标颗粒的掩模直径，并保留“SGD”选项卡中各参数的默认值，因为这些默认值通常表现良好。确保初始模型在Chimera（或其他合适的可视化程序）中看起来合理（参见代表性结果）。
7. 使用第6.6步的输出作为参考模型，进行三维分类以解决数据中的异质性问题。在Chimera中评估所得的三维重构图。对对应于独特构象状态的颗粒堆栈进行独立处理。使用子集选择任务（subset selection job）选取感兴趣的类别，并为相关颗粒堆栈生成particles.star文件。
8. 运行3D自动精修。将上一步获得的3D分类平均结果作为参考，用于相应粒子堆栈的精修。如果精修分辨率接近数据的奈奎斯特极限，则需在不进行降采样的情况下重新提取粒子。重新提取后，使用未合并的粒子堆栈重复执行3D自动精修任务。此时，必须对3D参考模型进行重新缩放，使其像素尺寸和盒尺寸与重新提取的粒子图像保持一致。使用relion_image_handler命令行工具执行此操作。
9. 在适当情况下利用对称性进行精修。如果重构的三维密度图具有对称性，应使用 relion_align_symmetry 命令行工具将该密度图沿相应的对称轴进行对齐。随后，在新的三维自动精修任务中，于参考图设置选项卡中指定相应的对称性操作符，并将对齐后的密度图作为参考图使用。
10. 通过3D自动精修获得的电子密度图进行锐化。该步骤需在RELION中使用后处理任务完成，但首先需从精修后的电子密度图创建一个合适的掩模。掩模创建与后处理的具体步骤详见RELION教程（参见代表性结果部分）。
    注意：可使用 RELION 中的贝叶斯优化和 CTF 精修功能进一步提高许多重构的分辨率。使用 CTF 精修任务类型来估计并校正高阶像差（包括电子束倾斜、三叶像差和四阶像差）。^th 像差）以及各向异性放大倍率和单颗粒离焦值，这些参数应分别进行处理。接下来，使用贝叶斯抛光任务（可采用训练模型或默认参数）对每个颗粒的束流诱导运动进行校正。如 RELION 3.1 教程所述，这些任务可能从迭代流程中获益（CTF 精修 → 贝叶斯抛光 → 三维自动精修 → 后处理 → …循环），因为两者均能从更高分辨率的模型中受益。
11. 如有必要，校正电子显微镜密度图的手性。通过尝试拟合现有的原子模型或评估α螺旋区域的手性来检查密度图的手性是否正确。如需校正，可在UCSF Chimera中沿z轴翻转密度图。⁴⁵ 使用“vop zflip”命令。

结果

在筛选过程中，可在图谱阶段丢弃不合适的载网，因为在低倍率下已能分辨出不适合进行数据采集的特征。例如，当载网受到严重机械损伤，大部分网格方格已破裂（图2A），或载网呈现“干燥”状态，缺乏玻璃态冰（图2B）。此类载网通常可通过观察识别：其网格方格的边缘显得锐利且清晰。在大多数使用冷冻浸渍装置制备的载网中，均可观察到冰层厚度的梯度变化（图2C、D）。颗粒分布情况会因样品不同而显著受冰层厚度影响，因此建议筛选多个网格方格以评估颗粒分布状况。EPU软件在图谱筛选步骤中已提供工具，帮助用户识别冰层厚度相似或不同的网格方格，这对初次检查冷冻电镜载网的用户尤为有帮助（图2E、F）。

图2：筛选实验中低倍放大的“图谱”拼接示例。A一个遭受严重损坏的网格，大多数网格方格已断裂——不适合用于样本收集。 B无玻璃态冰的干燥载网——不适合用于样品采集。 C显示冰梯度的网格，其中约 50% 的网格区域可用。 D) 具有约 33% 可用网格面积的冰梯度。两者 C 和 D，如果可用的网格区域具有适合采集的冰层厚度，并且有足够的采集区域以满足最短采集时间（例如24小时）的要求，则适合进行数据采集 E) 一个包含不同冰层厚度范围的图谱示例。F) 与 E 相同的图谱，但网格方格已由 EPU 软件根据冰层厚度进行分类并着色。 请点击此处查看此图的放大版本。

在筛选颗粒分布时，应确保成像参数（如放大倍数和总电子剂量）与数据采集阶段预期使用的参数相近，以准确预估实验结果。筛选过程中，理想的颗粒分布应为单一分散状态，并可见多种颗粒取向（根据样品特性及对颗粒形态的已有认知，这一点可能较难判断）（图3A）。冰层厚度应尽可能薄，但需足以容纳颗粒的最大尺寸；若冰层过薄，在电子束照射下可能发生熔化，导致显微图像中出现过度漂移，此类区域应予以避开（图3B）。根据综合经验，当缓冲液中含有去垢剂时，该现象尤为常见。这可能导致孔洞中心区域的冰层极薄，从而使颗粒被物理性排斥并推向边缘。该效应如图3C所示，但在本例中并不严重，这些图像仍可有效用于数据集的构建。最后，冰层必须呈玻璃态；在数据采集时，应排除任何载网（或多个载网）上大多数或全部图像显示为晶态冰的区域（图3D）。通常，非玻璃态冰多出现在载网方格的边缘。有关制样玻璃化过程中可调节变量的详细综述¹⁶，以及颗粒在薄膜环境中行为特征的描述^{46, 47}，可供读者进一步参考。

图 3：显示不同颗粒分布的代表性显微照片。A) 单分散颗粒呈现多种取向的“理想”分布。B) 孔中心区域冰层过薄，在电子束照射下发生形变，导致显微照片中出现过度运动。当缓冲液中含有去垢剂时，此现象最为常见。C) 当孔中心冰层较薄时，颗粒在物理上被排斥至中心区域之外，导致颗粒在孔边缘聚集。此种情况尚未严重到使图像无法使用，但提示应尝试筛选稍厚的区域。D) 冰非玻璃态，不应在此类显微照片所示区域收集数据。请点击此处查看该图的放大版本。

实时图像处理有助于发现数据采集过程中的错误和问题，因此只要条件允许，始终建议使用。例如，显微照片中过度的运动可能表明自动进样器的涡轮泵处于工作状态，或者数据是在网格方格出现裂纹的区域采集的，导致冰在电子束照射下发生明显移动，此时应跳过该网格方格。实时CTF估计可以揭示应用了正焦距点（而非离焦）的情况（使用CTF估计程序及相关参数来识别这些点），并确定使用Volta相位板⁴⁸时的相位偏移量。实时图像处理流程通常包含数据的图形化汇总（图4A），以便用户快速评估显微照片质量，并判断是否需要对数据采集参数进行调整。

从显微照片中选择颗粒时，需避免诸如污染或载网支持膜等“假阳性”信号，这一过程可能需要进行优化。然而，像 crYOLO 这样的颗粒挑选工具通常使用默认参数即可对数据进行有效的初步筛选（图4B），从而推进至二维分类平均步骤，在此步骤中可更易于评估数据质量以及后续分析成功的可能性。对于大多数项目，对约>10,000个颗粒进行二维分类后，应能开始分辨出具有二级结构细节的类别。要进入三维重构，二维分类阶段通常应揭示出代表颗粒多种取向的类别。若发现存在优势取向，则可能需要进行更多轮次的样品制备¹⁶，或在样品倾斜状态下进一步采集数据⁴⁹。所有显示二级结构细节的类别均应被选中用于后续三维分析，而“垃圾”颗粒则予以剔除（图4C）。

图 4：初始图像处理步骤。A) 来自“实时”图像处理脚本的输出结果。B) 示例显微照片（左图），其中使用 crYOLO 通用模型自动挑选出的颗粒被正确识别（右图，颗粒由红色方框标出）。比例尺（白色）为 50 nm。C) 二维分类结果，显示了被舍弃的类别（红色方框内），以及保留用于进一步处理的颗粒类别（绿色方框内）。请点击此处查看此图的放大版本。

一小部分颗粒可用于生成初始模型（图5A）。该初始模型随后可作为三维分类与精修的起始模型。以RagAB为例，数据集中包含三种不同的构象异构体，这些异构体可在三维分类过程中被分离（图5B）。归属于每一类别的颗粒可被独立处理，并用于精修电子显微镜密度图，进而进行进一步的结构解析与模型构建。

图5：生成3D电子显微密度图。A) 使用RELION生成的典型初始模型。B) 对5个类别进行3D分类，显示颗粒被分为三种不同的构象状态：开放-开放（绿色）、开放-闭合（蓝色）、闭合-闭合（紫色）。C) 掩模（mask）创建过程。将3D精修得到的图谱（左侧）在Chimera中可视化，然后使用体积查看器确定图谱中无断裂或噪声密度时的最低阈值（中间）。将该阈值作为初始二值化阈值输入RELION的掩模创建任务中。右侧显示的是生成的掩模示例（灰色）。D) RagAB开放-闭合状态的高分辨率电子显微密度图（EMD-10245），经滤波并按局部分辨率（Å）着色。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在本方案中，我们描述了一种适用于可进行常规单颗粒分析（SPA）样品的基本流程。尽管这种使用滤纸 blotting 制备薄层并实现玻璃态冷冻的方法在迄今为止绝大多数 SPA 项目中已被证实是成功的，但它仍存在若干缺点。这些问题包括样品浪费、形成薄层和冷冻样品所需时间较长（数秒级）、文献报道的不可重复性²⁷，以及使用滤纸去除多余液体可能带来的负面影响⁵⁰。近年来，已开发出新技术以提高薄层制备的可重复性^{51, 52}。此外，其他技术的发展也缩短了样品施加至玻璃态冷冻之间的时间间隔^53,54,55。尽管在撰写本文时，基于滤纸的薄层制备方法仍是 SPA 冷冻电镜样品制备中最普遍使用的技术，但这些新兴技术可能在网格玻璃化效率与可重复性方面带来多种优势，同时为引入新的实验维度创造机会，例如时间分辨能力以及在玻璃化前实现快速混合。

目前，大多数用户进行载网筛选的过程是一种定性方法，通常先获取低倍率的图谱，然后在载网上采集高倍率图像以评估颗粒分布情况。尽管这种方法对某些类型的样品已足够可靠，但仅凭肉眼判断样品是否符合研究人员预期（例如是否存在优势取向）仍可能存在困难，特别是对于较小的样品（<200 kDa）或低分辨率形貌难以辨识是否存在多种颗粒分布的情况。对于某些项目而言，仅凭观察甚至无法确定样品是否符合目标，例如配体是否结合，或样品筛选旨在确认一个小的（如10 kDa）亚基是否仍与复合物结合。针对此类项目，若能结合“短时”0.5–1小时的数据采集，并通过全自动化的数据分析流程，快速完成图像处理、2D分类甚至3D分类与优化，将有助于高效判断是否值得进行更长时间的数据采集。目前这类自动化流程仍在开发中，尚未广泛实施，但其在提升冷冻电镜载网筛选效率方面具有巨大潜力，尤其适用于具有挑战性的样品。

直接电子探测器的改进，以及显微镜技术的优化与图像处理技术的进步（如图像偏移数据采集）相结合，显著提高了数据采集过程中所获得图像的通量和质量。数据采集速率的提升凸显了在获取大量TB级数据之前，对冷冻电镜载网进行彻底筛选的必要性。

冷冻电镜单颗粒分析（CryoEM SPA）已成为真正主流的结构生物学技术，在许多情况下更是某些类型样品（如异质性和不稳定的大型分子复合物）的首选方法。尽管本方案仅概述了SPA的基本流程，但其中涉及的每个环节（载网玻璃化与筛选、冷冻电镜成像及图像处理）本身都是值得深入研究的独立课题，应在开展SPA项目时予以充分探索。随着样品制备和显微成像技术的进步，以及新的图像处理算法和方法的不断涌现，SPA流程将持续发展，助力研究人员深入理解复杂的生物系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钝头镊子	Agar Scientific	AGT5022
冷冻电镜圆形储存盒	Agar Scientific	AGG3736
冷冻电镜自动网格盒	ThermoFisher Scientific	1084591
冷冻电镜载网	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
乙烷气体	Boc	270595-F
液氮 泡沫杜瓦瓶	Agar Scientific	AG81760-500
液氮 储存杜瓦瓶	Worthington industries	HC 34
移液器	Gilson	10082012
移液器吸头	Star labs	s1111-1706
注射器	BD	BD 300869
II型实验室用水	Suez	select fusion
Vitrobot	ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot滤纸	Whatman	1001-055
Vitrobot泡沫塑料容器组件	ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot镊子	ThermoFisher Scientific	72882-D
软件
EPU	ThermoFisher Scientific	2.8.1.10REL
TEM服务器	ThermoFisher Scientific	6.15.3.22415REL
Tia	ThermoFisher Scientific	5.0.0.2896REL
Titan Krios显微镜	ThermoFisher Scientific	Titan Krios G2