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方法文章

神经母细胞瘤转移的斑马鱼模型

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DOI：

10.3791/62416

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2021年3月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

本文内容

摘要

本文介绍了在神经母细胞瘤的斑马鱼模型中实时开发、表征和追踪肿瘤转移的方法，特别是针对MYCN和LMO1过表达的转基因斑马鱼品系，该品系可自发产生转移。

摘要

斑马鱼已成为研究人类疾病，尤其是癌症的重要动物模型。结合在斑马鱼建模中广泛应用的高效转基因和基因组编辑技术，以及其易于饲养、繁殖力高和强大的活体成像能力，斑马鱼成为研究转移过程及其细胞与分子基础的宝贵模型系统 体内首个斑马鱼神经母细胞瘤（NB）转移模型是通过过表达两个癌基因建立的， MYCN 和 LMO1，由多巴胺-β-羟化酶（dopamine-beta-hydroxylase,dβh）启动子。共过表达 MYCN 和 LMO1 导致神经母细胞瘤发生的潜伏期缩短、外显率增加，以及肿瘤细胞远处转移的加速。该新模型稳定重现了人类转移性神经母细胞瘤的多个关键特征，包括临床相关且与转移相关的遗传学改变，以及转移的自然自发性发生。 体内；以及转移的保守位点。因此，斑马鱼模型在解析肿瘤转移这一复杂过程方面具有独特优势 体内.

引言

斑马鱼已被广泛应用于多个研究领域，尤其是在癌症研究中。该模型具有诸多优势，例如繁殖能力强、维护成本低，以及能够多途径可视化肿瘤生长和转移过程，这些特点使斑马鱼成为研究肿瘤发生和转移的细胞与分子基础的有力工具。近年来，大规模基因组作图、转基因、基因过表达或敲除、细胞移植以及化学筛选等新技术极大地增强了斑马鱼模型的研究能力1。在过去几年中，已开发出多种斑马鱼品系，用于研究包括白血病、黑色素瘤、横纹肌肉瘤和肝细胞癌在内的多种人类癌症的肿瘤发生与转移过程2,3,4,5。此外，首个神经母细胞瘤（NB）的斑马鱼模型是通过在多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子的调控下，在外周交感神经系统（PSNS）中过表达致癌基因MYCN而构建的。利用该模型，进一步证明了活化的ALK可与MYCN协同作用，加速肿瘤的发生并提高肿瘤的外显率in vivo6。

神经母细胞瘤（NB）起源于神经嵴细胞的交感肾上腺谱系，是儿童中一种高度转移性的癌症7。NB导致约10%的儿童癌症相关死亡8。在诊断时通常已广泛转移，临床上表现为主要起源于交感神经节链和周围神经系统（PSNS）肾上腺髓质的肿瘤9,10。MYCN基因扩增通常与NB患者预后不良相关11,12。此外，LMO1已被确定为高危NB病例中的关键易感基因13,14。研究发现，在斑马鱼模型中，MYCN和LMO1在PSNS中的转基因共表达不仅促进NB的早期发病，还可诱导肿瘤广泛转移至与高危NB患者常见的转移部位相似的组织和器官13。最近，在另一种新型斑马鱼NB模型中也观察到类似的转移表型，该模型在dβh启动子调控下同时过表达MYCN和编码RNA结合蛋白的Lin28B16。

斑马鱼中的稳定转基因方法常用于研究目的基因的过表达是否会影响正常发育及疾病发病机制14,15该技术已成功用于证明多个基因和信号通路在神经母细胞瘤发生中的重要作用6,16,17,18,19,20本文将介绍如何构建过表达两者的转基因鱼系 MYCN 和 LMO1 在PSNS中构建了模型，并证明了这两个癌基因的协同作用可加速神经母细胞瘤（NB）的肿瘤发生及转移进程13首先，使用过表达的转基因品系 EGFP-MYCN 在……的控制下 dβh 启动子（指定为 MYCN 线）是通过注射开发的 dβh-EGFP-MYCN 将构建体注入野生型（WT）AB品系胚胎的单细胞期，具体操作如前所述6,17. 一个独立的转基因品系，该品系过表达 LMO1 在PSNS（指定 LMO1 线) 是通过共注射两种DNA构建体开发的， dβh-LMO1 和 dβh-mCherry，于单细胞阶段注射到野生型胚胎中13已有研究表明，共注射的双DNA载体可共同整合到鱼类基因组中；因此， LMO1 和 mCherry 在转基因动物的PSNS细胞中共同表达。一旦注射的F0胚胎达到性成熟，便与野生型鱼进行杂交，以鉴定出携带转基因整合的阳性鱼。简而言之，首先通过荧光显微镜对F1后代进行筛选 mCherry PSNS 细胞中的表达。生殖系整合的 LMO1 在mCherry阳性鱼中通过基因组PCR和测序进一步确认。在成功鉴定每个转基因品系后，杂合子后代的 MYCN 和 LMO1 转基因鱼相互交配，以培育出可同时表达两种外源基因的复合鱼系 MYCN 和 LMO1 （指定） MYCN；LMO1 线。荷瘤 MYCN；LMO1 每两周通过荧光显微镜监测鱼类，以观察原发部位远端区域（即间肾腺区域，IRG，相当于人类肾上腺的斑马鱼组织）是否存在转移性肿瘤的证据。13. 为确认肿瘤的转移情况 MYCN；LMO1 对鱼类进行了组织学和免疫组织化学分析。

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方案

所有使用斑马鱼的研究方法及动物护理/饲养均遵循梅奥诊所的机构指南。

1. 用于建立在PSNS中过表达LMO1的转基因斑马鱼品系的转基因构建体的制备与显微注射

  1. 为构建LMO1-pDONR221入门克隆，使用PCR从人细胞系获得的cDNA中扩增人LMO1的编码区。
    1. 配制25 µL反应体系，具体如下：2.5 µL 10x标准Taq反应缓冲液，0.125 µL Taq DNA聚合酶，0.5 µL 10 mM dNTPs，2 µL cDNA模板，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB1正向引物，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB2反向引物，以及18.875 µL水。
      ​注意：使用LMO1 ATTB1正向引物：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'。
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3'，以及LMO1 ATTB2反向引物：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. 采用以下程序进行扩增：94 °C预变性2分钟，1个循环；随后进行30个循环（94 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后72 °C延伸7分钟。
  2. 通过BP重组酶反应将LMO1 PCR产物克隆至pDONR221 Gateway供体载体中6,13（PCR片段 + 供体载体 = 入门克隆）。
    1. 在10 µL反应体系中，混合1 µL纯化的LMO1 PCR产物（150 ng/µL）、1 µL（150 ng/µL）pDONR221供体载体、6 µL TE缓冲液（pH 8.0）和2 µL BP酶混合物，25 °C孵育1小时，然后按照制造商说明书转化至TOP10感受态E. coli中。
    2. 随后，将转化产物中的50–200 µL涂布于含50 µg/mL卡那霉素的Luria肉汤（LB）琼脂平板上，37 °C过夜培养。
    3. 挑取单克隆菌落接种至含50 µg/mL卡那霉素的2–5 mL LB培养基中，37 °C过夜培养（16–18小时）。
    4. 取2 mL过夜培养的细菌用于质粒提取，操作按制造商说明书进行。为验证LMO1质粒，送样测序，使用M13-F引物（5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'）。
  3. 为构建dβh-pDONRP4-P1R入门克隆，以CH211-270H11 BAC克隆为模板，扩增5.2 kb启动子区域获得dβh PCR产物6,13，配制20 µL反应体系，方法同步骤1.1.1。PCR程序参数如下：94 °C预变性2分钟；10个循环（94 °C 15秒，50 °C 30秒，68 °C 8分钟）；30个循环（94 °C 15秒，53 °C 30秒，68 °C 8分钟）；最后68 °C延伸4分钟（正向引物：5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3'，反向引物：5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3'）。
    注意：由于本步骤涉及较长的DNA模板，应确保使用适合长片段扩增的PCR系统以保证扩增准确性。
  4. 通过BP重组酶反应将dβh PCR产物克隆至pDONRP4-P1R Gateway供体载体中6,13（PCR片段 + 供体载体 = 入门克隆）。
    1. 在总体积为10 µL的反应体系中，混合1 µL纯化的dβh PCR产物（172 ng/µL）、1 µL（150 ng/µL）pDONRP4-P1R供体载体、6 µL TE缓冲液（pH 8.0）和2 µL BP酶混合物，25 °C孵育1小时。
    2. 按照制造商说明书将反应产物转化至TOP10感受态E. coli中。质粒提取方法见步骤1.2.2–1.2.4，使用M13-F（5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'）和M13-R（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'）引物进行测序验证。
  5. 构建dβh:LMO1表达载体。
    1. 将各1 µL的入门克隆（dβh-pDONRP4-P1R、LMO1-pDONR221和p3E-polyA11）（每种20 fmol）、1 µL（60 ng/µL）含I-SceI识别位点的修饰型目的载体，以及含2 µL LR重组酶混合物的4 µL TE缓冲液（pH 8.0）混合。25 °C孵育1小时。
    2. 按照制造商说明书将该混合物转化至化学感受态TOP10 E. coli中。质粒提取方法见步骤1.2.2–1.2.4，使用DBH正向引物（5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3'）和LMO1引物（5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3'）进行测序验证。
  6. 利用Gateway系统构建dβh:mCherry DNA载体，将5.2 kb dβh启动子、pME-mCherry和p3E-polyA三种入门克隆与前述步骤1.5.1中所述含I-SceI识别位点的修饰型目的载体进行重组6。质粒提取方法见步骤1.2.2–1.2.4，使用DBH正向引物（5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3'）进行测序验证。
  7. 将dβh:LMO1 DNA载体和dβh:mCherry DNA载体以3:1的比例在总体积15 µL的反应体系中用I-SceI酶线性化，加入1 µL I-SceI酶（5 U/µL）和0.75 µL缓冲液（10x），室温孵育至少4小时或过夜。确保反应体系中DNA浓度不超过750 ng。
  8. 次日完成载体线性化后，向上述步骤1.7所得5 µL总DNA混合物中加入0.5 µL新鲜I-SceI酶（5 U/µL）和0.5 µL 0.5%酚红。使用直径1.0 mm的玻璃微量注射针，将总体积为50–80 pg线性化DNA的溶液显微注射至野生型AB品系的一细胞期胚胎中（最多可注射500枚胚胎），注射方法参照先前文献17。剩余DNA混合物储存于-20 °C，以备后续注射使用。

2. 筛选并验证 LMO1 转基因鱼系中 LMO1 和 mCherry 的生殖系传递

  1. 在受精后3-4天（dpf），用0.02%三卡因麻醉已注射的胚胎，并筛选整个鱼体中表达荧光mCherry的个体，该表达由嵌合性转基因导致。将mCherry阳性胚胎转移至含新鲜卵水的培养皿中，并根据《斑马鱼手册》21中的方法饲养至性成熟。
    注意：阳性鱼的比例可能因研究人员的技术水平和经验而异。例如，初学者的整合率可能仅为10%，而经验丰富的操作者可达≥50%。
  2. 为确定哪些始代鱼（founder fish）已将dβh:LMO1和dβh:mCherry转基因整合入生殖细胞，将上一步（2.1）中获得的单个mCherry阳性F0代性成熟鱼与野生型AB鱼（WT AB）进行单对杂交。在3-4 dpf时筛选F1代中mCherry阳性的胚胎。
  3. 为确认mCherry阳性鱼携带LMO1转基因，使用基因组DNA提取缓冲液从单个F1代mCherry阳性胚胎中提取基因组DNA（gDNA），缓冲液组成为：12.5 µL 4x裂解缓冲液（含500 µL 1 M Tris（pH 8.4）、2.5 mL 1 M氯化钾和47 mL纯水）、35 µL纯水以及2.5 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K。将样品在55 °C孵育16小时，随后在98 °C孵育10分钟。
  4. 以提取的gDNA（2 µL）为模板，使用以下引物进行基因分型PCR： LMO1 正向引物（FW）：5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3'，LMO1 反向引物（RV）：5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3'，PCR程序如下：94 °C预变性10分钟（1个循环）；随后进行35个循环（94 °C变性30秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸30秒）；最后68 °C延伸7分钟。通过测序确认扩增出的182 bp片段。
  5. 在基因型确认后，根据《斑马鱼手册》21的标准指南将剩余的mCherry阳性F1胚胎饲养至性成熟。在2-3月龄时进行鳍剪并按照上述方案中的步骤2.3–2.4进行基因分型，以进一步确认LMO1转基因在鱼体中的稳定整合。
    注意：LMO1阳性的F1鱼即为稳定的转基因系 [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)]（记为LMO1品系）。
  6. 将F1代LMO1稳定转基因鱼与野生型鱼交配，并根据需要重复繁殖以维持该品系。

3. 将 LMO1 和 MYCN 转基因品系杂交以构建转移模型

  1. 一旦生成LMO1转基因斑马鱼品系，便将其与MYCN品系6,17进行杂交，以培育出同时过表达MYCN和LMO1的杂合转基因鱼系。
  2. 在受精后1天（1 dpf）时，使用体视荧光显微镜根据EGFP表达情况对远交后代进行分选，EGFP阳性信号表现为后脑区域的EGFP阳性点状结构。
    注意：可选方案是，若并非所有胚胎均在1 dpf时针对MYCN进行分选，则将胚胎培育至成年，通过鳍条剪取样本，并按照前述步骤2.3-2.4所述方法提取基因组DNA并进行PCR基因分型，所用引物为：MYCN-F（5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'）；MYCN-R（5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3'），PCR程序如下（使用标准Taq聚合酶）：94 °C预变性3分钟1个循环，随后进行35个循环（94 °C变性30秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸3分钟），最后68 °C延伸7分钟，预期扩增产物大小为145 bp。
  3. 在1 dpf完成EGFP分选后，将筛选出的胚胎分别转移至不同的培养皿中，并标记为：MYCN+（EGFP阳性）或MYCN-（EGFP阴性）。
  4. 在3–4 dpf时，使用体视荧光显微镜观察并分选第3.3步中两组胚胎的LMO1表达情况。观察头区尤其是后脑延髓部位的颈上神经节及非PSNS多巴胺能神经元细胞中是否存在红色荧光蛋白表达信号6,13。
    注意： 应在胚胎达到5 dpf之前完成mCherry/LMO1 的筛选，因为此时气囊已完全充气，会导致胚胎上浮，从而在分选过程中难以对PSNS细胞进行显微聚焦观察。
  5. 完成分选后，将分选出的鱼按不同基因型分为四组，并按以下方式标记。根据《斑马鱼手册》中的标准操作流程21，在相同条件下饲养各组鱼。
    1. 仅含MYCN（EGFP阳性），
    2. 仅含LMO1（mCherry阳性），
    3. MYCN; LMO1（EGFP和mCherry双阳性），
    4. 野生型（WT，EGFP和mCherry双阴性）。

4. 在转基因斑马鱼品系中可视化肿瘤负荷

  1. 在受精后4周（wpf），使用含0.02%三卡因的培养皿对步骤3.5中分选的鱼进行麻醉。
  2. 用体视荧光显微镜观察肿瘤，轻轻用金属刮铲将鱼翻转至两侧，以观察肿瘤。预期肿瘤表现为来自间肾腺区域（靠近头部和肾脏）的单EGFP阳性、单mCherry阳性或双EGFP与mCherry阳性肿块。
    注意：初始肿瘤通常在一侧间肾腺出现更亮且更大的荧光阳性肿块，因此必须观察鱼的两侧，以避免遗漏早期肿瘤的发生。
  3. 在鉴定出可能携带肿瘤的鱼后，将其分离至单独的养殖缸中，并做好适当标记，包括出生日期、肿瘤筛查日期和基因型。
  4. 在6 wpf时，重复步骤4.1–4.3，再次筛选携带肿瘤和不携带肿瘤的鱼，以确认先前鉴定的肿瘤阳性鱼中肿瘤的存在，或识别新出现的可能携带肿瘤的鱼。对于已确认携带肿瘤的鱼，应观察其荧光阳性肿块是否持续存在或体积增大。
  5. 在鉴定出携带肿瘤的鱼后，每两周监测一次肿瘤细胞迁移的迹象，迁移表现为远离肿瘤原发部位（间肾腺区域）的微小EGFP和/或mCherry阳性肿瘤肿块。根据需要将这些鱼隔离至单独的养殖缸中，并做好适当标记以提示可能的转移。
  6. 为进一步确认转移，需定期（每两周一次）持续追踪这些鱼，直至远处的荧光阳性肿瘤肿块明显增大，表明转移部位的肿瘤已生长。

5. 荷瘤鱼类组织的处理与石蜡切片

注意：执行此步骤以表征在 MYCN 和 MYCN;LMO1 转基因鱼中自发形成的原发性和/或转移性肿瘤。

  1. 在鉴定并确认荷瘤鱼后，将步骤 4.6 中的鱼置于培养皿中，先将其浸入 0.02% 三卡因（tricaine）中进行麻醉，随后增加三卡因剂量直至鱼停止呼吸，然后将鱼体切成两部分：一部分包含头部及身体中段的一部分（含肿瘤），另一部分包含身体中段的其余部分及尾部。
  2. 将两部分鱼体用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS 溶液在室温下于摇床上固定 1 小时。为提高固定效率，更换为新鲜的 4% PFA 溶液，以更有效地快速渗透至内脏器官。将鱼样置于新鲜固定液中，在 4 °C 下于摇床上过夜或固定 48 小时。
    注意：PFA 具有毒性。由于预防措施及试剂的妥善处理需遵循所在机构的规定，请在使用和处置该试剂前查阅相关安全指南。
  3. 在处理前，将样品置于 100% 快速脱钙液中，在室温下孵育 15–20 分钟。务必使用非金属容器，并在孵育过程中定期检查样品，以防过度脱钙。若观察到组织严重降解，应将样品转移至水中或置于 4 °C 环境以减缓脱钙进程。
  4. 固定和脱钙完成后，用流动的自来水冲洗鱼样 1 小时，并将其放入组织处理盒（cassette）中。若存在多个样品，应将每个样品分别放入独立的处理盒中。
  5. 将装有鱼样的处理盒放入组织处理仪中，进行脱水并为石蜡包埋做准备。样品将依次浸入以下溶液：70% 乙醇（60 分钟，40 °C）、85% 乙醇（50 分钟，40 °C）、95% 乙醇（40 分钟，40 °C） 两次、100% 乙醇（30 分钟，40 °C）、另一份新鲜 100% 乙醇（50 分钟，40 °C）两次、二甲苯（30 分钟，40 °C）、另一份新鲜二甲苯（50 分钟，40 °C）、另一份新鲜二甲苯（50 分钟，45 °C）、石蜡（30 分钟，45 °C）、石蜡（20 分钟，58 °C）三次。
  6. 组织处理完成后，从处理仪中取出处理盒，注意保持各处理盒的顺序，并确保不会混淆鱼样。
  7. 根据鱼的大小选择合适尺寸的模具，确保模具能够容纳整个处理盒及鱼样。在模具底部覆盖一层 60 °C 的液态石蜡。
  8. 立即将装有鱼样的处理盒放置在模具上方的液态石蜡上（确保鱼体平放于侧面，以便获得矢状切面），然后继续填充石蜡至模具顶部，完全包埋鱼样。
  9. 将完成包埋的模具置于切片机的冷台上，直至石蜡完全硬化。
  10. 当石蜡块变硬（可通过观察其不透明度增加及触感坚硬来判断）后，轻轻将石蜡块从模具中取出。小心刮除处理盒侧面多余的石蜡。
  11. 在切片机上对石蜡包埋的鱼样进行矢状面切片，厚度为 4 微米，并将切片漂浮于 40 °C 含蒸馏水的温水浴中。
  12. 小心地将切片转移至带正电荷的载玻片上，并在染色前于 60 °C 烘箱中烘烤 30 分钟，随后进行步骤 6、7 或 8 的操作。

6. 用于病理学评估的石蜡切片苏木精和伊红（H&E）染色

  1. 将来自步骤 5.12 含石蜡切片的载玻片放入载玻片架中。在化学通风橱内，用二甲苯脱蜡 3 次，每次 5 分钟。每次使用后弃去溶液。
  2. 用 100% 乙醇对切片水化 3 分钟，并用新鲜的 100% 乙醇重复此步骤两次。随后用 95% 乙醇处理 3 分钟，再用 80% 乙醇处理 3 分钟。
  3. 用蒸馏水冲洗切片 5 分钟。在切片水洗过程中，务必通过过滤或使用无绒擦拭布轻轻擦拭苏木精表面，去除氧化颗粒。
  4. 用无绒的专业级擦拭布吸去载玻片架上多余的水分，然后将载玻片浸入 50% 苏木精溶液（与蒸馏水按 1:1 比例稀释）中染色 2–5 分钟，具体时间根据所需的染色强度和试剂降解情况而定。当苏木精溶液颜色由梅红色变为蓝色/棕色，或染色时间明显延长时，应弃去该溶液。用流动的自来水冲洗载玻片 20 分钟。
  5. 将载玻片在 1% 酸性乙醇（3.3 mL 盐酸与 50 mL 70% 乙醇混合）中快速浸入多次进行分化。浸入时间最长可达 3 秒，浸入时间越长，切片染色越浅。
  6. 用自来水冲洗载玻片两次，每次 1 分钟，再用去离子水冲洗一次。可选步骤：此阶段可将载玻片置于水中过夜浸泡。
  7. 将切片浸入 1.36% 碳酸锂溶液（47 g 碳酸锂溶于 3500 mL 水中）中 3 秒。注意避免孵育时间过长，因为在碳酸锂溶液中停留时间越长，组织越容易脱落漂浮。
  8. 用自来水冲洗切片 5 分钟，并用无绒的专业级擦拭布吸去载玻片架上多余的水分。
  9. 将载玻片在 100% 即用型伊红溶液中复染 15–30 秒，随后立即用 95% 乙醇脱水两次，每次 5 分钟。再更换为 100% 乙醇脱水两次，每次 5 分钟，每次使用后弃去溶液。
  10. 用二甲苯透明 15 分钟，共重复三次。可选步骤：载玻片可在室温下置于二甲苯中过夜，以更彻底地去除残留水分。
  11. 将载玻片在化学通风橱中自然晾干，然后使用封片介质加盖盖玻片以封固组织样本。
  12. 在显微镜下观察并成像染色后的组织切片。仔细检查原发部位（头肾中的间肾腺区域）的肿瘤以及鱼类其他组织和器官中的远端散在转移灶。将染色的组织切片送交病理学家进行评估。基于该鱼类模型与人类神经母细胞瘤相似的病理特征，预期仅表达 MYCN 或共表达 MYCN;LMO1 的鱼类中出现的肿瘤将被病理学家首次诊断为神经母细胞瘤。

7. 使用针对NB标志物及过表达转基因的抗体进行免疫组织化学分析（IHC），以进一步确认肿瘤的扩散情况及其交感肾上腺谱系特性

  1. 使用全自动染色系统进行染色
    1. 为了更好地将免疫组化（IHC）结果与苏木精-伊红（H&E）染色结果进行比较，从步骤5.12中选择相邻的切片进行IHC染色。
      ​注意：尽管自动染色系统可实现更快且更省力的结果，但在缺乏该系统时，可参考第7.2小节的步骤采用手动IHC染色方案。
    2. 根据所需浓度和全自动系统所需的总体积，使用该系统配套的初级抗体稀释液，将针对酪氨酸羟化酶（TH）（1:500）的初级抗体（一种神经母细胞瘤标志物）进行稀释。
      ​注意：最佳抗体浓度可能因抗体种类和组织类型而异。
    3. 由于自动染色系统使用机载热诱导抗原修复法，以表位修复液处理20分钟，并使用系统配套的检测试剂，因此需确保仪器参数设置如下：过氧化物酶阻断5分钟；初级抗体（按所需浓度）孵育15分钟；生物素化抗兔IgG二抗（1:500）孵育8分钟；链霉亲和素-HRP孵育8分钟；混合型DAB强底物孵育5分钟；苏木精复染5分钟。
    4. 设置完成后，将抗体托盘放入仪器中。通过创建新病例来设置切片，系统将自动标记切片。此时仪器已装载完毕，可开始运行（脱蜡、染色和复染）。
    5. 使用自动染色仪完成切片的脱蜡、染色和复染后，将切片依次浸入70%、95%和100%乙醇梯度溶液中，各5分钟。再将切片浸入新鲜100%乙醇中5分钟。
    6. 将切片在二甲苯中透明处理两次，每次5分钟，或过夜放置于二甲苯中以更彻底地去除残留水分。
    7. 将切片置于化学通风橱中自然晾干，然后使用封片介质加盖盖玻片。通过显微镜观察并成像染色后的组织切片。
    8. 为明确确认鱼类模型中的转移情况，需将第7步中使用神经母细胞瘤标志物抗体染色的切片与第6步中H&E染色的切片进行比较。
      注意：在H&E染色识别出的所有肿瘤细胞中，应观察到神经母细胞瘤标志物TH呈阳性染色。同时，在LMO1;MYCN鱼中发现转移性肿瘤的邻近组织中，应无TH阳性染色。为排除转移性肿瘤为多灶性原发肿瘤的可能性，务必选择与MYCN;LMO1鱼年龄相近的野生型（WT）对照鱼及仅表达MYCN的鱼作为对照进行分析。
  2. 无自动IHC染色系统时的手动染色
    1. 切片烘烤后，从步骤5.12中选择相邻切片，以便更好地比较H&E染色与IHC染色，并进行脱蜡处理。在化学通风橱内，分别使用先前步骤6.1和6.2的方法，用二甲苯对切片进行脱蜡和水化。
    2. 完成脱蜡和水化后，将切片在内源性过氧化物酶阻断液（含0.1%叠氮化钠和0.3%过氧化氢的1x PBS）中室温浸泡5分钟。用新鲜1x PBS洗涤切片3分钟，重复两次，共洗涤三次。
      警告：叠氮化钠具有急性毒性。操作时务必遵循所在机构规定的预防措施，并妥善处理试剂。
    3. 通过将切片在蛋白酶K溶液（1:500溶于1x PBS）中室温孵育10分钟进行抗原修复。随后用1x PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
    4. 将切片在含5%山羊血清的1x PBS中室温摇床上孵育30分钟以进行封闭。用新鲜1x PBS洗涤两次，每次3分钟。
    5. 直接在切片上滴加4滴亲和素（Avidin）阻断液，室温孵育15分钟。用新鲜1x PBS洗涤两次，每次3分钟；然后滴加4滴生物素（Biotin）阻断液，室温孵育15分钟。
    6. 封闭完成后，将切片与酪氨酸羟化酶（TH）初级抗体（1:500）在室温下孵育45–60分钟，或在4 °C下过夜孵育。
      注意：可额外使用针对转基因及其他相关标志物的抗体进行染色，以研究原发肿瘤及其他转移灶的生理状态和活性。最佳抗体浓度可能因抗体和组织类型而异。
    7. 用新鲜1x PBS洗涤切片3分钟，重复两次，共洗涤三次。
    8. 将切片与用封闭液稀释的生物素化抗兔IgG二抗（1:500）在室温下孵育45–60分钟。重复步骤7.2.7的洗涤操作。
    9. 加入HRP标记的亲和素（1:300溶于1x PBS），室温孵育20分钟。用新鲜1x PBS洗涤切片三次，每次5分钟。
    10. 配制3,3’-二氨基联苯胺（DAB）溶液（2.5 mL蒸馏水，1滴试剂盒缓冲液，1滴过氧化氢，2滴试剂盒中的DAB），将DAB滴加至切片上并置于显微镜旁。加入DAB后，在显微镜下观察切片上的显色反应。当达到理想染色强度时，将切片浸入冷蒸馏水中以终止反应。
    11. 用新鲜50%苏木精对切片进行复染，通过短暂浸入或蘸取数秒后放回蒸馏水中。可根据需要重复操作，但通常一次即可，因为组织切片较薄。
    12. 按照步骤7.1.5所述的酒精梯度对切片上的组织样本进行脱水，并继续完成后续步骤（最后一步为7.1.8），以完成IHC分析。

8. 采用苦味酸-天狼星红染色法对石蜡切片进行染色以研究肿瘤中胶原蛋白积累的机制

  1. 重复步骤 6.1–6.3，对载玻片上的石蜡切片进行脱蜡、水化和洗涤。
  2. 用专业级无绒擦拭布吸去染色架上多余的水分后，将切片置于 50% 苏木精染液中染色 10 分钟，随后用流动自来水冲洗 10 分钟。
  3. 将载玻片转移至苦味酸-天狼星红染液（Picrosirius Red）中，室温孵育 1 小时。
  4. 用酸化水（1 L 自来水或蒸馏水中加入 5 mL 冰醋酸）洗涤载玻片两次，每次在摇床上孵育 5 分钟。
  5. 首先倒掉大部分水分，然后通过物理振荡并用擦拭布轻压切片区域，尽可能去除残留水分。
  6. 迅速将载玻片浸入三次更换的 100% 乙醇中，以脱水石蜡切片。
  7. 重复步骤 6.10 和 6.11，用二甲苯透明载玻片并封片，随后使用配备相机的复合显微镜进行成像。
  8. 使用 ImageJ 软件，在每张切片中至少选取三个随机视野，计数天狼星红阳性的胶原纤维，并比较 MYCN 与 MYCN;LMO1 鱼类切片之间的差异。

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结果

为了确定是否 LMO1 协同作用于 MYCN 影响NB发病机制，驱动表达以下任一的转基因构建体 LMO1 (dβh:LMO1 和 dβh:mCherry）或 MYCN (dβh:EGFP-MYCN 在受控条件下的PSNS细胞中 dβh 启动子被注射到斑马鱼胚胎中13如图所示 图1A在获得稳定转基因品系并验证其基因型后，将杂合子 MYCN 和 LMO1 鱼类进行杂交。其后代按以下方式分选： MYCN （EGFP+）或 LMO1 分别在受精后1天或3-4天（mCherry+）表达。 MYCN 过表达已被证明可抑制 PSNS 的发育6因此， EGFP-MYCN 在1 dpf时，非PSNS多巴胺能神经元细...

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讨论

斑马鱼在过去的几十年中已被广泛用于研究，尤其是在癌症研究领域，这显然得益于其易于饲养、繁殖能力强以及在诸多方面具有的显著优势 体内 成像1,28斑马鱼模型由于其体外受精和体外发育的特性，易于进行胚胎操作，可与大鼠、小鼠等哺乳动物模型生物相辅相成，适用于大规模的遗传学研究1,2,3此外，斑马鱼基因组与人类基因组具有高度相似性。通过将斑马鱼基因组的详细注释与人类参考基因组进行比较，约70%的人类基因已被证实存在对应的斑马鱼直系同源基因。29此外，斑马鱼在研究中的其他应用已拓展至药物发现以及作为个体化癌症治疗的患者替身模型30,31越来越多的研究表明，在斑马鱼中...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01 CA240323（S.Z.）；美国国防部（DoD）资助项目 W81XWH-17-1-0498（S.Z.）；癌症研究V基金会V学者奖（S.Z.）；梅奥生物医学发现中心平台资助（S.Z.）；以及梅奥诊所癌症中心和个体化医学中心的支持（S.Z.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3’-二氨基联苯胺（DAB）Vector试剂盒VectorSK-4100
乙酸Fisher Scientific / Acros Organic64-19-7
琼脂糖GP2Midwest Scientific009012-36-6
抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体Pel-FreezP40101
亲和素/生物素封闭试剂盒VectorSP-2001
BOND Intense R 检测试剂Leica BiosystemsDS9263
BOND一抗稀释液Leica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
BOND-MAX IHC仪器Leica Biosystems Newcastle, Ltd.N/A全自动免疫组化染色系统
CH211-270H11 BAC克隆BACPAC资源中心（BRFC）N/A
配备DP71相机的复式显微镜OlympusAX70
Cytoseal XYL（基于二甲苯的封片介质）Richard-Allan Scientific8312-4
伊红Leica3801601即用型（无需配制）
乙醇Carolina86-1263
Expand长片段PCR系统Roche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II酶混合物Invitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II酶混合物Invitrogen, CA11791-100
山羊抗兔二抗（生物素标记）DakoE0432
改良哈里斯苏木精溶液Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP亲和素DVectorA-2004
盐酸Aqua Solutions4360-1L
过氧化氢，3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI酶New England Biolabs, MAR0694L
硫酸卡那霉素Teknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes纸巾Fisher Scientific34133
碳酸锂Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
用于切片的切片机Leica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10化学感受态 E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA 犹他大学Chi-Bin Chien博士N/A慷慨馈赠
（请访问网页 http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page 获取材料，该材料按说明免费分发。）
石蜡Surgipath Paraplast39603002石蜡到石蜡
多聚甲醛Alfa AesarA11313
pDEST载体（含I-SceI识别位点的改良目的载体）德国卡尔斯鲁厄理工学院C. Grabher博士N/A慷慨馈赠
pDONR 221 gateway供体载体Thermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R供体载体 犹他大学Chi-Bin Chien博士N/A慷慨馈赠
酚红，0.5%Sigma Aldrich P0290
磷酸盐缓冲液（PBS），10XBioRad1610780
苦味酸-天狼星红染色试剂盒Polysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
蛋白酶K，重组，PCR级Roche21712520
QIAprep Spin MiniPrep试剂盒Qiagen27104
RDO快速脱钙剂Apex EngineeringRDO04
叠氮化钠（NaN3）Sigma Aldrich26628-22-8
体视荧光显微镜LeicaMZ10F
配备数字成像相机DS-U1的立体荧光显微镜NikonSMZ-1500
Taq DNA聚合酶New England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI真空浸润处理仪SakuraN/A型号 #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
二甲苯Thermo Fisher ScientificX3P1GAL

参考文献

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