玉米叶蝉（Peregrinus maidis）胚胎的显微注射用于CRISPR/Cas9基因组编辑

摘要

本文提供了用于采集和显微注射玉米叶蝉的合子前胚胎的实验方案，旨在通过基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术对其基因组进行修饰，或通过种系转化插入带有标记的转座元件。

摘要

玉米叶蝉 Peregrinus maidis 是 玉米的一种害虫，也是多种玉米病毒的传播媒介。先前发表的方法描述了在 P. maidis 通过向若虫和成虫显微注射双链RNA（dsRNAs）实现。尽管RNAi技术具有强大功能，但通过该方法产生的表型是 transient 的，且不具有长期的孟德尔遗传特性。因此， P. maidis 工具箱需要扩展以包含功能基因组学工具，从而能够产生稳定的突变品系，为研究人员针对这一具有重要经济意义的害虫开发新的防控方法提供可能。然而，与用于RNA干扰的dsRNA不同，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑和种系转化所使用的组分难以穿过细胞膜。因此，必须在胚胎细胞化之前将质粒DNA、RNA和/或蛋白质显微注射到胚胎中，使得注射时机成为成功的关键因素。为此，已开发出一种基于琼脂糖的产卵方法，以便从 P. maidis 以相对较短的时间间隔采集雌性个体。本文提供了收集和显微注射合子期前胚胎的详细方案 P. maidis 将胚胎与CRISPR组分（已与引导RNA形成复合物的Cas9核酸酶）共同孵育，以及基于Cas9的基因敲除结果 P. maidis 眼色基因， 白色，现予以介绍。尽管这些方案描述了CRISPR/Cas9基因组编辑在 P. maidis，它们也可用于产生转基因生物 P. maidis 通过简单改变注射溶液的成分，即可实现种系转化。

引言

玉米叶蝉 Peregrinus maidis 是 玉米的一种重要经济害虫^1,2,3它们在利用刺吸式口器取食以及通过将胚胎直接产入植物组织进行繁殖时，都会对植物造成直接的物理损伤。^2,4尽管这些昆虫对作物有多种直接损害途径，但其对作物健康影响最大的方面是间接的，即作为玉米花叶病毒（MMV）和玉米条纹病毒的传播媒介^5,6MMV 能够在人体内复制 P. maidis 载体，使病毒能够在单个昆虫体内终身持续存在，从而能够持续将病毒传播给新的寄主植物^7,8最常见的控制方法 P. maidis，因此它传播的病毒也属于杀虫剂。

遗憾的是，这些产品的管理不当已导致靶标害虫产生抗性，并造成环境污染⁹。因此，亟需开发新的策略以减少此类昆虫/病毒复合害虫造成的作物损失。先前的研究表明，RNA干扰（RNAi）可作为防治P. maidis的有效手段，因为该害虫即使通过摄食双链RNA（dsRNA）也能发生基因表达的下调¹⁰。然而，在田间最有效的dsRNA施用方式是通过昆虫取食的植物进行传递；但由此可能导致作物仍易受昆虫所携带病毒的侵染。随着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现，新的害虫防控策略成为可能，包括基于Cas9的基因驱动技术^11,12，该技术可用于减少害虫种群规模，或以对所传播病毒具有抗性的个体替代原有种群。

然而，任何类型基因驱动系统的开发与应用都需要建立转基因技术。这类方法在进行RNAi实验时并非必需 P. maidis 因为双链RNA（dsRNA）和/或小干扰RNA（siRNA）被认为能够穿过细胞膜，这源于RNA干扰（RNAi）的高效性 P. maidis^10,13这一点对于传统转基因技术或基于Cas9的基因编辑所使用的DNA和/或蛋白质同样成立，而这些技术正是构建携带基因驱动昆虫的前期手段。为了实现基因编辑或其他形式的种系转化，这些DNA和蛋白质理想情况下需在昆虫胚胎细胞化之前，于合胞体胚盘阶段显微注射到胚胎中。时机至关重要，因为合胞体阶段是发育过程中最早的时期之一。^14,15。当 P. maidis 雌性偏好在植物组织中产卵，提取足量的卵前胚胎用于显微注射可能费力且耗时。因此，研究人员开发了新的技术以快速收集并进行显微注射 P. maidis 细胞化之前的胚胎。

方案

1. P. maidis 成虫的群体水平饲养

1. 每个饲养笼每周至少种植四盆玉米，每盆播种3-4粒。在无昆虫环境中培养。
2. 当植株生长至约5周龄时，将其放入30 cm × 30 cm × 60 cm的饲养笼中。
3. 从科研实验室或野外获取足够数量的P. maidis成虫（约500只），并将其放入防虫笼内，同时提供9-12株玉米植株（3-4盆）。
4. 将种群维持在昆虫饲养培养箱中，温度为25 °C（± 1 °C），相对湿度至少70%，光照周期为14小时光照:10小时黑暗。
5. 为建立年龄校准的种群，在产卵四天后移除所有初始成虫，使在笼内产下的胚胎自然孵化并正常发育。
6. 使用吸虫器收集5周龄的P. maidis成虫（图1），转移至新鲜玉米植株上进行每周继代培养。随后将成虫释放到装有新鲜玉米植株的洁净饲养笼中。为持续获得用于实验的年轻成虫，需每周准备新的年龄校准饲养笼。
7. 每天对饲养笼内的花盆浇水两次。定期修剪茎秆，清除腐烂的植物残体，并根据需要更换新的玉米植株。
   ​注意：若维护得当，一个种群可维持约5周（即，足够使在笼内产卵的胚胎发育为成虫）。

2. 基于琼脂糖的产卵室

1. 通过将1% w/v的琼脂糖水溶液倒入洁净的100 mm × 15 mm培养皿中制备卵收集皿（产卵基质）。待其凝固后，将产卵基质于4 °C保存。
2. 配制10% w/v的蔗糖溶液用于成虫饲喂。蔗糖溶液可于-20 °C保存一个月。
3. 通过在1盎司杯底部（见材料表）打孔，并在孔上粘贴筛网以实现气体交换，制成容纳成虫的容器（图2）。
4. 将塑料石蜡膜裁剪成5 cm × 5 cm的正方形；每个杯预留两片。
5. 从经过年龄校准的P. maidis种群中收集约15只1周龄的成年雌虫。选择雌虫时，观察腹部腹面，寻找通常比腹部其余部分颜色更深的产卵器（图3）。若需设置多个产卵容器，可将成虫暂时存放于15 mL锥形管中，最多存放一小时。在性别鉴定前，先将昆虫短暂置于冰上冷却，再转移至成虫容器中。
   注：此操作无需显微镜。已充分取食和交配的成年雌虫通常腹部比雄虫更大，且更为温顺，因此可更方便地从群体中挑选。
6. 将雌虫转移至成虫容器中，并用一层塑料石蜡膜均匀拉伸至原尺寸的3–4倍后密封杯口（图4A,B）。
7. 在塑料石蜡膜密封层顶部加入400 µL的10% w/v蔗糖溶液，再覆盖第二层塑料石蜡膜，拉伸方式与第一层完全相同（图4C,D）。
   ​注：双层拉伸的塑料石蜡膜形成的夹层可对蔗糖溶液施加压力，这对成虫取食至关重要，但不会阻碍雌虫将产卵器完全刺入产卵基质中。
8. 将成虫容器倒置于卵收集皿上，使塑料石蜡膜一侧直接接触产卵基质，并用保鲜膜包裹整个产卵装置，注意不要覆盖通气孔，以确保气体交换（图5）。
9. 将每个产卵装置置于25 °C、70%湿度、14:10光暗周期条件下培养。
10. 每天更换一次塑料石蜡膜夹层及10% w/v蔗糖溶液，并清除杯内积聚的水分。

3. 在高湿度环境中收集和排列胚胎

1. 在加湿空间或加湿罩（加湿罩；图6）中建立基于体视显微镜的显微注射系统，以确保在整个显微注射过程中工作环境的湿度至少达到70%。
2. 在所需的产卵时间段后，检查产卵培养基中的卵。此操作应在加湿罩或其他高湿度环境中进行。
   注意：通常使用的产卵时间段为过夜，即从下午6点至上午10点，持续约16小时。
3. 若发现卵产在琼脂糖内，使用精细镊子小心将其挖出，并放置于琼脂糖表面以保持湿润（图7A）。
4. 在22 mm × 30 mm的盖玻片上贴一条1 mm × 15 mm的双面胶带（图7B）。将盖玻片有胶带的一面朝上放置于产卵培养基上（图7C）。
5. 用细毛刷逐个拾取琼脂表面的卵，并转移至双面胶带上。剔除完全呈白色或表面有黑色斑点的卵。健康的卵应呈半透明状。
6. 将香蕉形的卵侧放，使较粗的一端粘附在双面胶带上（图7D）。
   ​注意：始终将卵保持在高湿度环境中，例如在底部铺有一层1%琼脂的培养皿中。

4. CRISPR 试剂和注射针的制备

1. 使用 Flaming/Brown 型微电极拉制仪拉制石英针。
2. 使用微电极斜面仪对石英针进行斜面处理。
3. 使用双面胶带将拉制好的针固定在透明容器（如培养皿）中，待用。
4. 通过将 0.5 µL Cas9 蛋白（5 µg/µL 储存液）与 0.5 µL sgRNA（4 µg/µL 储存液；参见材料表）及 1 µL 酚红缓冲液混合，得到终体积为 5 µL 的注射溶液。为沉淀可能堵塞针头的颗粒，短暂涡旋溶液，并以最大速度离心 3 分钟。
5. 从针尾部填充注射针，注意使注射混合物靠近针尖的锥形末端。如有气泡，需从针尖处去除。
6. 小心将填充好的针插入针夹持器中，并拧紧不锈钢卡箍，以确保在显微注射过程中针固定牢固。
7. 通过使用湿润的细毛笔轻轻刷拭斜面针尖，同时利用注射系统向针内输送短暂的气压脉冲，从而在针尖产生稳定的注射液流。
   ​注意：当注射混合物能够以少量从针尖流出时，表明针已准备好用于注射。

5. 显微注射及注射后护理

1. 通过将洁净的100 mm × 15 mm培养皿填充1%琼脂，制备显微注射平台，形成与培养皿顶部齐平的均匀琼脂层。
2. 将预先准备好的、带有约25个胚胎的盖玻片放置在琼脂平台上（图8A).
   注意：所有注射步骤必须在加湿的培养罩内（约70%湿度）进行。
3. 通过将针尖置于水滴中并启动注射循环，检查注射压力。
   注意：如果压力设置正确，应有少量注射液分散到水中图8B).
4. 将针头插入胚胎较大的一端，从盖玻片的左侧进针（图8C将注射液注入卵内，然后迅速拔出针头。
5. 所有卵注射完毕后，将盖玻片置于新的1%琼脂培养皿表面，并将培养皿转移至湿度 chamber（图9).

6. 胚胎的孵育与孵化

1. 将孵化室置于25 °C培养箱中培养6天。
2. 使用洁净水和细毛刷将存活的胚胎转移至底部铺有湿润滤纸的35 mm × 10 mm培养皿中。用塑料封口膜密封培养皿，并在25 °C条件下继续培养，使胚胎孵化。自注射后第6天起开始观察胚胎存活情况。
   注意：一龄若虫大约在第8天开始孵化。
3. 使用细毛刷将若虫转移至含有植物叶片切段的培养皿中。盖上皿盖，并用塑料封口膜密封。
4. 将密封的培养皿连同孵化出的若虫一起在25 °C条件下于叶片切段上继续培养48小时。
5. 使用细毛刷将一批注射后孵化的2日龄若虫转移至含有玉米植株的饲养笼中。若具有明显表型的注射个体数量足够，应将其单独饲养以最大化目标性状在下一代中的保留；否则，对所有注射个体进行群体交配。
   注意：将孵化出的若虫轻轻放置于玉米植株的心叶部位，以提供庇护并确保其微环境具有适宜的湿度。
6. 按照上述条件饲养昆虫，确保适宜的温度、湿度，并定期更换至新鲜的玉米植株。
7. 对后代进行目标表型筛选。将表现出期望表型的个体单独放入饲养笼中，以建立纯合品系。

结果

P. maidis 雌虫在产卵时需要摄食，产卵室经过专门设计，使其能够在一种保护性介质中产卵，同时便于回收卵。利用该方法，可回收到足量的合子期前胚胎，用于DNA、RNA和/或蛋白质的显微注射。成年P. maidis雌虫通常将卵产在玉米植株的叶片组织内，这使得在短时间内获得足够数量的卵具有挑战性，因为需要进行大量的叶片解剖。人工产卵环境为克服这些问题提供了有效解决方案。如表1所示，在4周内共从645只雌虫收集到6,483枚卵。雌虫通常在第2天开始产卵，第4至第6天为产卵高峰期，到第9天时产卵活动逐渐减缓。每个产卵室于周五设置，从周日开始至下一周的周日每天检查是否有卵。按照此时间安排，可在工作周期间收集到大部分卵用于显微注射。

该产卵系统首次实际应用是利用Cas9介导的基因敲除来测试其有效性， P. maidis 眼色基因的直系同源基因， 白色 （Pmw）作为靶标。Pmw中的突变 白色 已知在其他昆虫物种中会导致显著的眼部色素丧失，且White基因具有细胞自主性，因此可在注射个体中直接检测到突变表型。^16,17为了提高即使是很小的突变也可能导致功能丧失的概率，设计的向导RNA靶向切割ATP结合盒区域，该区域对于White蛋白功能至关重要¹⁶. P. maidis 胚胎分别注射了以下物质：20% 酚红（注射缓冲液）、含800 ng/µL Cas9的注射缓冲液（Cas9对照组），或在注射缓冲液中加入终浓度为800 ng/µL的Cas9以及三种向导RNA，每种向导RNA的浓度均为400 ng/µL。将三种向导RNA组合于同一注射混合物中，旨在通过产生大片段缺失以及弥补单个向导RNA可能无法有效切割的风险，进一步提高获得突变体的概率。各处理组的发育率相似（表 2），50-60%的注射个体表现出发育迹象。缓冲液对照组和Cas9对照组的孵化率也相近；然而，接受三向导RNA混合物的个体孵化率相对较低。目前尚不清楚存活率降低是否是由于基因缺失所致 白色 功能或三向导RNA混合物非预期后果的结果，例如脱靶效应（见讨论部分）。然而，所有完全丧失眼色素的个体中均未发现即，完全敲除）孵化，且注射个体的后代均未出现白眼表型。Cas9介导的基因突变的靶向效率通过两种方式验证：首先，对注射个体进行眼色素缺失表型的筛选。

在71个注射了向导RNA后发育的个体中，有23个表现出不同程度的色素缺失（图10），其中9个个体成功孵化，敲除率≥32%。在两种对照处理中均未观察到眼色素的缺失。其次，通过聚合酶链式反应（PCR）¹⁸和测序¹⁹确认了染色体突变。由于未能获得稳定的突变品系，因此从注射了三种向导RNA混合物或缓冲液的胚胎池中提取基因组DNA进行分析。预期三种向导RNA混合物可从white基因座中删除约180个碱基对。这一结果可通过从注射个体中分离的基因组DNA扩增出的PCR产物及其相应的测序数据观察到（图11）。这些综合证据表明，胚胎在细胞化发生之前即已被注射。

图1：吸液装置。 可通过将真空泵经塑料管连接至一个15 mL塑料锥形管的入口处，组装成一个有效的吸液装置。应小心地从锥形管底部移除约0.5 cm的部分。在锥形管内、塑料管开口上方放置一团棉花，用于捕获收集到的 P. maidis 成虫，防止其进入真空泵。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：成虫饲养容器的制作。（A）所需材料（从左上角顺时针方向）：网筛、热熔胶枪、剃刀片、1 盎司容器。（B）应在 1 盎司容器底部切出一个大孔，并裁剪一块刚好能覆盖该孔的方形网筛。（C）然后使用热熔胶将网筛粘合在孔上。（D）待胶水固化后，应去除多余的网筛材料。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：鉴定 P. maidis 成虫的性别。图中显示了雄性（左）和雌性（右）P. maidis 成虫的腹面。雌虫腹部可见的产卵器是判断个体性别的最明显特征。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：将成虫密封于容器中。（A）一块 5 cm × 5 cm 的塑料石蜡膜。（B）应将该膜均匀拉伸至原始尺寸的 3–4 倍。（C）将成虫放入成虫容器后，应将拉伸后的膜覆盖在容器开口上以固定成虫。然后在膜上放置一滴 400 µL 的 10% w/v 蔗糖溶液。（D）为成虫提供足够的摄食压力，应将另一块 5 cm × 5 cm 的塑料石蜡膜同样拉伸，并覆盖在蔗糖液滴之上。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：建立产卵室。（A）所需材料（从左上角顺时针方向）：塑料封口膜、已准备好的成虫饲养容器（含成虫）以及含有1%琼脂糖的培养皿（产卵基质）。（B）应将成虫饲养容器放置在琼脂糖上，并将石蜡膜/10%蔗糖“三明治”结构直接置于产卵基质上。（C）使用塑料封口膜将成虫饲养容器固定在产卵基质上，以防止基质过快干燥。（D）操作时应注意避免覆盖成虫容器的通气网，以确保空气交换仍可正常进行。（E）产卵室的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：加湿罩。 在注射显微镜周围设置了一个配备加湿器的罩子，以减少空气流动，并在操作胚胎时维持环境湿度。操作人员进入后可将罩子的挡板折叠封闭入口，以帮助维持适当的湿度水平。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：收集胚胎以准备显微注射。（A）已沉积在产卵培养基中的胚胎。使用一对精细镊子将胚胎从培养基中取出，并放置在其表面。（B）一条尺寸为1 mm × 15 mm的双面胶带，贴于22 mm × 30 mm的盖玻片上。（C）可将盖玻片置于产卵培养基上，以便将胚胎从培养基表面转移至盖玻片上的胶带上。（D）P. maidis 胚胎呈香蕉形，一端较窄，另一端较宽（示例胚胎中，窄端以红色箭头指示，宽端以黄色箭头指示）。胚胎的宽端应贴附在胶带上。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：注射。（A）注射平台是一个装满1%琼脂的培养皿。用于固定胚胎的带有胶带条的盖玻片应直接放置在注射平台表面。（B）在对胚胎进行注射前，应通过将少量注射液注入水滴中来测试注射压力。此方法也可在注射过程中的任何时间用于检查针头是否堵塞。（C）应将注射针插入胚胎较大的一端进行注射。若注射成功，应可观察到注射液进入胚胎。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9：显微注射后的护理。（A）当盖玻片上的所有胚胎完成显微注射后，应将该盖玻片放入一个新的含有1%琼脂糖的培养皿中。（B）随后可将带有盖玻片的培养皿置于湿度培养室（如图所示）中，直至胚胎孵化。请点击此处查看该图的放大版本。

图 10：Pmw 基因敲除表型。（A）同龄对照组和（B）Pmw 基因敲除胚胎，黑色箭头指示正在发育的眼睛。图 B 中的胚胎呈嵌合状态，可见一条小的色素条带。（C）同龄对照组和（D）Pmw 基因敲除孵化幼体，插图为眼睛的不同观察角度。图 D 中的孵化幼体也呈嵌合状态。白色箭头指向主图中色素缺失的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

图 11：Pmw 基因敲除序列。（A）Pmw mRNA 的等比例模型，以 500 bp 为间隔标记，并标示 gRNA 结合位点的位置：G1，蓝色；G2，黄色；G3，粉色。在此处产生的任何移码突变都将破坏翻译产物的大部分序列。（B）gRNA 位点的基因组上下文，均位于同一外显子内（加粗大写文本）。向导结合位点以与 A 相同的颜色高亮显示，PAM 序列加下划线。跨度约为 300 bp。上方显示了该外显子的同框翻译序列，以大写字母的单字母缩写表示。两个特异于眼色素转运蛋白的基序已标出。Walker B 功能域的 CDEPT 基序以紫色框标出，H-loop 结构域的 IHQP 基序以绿色框标出。这两个结构域对 ATP 转运蛋白功能至关重要。（C）通过两轮 PCR 扩增 Pmw 靶区域。第二轮 PCR 产物经凝胶电泳检测，以观察由于两向导序列间区域成功删除而导致的条带大小变化。泳道：L = 100 bp DNA 标准；1 = PCR 水阴性对照；2 = 注射缓冲液的卵；3–4 = 两组分别注射三向导混合物的卵。只有接受三向导混合物的胚胎同时产生野生型条带（红色箭头）和完全切除后的条带（白色箭头）。（D）为确认下方条带（白色箭头）的身份，对该 DNA 进行纯化、克隆并测序。第一行为野生型序列，其余两行为两个克隆的测序结果。另有三个克隆与最下方序列一致。蓝色高亮显示向导 1 的结合位点，粉色高亮显示向导 3 的结合位点。在两个等位基因中，这两个向导位点之间的整个区域均已被删除。缩写：Pmw = Peregrinus maidis white 基因；gRNA = 向导 RNA；PAM = 原间隔序列邻近基序；ATP = 三磷酸腺苷；PCR = 聚合酶链式反应；WT = 野生型；KO = 敲除。请点击此处查看该图的放大版本。

组别	杯数	每杯雌虫数量	产卵数								总产卵数
			第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天	第9天
1	10	15	0	26	166	355	530	193	91	37	1398
2	15	15	22	238	489	699	520	379	203	58	2608
3	8	15	0	57	230	190	116	80	34	1	708
4	10	15	0	226	446	519	301	179	24	15	1710
总计	43	15	23	547	1331	1763	1467	831	352	111	6483

表1：人工产卵环境中的代表性卵收集结果。 显示了四组卵收集杯的数据，卵的数量统计从设置后的第二天开始，持续到第九天。

注射处理	总注射数	总发育数	总孵化数	发育率 (%)	孵化率 (%)
缓冲液	39	20	12	51	31
Cas9	39	24	14	61	36
Cas9 +Pmw gRNA	121	71	28	59	28

表2：三种不同注射混合物的注射后存活率和基因敲除率。

讨论

产卵质量与营养
最近，研究与Nilaparvata lugens近缘物种的科研人员直接从叶片上获取用于显微注射的卵，并将注射后的卵保留在叶组织中直至孵化¹⁷。尽管这种基于叶片的方法为胚胎发育提供了更自然的环境，但也增加了感染风险以及在取卵过程中对卵造成损伤的可能性。本文所介绍的人工产卵系统则提供了更均一的环境，并降低了因操作导致卵损伤的概率。通过在周五设置产卵杯，大多数产出的卵可在正常工作周内收集完毕，有利于开展显微注射工作的研究人员。然而，该方法的一个局限在于，10%蔗糖溶液饮食中缺乏营养，最终会影响昆虫的健康状况，通常雌虫在产卵杯中仅存活约10天即开始大量死亡。卵的质量在6天后也开始下降，表现为死卵或外观不健康的卵数量增加。因此，选择用于显微注射的卵时必须谨慎，并且雌虫不应保留超过6天。

存活率与湿度
有两个因素对于胚胎在显微注射过程中的存活至关重要。P. maidis 胚胎操作中最困难的部分是在将其从产卵基质中取出后以及整个显微注射过程中防止其脱水。由于卵通常产在植物组织内部，缺乏足够的卵壳来防止水分流失。即使在加湿的通风橱中，整批卵也可能因脱水而死亡。然而，过高的湿度同样会影响显微注射，例如水分在双面胶带或显微镜镜片上积聚时。不幸的是，在显微注射过程中通常很难察觉卵是否脱水，它们往往在操作时外观正常，直到2至3天后才变得完全透明，且不再表现出任何发育迹象。

针头质量似乎也在存活率中起着重要作用。针头应具有斜面，以尽量减少对卵的不必要损伤。当针头堵塞时，通常可通过启动注射器的清洗功能，同时用湿润的画笔轻轻擦拭针头尖端（见步骤4.7），使针头恢复至可用状态。尽管如此，建议每次仅向每根针头中加入极少量的注射液（约0.25 µL），并每隔几张载玻片（约50–60枚卵）更换一次新针头，以确保整个注射过程中针头质量始终得到保障。

成功获得基因敲除表型
为了成功转化生殖细胞，通常需要在细胞化之前尽早进行胚胎显微注射。根据昆虫物种的不同，完成显微注射的时间窗口可能仅有数小时，也可能长达一整天^14,15,20。目前尚不清楚P. maidis胚胎的细胞化发生时间。 在产卵后4小时（pel）至16小时（pel）的不同发育阶段胚胎中均测试了Cas9介导的基因敲除，并在所有实验中均观察到了预期的表型，表明所有显微注射均在细胞化前窗口期内完成。

选择甘蔗红蜡蝉（P. maidis）中眼色基因 white 的同源基因，是因为其基因敲除表型具有细胞自主性，预期可在显微注射个体中易于筛选。事实上，正如预期，接受含 Cas9 和向导 RNA 混合物注射的胚胎中，嵌合型和完全型基因敲除个体均能被明确识别。然而，所有完全敲除的注射个体均未能孵化，对存活注射个体进行大规模交配也未能获得白眼后代。尽管如此，研究人员已通过靶向另一个基因成功建立了突变品系（Klobasa 等，正在进行中）。这表明，未能建立 white 突变品系的原因，极有可能是由于脱靶效应（即，Cas9 在基因组其他位置切割了重要区域）导致产生紧密连锁的致死突变，或由于 white 基因在 P. maidis 中具有未预期的关键生物学功能。

表型和分子数据（图8 和 图9）证实，在注射的胚胎样本中，white 基因座发生了显著的基因敲除，导致该基因功能完全丧失。此外，尽管在某些物种中 white 基因的突变是可存活的，但已有研究表明 white 基因活性降低可能具有不利影响^21,22。尽管如此，脱靶效应仍不能完全排除。预测可能的脱靶位点需要准确的基因组序列数据²³，而目前 P. maidis 的基因组资源尚不完善，暂时无法实现这一分析。然而，借助这些新方法，可以更有信心地对其他靶基因进行测试，甚至可推进更传统的转基因技术，以期为这种危害严重的害虫开发新的遗传工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 盎司容器	Dart	P100N	用于产卵装置的成虫容器
15 mL 圆底离心管	Olympus	Genesee 28-103	用作真空抽吸装置中的收集管
15 mL 圆底离心管	Olympus	Genesee 28-106	用于配制10%蔗糖溶液，以及在筛选前冷藏时盛放成虫
手动抽吸器	Bioquip	1135A	用于操作飞虱
真空抽吸器	Fischer Technical	LAV-3	用于抽吸大量昆虫
蓝光光谱LED灯	Home Depot	GLP24FS/19W/LED	为飞虱取食的盆栽玉米植株提供生长光照
Cas9	TrueCut Cas9 Protein v2	A36498	用于切割飞虱基因的内切酶
透明乙烯基软管	Home Depot	3/8 英寸内径 × 1/2 英寸外径 × 10 英尺	连接真空抽吸装置中收集管与泵
玉米飞虱	北卡罗来纳州立大学	N/A	请向Anna Whitfield博士实验室申请获取
脱脂棉球	Genesee	51-101	在真空抽吸装置的收集管中用作过滤器/昆虫捕获装置
双面胶带	Scotch双面胶带	NA	用于固定显微注射用的卵
Early Sunglow 玉米	Park Seed Company	05093-PK-N	用于饲养飞虱的玉米品种
epTIPS 微量加样尖	Eppendorf	C2554691	用于后填充进样针的加样尖
Femtojet 显微注射系统	Eppendorf	5247	控制注射压力（根据针头孔径大小设定为12–20 psi）
Nutri-Fly 果蝇琼脂培养基	Genesee	66-103	除产卵皿外所有用途的基质
精细镊子	Bioquip	4731	用于卵的操作
通用型LE琼脂糖	Apex	20-102	产卵皿中的基质（产卵介质）
向导RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）	靶向飞虱 white 基因的RNA向导
向导RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）	靶向飞虱 white 基因的RNA向导
向导RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒（1.5 nmol）	靶向飞虱 white 基因的RNA向导
加湿器	Homedics	UHE-CM45	为加湿罩提供湿度环境
湿度培养箱	Billups-Rothenberg	MIC-101	用于孵化前存放已注射的胚胎
昆虫饲养笼	Bioquip（定制）	容量接近1450 L（前部为塑料材质，侧面为网状织物）	用于玉米植株上飞虱的饲养
激光拉针仪	Sutter Instruments	P-2000/G	用于制备显微注射针（加热温度 = 700，FIL = 4，VEL = 40，DEL = 170，PUL = 160）
Leica M165 FC 荧光体视显微镜	Leica	M165 FC	用于飞虱筛选
显微注射显微镜	Leica	MZ12-5	配备XY载物台的显微注射专用显微镜
显微操作器	Narishige	MN-151	用于定位显微注射针
微量移液管斜面研磨仪	Sutter Instruments	FG-BV10-D	用于研磨注射针斜面（使用“细”级研磨板，角度为20°）
显微镜载物台	AmScope	GT100 X-Y 滑动台	用于在显微镜下定位和移动胚胎
微型画笔	Testor #2 8733	三支装 281206	用于胚胎操作的精细画笔
注射针夹持器	Narishige	HI-7	用于固定显微注射针
Percival 培养箱	Percival	I41VLH3C8	用于饲养注射后的个体直至孵化
培养皿（100 × 15 mm）	VWR	89038-968	用于制作产卵用琼脂皿
pGEM-T Easy 载体系统I克隆试剂盒	Promega	A1360	用于克隆 Pm white 靶位点
酚红	Sigma	143-78-8	显微注射缓冲液
普通显微镜载玻片或盖玻片	Fisher Scientific	12-549-3	用于固定显微注射用的卵
质粒DNA中量提取试剂盒	Zymo	D4200	用于纯化可用于注射的质粒DNA
塑料石蜡膜	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	卷装尺寸：4 英寸 × 125 英尺
保鲜膜	Glad ClingWrap 保鲜膜	NA	包裹整个产卵室
引物 - PmW CRISPR 检测 F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmole DNA 寡核苷酸	用于扩增 Pm white 基因靶位点区域的第一轮引物
引物 - PmW CRISPR 检测 R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT	IDT	25 nmole DNA 寡核苷酸	用于扩增 Pm white 基因靶位点区域的第一轮引物
引物 - PmW CRISPR 检测 F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmole DNA 寡核苷酸	用于扩增 Pm white 基因靶位点区域的第二轮引物
引物 - PmW CRISPR 检测 R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmole DNA 寡核苷酸	用于扩增 Pm white 基因靶位点区域的第二轮引物
石英毛细管	Sutter Instruments	QF100-50-10	用于制作显微注射针（外径1 mm，内径0.7 mm，长度10 cm）
筛网（白色欧根纱织物）	Joann Fabrics	16023889	用于覆盖成虫容器
Sparkleen 清洁剂	Fisher Scientific	04-320-4	用于清洗器皿
蔗糖	Fisher Scientific	BP220-1	用于配制10%蔗糖溶液