显微镜注射玉米飞虱、 游隼、用于CRISPR/Cas9基因组编辑的胚胎

玉米飞虱，Peregrinus maidis，是玉米¹，^2，3的经济重要害虫。它们对植物造成直接的物理损害，无论是在用刺穿吸口器进食时，还是在繁殖过程中，当它们将胚胎直接放入植物组织中时^2，4。尽管对作物的直接损害有多种途径，但这些昆虫对作物健康的最大影响是间接的，因为它充当玉米花叶病毒（MMV）和玉米条纹病毒^5，6的载体。MMV能够在其P. maidis载体的体内复制，使病毒在其整个生命中持续存在于单个昆虫中，因此它们可以继续将病毒传播给新的宿主植物^7，8。控制麦迪假单胞菌及其载体病毒的最常见方法是杀虫剂。

不幸的是，这些产品管理不善导致目标害虫产生抗药性^{以及污染环境}9。因此，需要新的策略来减少这种昆虫/病毒-害虫组合造成的作物损失。先前的工作表明，RNA干扰（RNAi）可能是少女假单胞菌的有效控制方法，因为即使在摄入双链RNA（dsRNA）时，它们也容易受到基因表达下调的影响¹⁰。然而，在田间管理dsRNA的最有效方法是通过昆虫赖以生存的植物;因此，作物仍然容易受到昆虫已经携带的任何病毒的影响。随着CRISPR / Cas9基因组编辑的出现，新的害虫控制策略成为可能，包括基于Cas9的基因驱动^11，12，^可用于减少害虫种群的规模^，或用对病毒载体具有抗性的个体取代所述种群。

然而，任何类型的基因驱动系统的开发和部署都需要开发转基因技术。这些方法对于在少女假单胞菌中进行RNAi实验不是必需的，因为由于少女假单胞菌¹⁰，¹³中RNAi的效率^，假定dsRNA和/或siRNA能够穿过细胞膜。对于传统转基因或基于Cas9的基因编辑中使用的DNA和/或蛋白质来说，情况并非如此，其中任何一个都是产生携带基因驱动的昆虫的前兆。为了完成基因编辑或其他形式的种系转化，理想情况下，这些DNA和蛋白质在合胞胚层阶段，在昆虫胚胎细胞化之前，被显微注射到胚胎中。时机至关重要，因为合胞阶段是发育的最早部分^14，15。由于雌性假单胞菌优先产卵在植物组织中，因此提取足够数量的细胞前胚胎进行显微注射可能是劳动密集型和耗时的。因此，开发了新技术，以便在细胞化之前快速收集和微注射少女假单胞菌胚胎。

1. 雌 性假单胞 菌成虫的菌落级饲养

1. 每个养殖笼每周至少种植四盆玉米，每盆3-4粒种子。在无昆虫的环境中生长。
2. 当植物~5周龄时，放在30厘米x 30厘米x 60厘米的笼子里。
3. 从研究实验室或野外获得足够数量的 P. maidis 成虫（~500），并放入装有9-12株玉米（3-4盆）的防虫笼中。
4. 将菌落保持在25°C（±1°C），湿度至少为70%和14:10光循环的昆虫饲养培养箱中。
5. 为了产生一个年龄校准的菌落，在产卵四天后移除所有最初的成虫，并让产在笼子里的胚胎孵化并自然老化。
6. 用吸气器收集将5周龄 的P. maidis 昆虫（成虫）移至新鲜玉米植株进行每周传代培养（图1）。然后，将成虫放到装有新鲜玉米植物的干净笼子中。为了保持用于实验目的的年轻成鱼的稳定供应，每周准备新鲜的年龄校准笼子。
7. 每天两次给笼子里的花盆浇水。定期剪掉秸秆，去除腐烂的植物材料，并根据需要更换新鲜玉米盆。
   注意:通过适当的维护，菌落可以持续~5周（即，足够长的时间让放在笼子里的胚胎变成成虫）。

2. 琼脂糖基产卵室

1. 通过将 1% w/v 琼脂糖倒入干净的 100 mm x 15 mm 培养皿中，制作鸡蛋收集盘（产卵培养基）。凝固后将产卵培养基储存在4°C。
2. 准备10%w / v蔗糖溶液喂养成人。将蔗糖溶液在-20°C下储存长达一个月。
3. 通过在 1 盎司杯子的底部切一个孔（参见 材料表）并在孔上粘上屏幕以进行空气交换，制作一个容纳成年人的腔室（图 2）。
4. 将塑料石蜡膜切成5厘米x 5厘米的正方形;每杯留出2个方块。
5. 从年龄校准的 少女假单胞菌菌 落中收集~15只1周大的成年雌性。要选择雌性，请检查腹部的腹侧，并寻找产卵器，该产卵器通常比腹部的其他部分更暗（图3）。如果设置多个产卵室，则在 15 mL 锥形小瓶中保持成人长达一小时。在之前在冰上短暂冷却昆虫，然后转移到成年容器中。
   注意:此检查可以在没有显微镜的情况下进行。有时间进食和交配的成年雌性通常也比成年雄性具有更大的腹部，并且更温顺;因此，可以更容易地从笼养种群中选择它们。
6. 将雌性转移到成年容器中，并用1层塑料石蜡膜将其均匀拉伸3-4倍于其原始尺寸来密封杯子（图4A，B）。
7. 将 400 μL 10% w/v 蔗糖溶液涂在塑料石蜡膜密封的顶部，并加入第二层塑料石蜡膜，完全如上所述拉伸塑料石蜡膜（图 4C，D）。
   注意:拉伸塑料石蜡膜的夹层对蔗糖溶液加压，这对成人喂养非常重要，但不会阻止雌性将产卵器一直刺入产卵培养基。
8. 将成人室放在鸡蛋收集盘上，塑料石蜡膜侧直接放在产卵培养基上，并用保鲜膜包裹整个产卵室，不要覆盖气孔，因为这些是空气交换所必需的（图5）。
9. 将每个产卵室在25°C，湿度为70%，光照周期为14:10。
10. 每天更换塑料石蜡膜和10%w / v蔗糖溶液的夹层，并清除杯内积聚的任何水分。

3. 高湿度环境下的胚胎收集和排列

1. 在加湿空间或通风橱（加湿罩; 图6）确保工作环境在整个显微注射过程中达到至少70%的湿度。
2. 在所需的产卵期后检查产卵培养基中的鸡蛋。在潮湿的罩子或其他潮湿的环境中执行此操作。
   注意:通常使用的产卵期是过夜，从下午 6 点到上午 10 点，持续 ~16 小时。
3. 如果在琼脂糖中产下任何卵，请使用细镊子小心地将它们挖出，然后将它们放在琼脂糖的表面上以保持湿润（图7A）。
4. 在 22 mm x 30 mm 盖玻片上粘贴一条 1 mm x 15 mm 双面胶带（图 7B）。将盖玻片胶带面朝上放在产卵培养基上（图7C）。
5. 从琼脂表面捡起每个单独的卵子，然后用细刷移动到双面胶带上。去除任何完全白色或黑色的鸡蛋。健康的鸡蛋将是半透明的。
6. 将香蕉形鸡蛋侧放，较大的一端粘在双面胶带上（图7D）。
   注意:始终将鸡蛋保存在高湿度环境中，例如底部有一层 1% 琼脂的培养皿。

4. CRISPR试剂和注射针的制备

1. 使用火焰/棕色型微量移液器拉动石英针。
2. 使用微量移液器斜面石英针。
3. 使用双面胶带将拉针固定在透明容器（如培养皿）中，直到准备使用。
4. 将 0.5 μL Cas9 蛋白（5 μg/μL 储备液）和 0.5 μL sgRNA（4 μg/μL 储备液;参见 材料表）与 1 μL 酚红缓冲液（最终体积为 5 μL）混合制备进样溶液。要沉淀可能堵塞针头的颗粒，请短暂涡旋溶液，并以最大速度离心3分钟。
5. 回填注射针头，注意将注射混合物留在针头的锥形端附近。从针尖上去除气泡（如果有）。
6. 小心地将回填针头放入针架中，并拧紧不锈钢环，以便在显微注射过程中将针头牢固地固定到位。
7. 用细小的湿润画笔轻轻抚摸斜面尖端，同时通过注射系统向针头输送气压，从而从针头产生可靠的注射液流。
   注意:当注射混合物可以少量离开尖端时，针头已准备好注射。

5. 显微注射和注射后护理

1. 准备显微注射平台，用1%琼脂填充干净的100 mm x 15 mm培养皿，形成与培养皿顶部齐平的水平琼脂层。
2. 将预先制备的带有~25个胚胎的盖玻片放在琼脂平台上（图8A）。
   注意:所有注射步骤必须在加湿罩（~70%湿度）内进行。
3. 通过将针尖放入一滴水中并启动注射循环来检查注射压力。
   注意:如果压力设置正确，少量注射溶液应分散到水中（图8B）。
4. 将针插入胚胎的较大端，从盖玻片的左侧接近（图8C）。将注射液输送到鸡蛋中，然后快速拔出针头。
5. 注射所有鸡蛋后，将盖玻片放在新的1%琼脂培养皿的表面上，并将培养皿转移到湿度室中（图9）。

6. 胚胎的孵化和孵化

1. 将孵化室置于25°C培养箱中6天。
2. 使用清水和细刷将任何幸存的胚胎转移到35 mm x 10 mm培养皿中，用水润湿的滤纸覆盖培养皿底部。用塑料石蜡膜密封培养皿，并保持在25°C以使胚胎孵化。注射后6天开始检查胚胎的存活情况。
   注意:第一龄若虫将在第8天左右开始孵化。
3. 使用细刷将若虫转移到含有叶屑的培养皿中。盖上盘子，用塑料石蜡膜密封。
4. 将叶屑上的密封培养皿在25°C下孵育48小时。
5. 用细刷将所有 2 天大的若虫从一轮注射转移到有玉米植株的饲养笼中。如果具有可见表型的注射者被回收到足够数量，请单独饲养它们，以最大限度地提高下一代目标性状的恢复。否则，对所有注射者进行大规模交配。
   注意:将幼崽轻轻地放在玉米植株的漩涡中，以提供庇护并确保其周围环境的适当湿度。
6. 在上述条件下饲养昆虫，确保适当的温度、湿度和定期转移到新鲜玉米植株上。
7. 筛选后代的预期表型。将表现出所需表型的个体放入自己的笼子中以建立纯合子系。

产卵室专门设计用于使雌性在保护 性 介质中产卵时进食，从而可以轻松回收卵。使用这种方法，回收足够数量的细胞前胚胎，用DNA，RNA和/或蛋白质进行显微注射。成年 P. maidis 雌性通常在玉米植株的叶组织内产卵，这使得在短时间内获得足够的卵成为一个挑战，因为它需要大量的叶子解剖。人工产卵环境为克服这些问题提供了解决方案。如 表1所示，在4周内从总共645名雌性身上收集了6，483个卵子。雌性通常在第 2 天后开始产卵，并从第 4 天到第 6 天提供最多的卵。排卵活动在第9天减慢。每个产卵室都在周五建立，并从周日到下周日检查鸡蛋。按照这个时间表，大多数卵子可以在工作周内收集进行显微注射。

这种产卵系统的第一个实际应用是测试Cas9介导的基因敲除的功效，使用眼睛颜色基因白色（Pmw）的P. maidis直系同源物作为靶标。已知白色突变会导致其他昆虫物种的眼睛色素沉着大量丧失，而白色是细胞自主的，允许在注射的个体中检测到突变16，17。为了增加即使是很小的突变也可能导致功能丧失的机会，引导RNA被设计为在ATP结合盒区域内切割，这是白色功能16所必需的。将少女假单胞菌胚胎注射20%酚红（注射缓冲液），终浓度为800ng/μL的Cas9注射缓冲液（Cas9对照），或在注射缓冲液中注射Cas9以及添加三个引导RNA，每个浓度为400ng / μL。在一个注射混合物中组合三个指南旨在进一步最大化产生突变体的机会，既通过创建大量删除，又通过补偿任何一个指南可能对切割无效的可能性。每种治疗的发育率相当（表2），50-60%的注射个体显示出发育迹象。缓冲液和Cas9对照的孵化率也相当;然而，接受三导向混合物的个体的孵化率相对较低。目前，尚不清楚生存率降低是白色功能丧失的结果，还是三指南混合的意外后果的结果，例如脱靶效应（见讨论部分）。然而，没有一个眼睛色素完全丧失（即完全敲除）的个体孵化出来，注射个体的后代也没有白眼。基于Cas9的诱变的靶向功效得到了两种验证。首先，对注射者进行眼睛色素沉着丧失的筛查。

在发育的71个引导注射个体中，23个显示出一定程度的色素损失（图10），其中9个孵化，导致敲除率为≥32%。在两种对照治疗中均未观察到眼睛色素损失。其次，通过聚合酶链反应（PCR）18 和测序19确认染色体突变。由于突变系无法恢复，因此从注射三向导混合物或缓冲液的胚胎池中分析基因组DNA。预计三向导混合物将从 白色 轨迹中去除~180个碱基对。这可以从从注射个体中分离的基因组DNA扩增的PCR产物以及从这些产品生成的相关序列数据中看到（图11）。这些综合证据表明，胚胎是在细胞化发生之前注射的。

图 1:吸气器。 有效的抽吸器可以通过塑料管在进气口处安装真空泵到 15 mL 塑料锥形管上来组装。应小心地从锥形管底部取出约0.5厘米。棉球应放置在锥形管中，在塑料管的开口上方，以便在收集时捕捉 少女假单胞菌 成虫并使它们远离真空泵。 请点击此处查看此图的大图。

图2:成人容器的构造。 （A） 所需用品（从左上角顺时针方向）:筛网、热胶枪、剃须刀片、1 盎司容器。（B）应在1盎司容器的底部切一个大孔，并切一个正方形的筛网，刚好足以覆盖该孔。（C）然后用热胶将屏幕粘在孔上。（D）胶水凝固后，应去除多余的网眼。 请点击此处查看此图的大图。

图3: P. maidis 成虫。 图中显示了雄性（左）和雌性（右） 少女假单胞菌 成虫的腹侧。产卵器在女性腹部可见，是个体性别的最清晰指标。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:将成虫密封在容器中 。 （A） 5厘米x 5厘米见方的塑料石蜡膜。（B）薄膜应均匀拉伸至其原始尺寸的3-4倍。（C）一旦成虫被放入成虫容器中，应将拉伸的薄膜放在开口上以固定成虫。然后将 400 μL 滴落的 10% w/v 蔗糖溶液放在薄膜顶部。（D）为了给成虫提供足够的喂食压力，应同样拉伸第二张5厘米x 5厘米见方的塑料石蜡薄膜，并放在蔗糖滴上。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:设置产卵室 。 （A）所需用品（从左上角顺时针方向）:保鲜膜，完整的成人容器（成人）和含有1%琼脂糖（产卵培养基）的培养皿。（B）成人容器应放在琼脂糖上，将塑料石蜡膜/ 10%蔗糖"三明治"直接放在产卵培养基上。（C）保鲜膜用于将成年容器固定在产卵培养基上。这样可以防止培养基过快变干。（D）应注意避免覆盖成人容器的屏幕，以便空气交换仍可继续。（E） 产卵室示意图。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:加湿罩。 在注射镜周围设置了一个配备加湿器的罩子，以最大限度地减少气流并在处理胚胎时保持湿度。工人就位后，可以将襟翼折叠在入口处，以帮助保持适当的湿度水平。 请点击此处查看此图的大图。

图7:收集胚胎以准备注射 。 （A）已沉积在产卵培养基中的胚胎。一对细镊子用于从培养基中提取胚胎并将它们放在其表面上。（B） 在 22 毫米 x 30 毫米盖玻片上放置一条 1 毫米 x 15 毫米的窄条双面胶带。（C）盖玻片可以放在产卵培养基上，以便于将胚胎从培养基表面转移到盖玻片上的胶带上。（D） 少女假单胞菌 胚胎呈香蕉形，一端比另一端窄（窄端用红色箭头表示;较宽的一端用黄色箭头表示，例如胚胎）。胚胎的宽端应放在胶带上。 请点击此处查看此图的大图。

图8:注射 。 （A）注射平台是用1%琼脂填充到边缘的培养皿。带有固定胚胎的胶带的盖玻片应直接放置在注射平台的表面上。（B）注射胚胎前应通过将少量注射溶液"注射"到一滴水中来测试注射压力。这种方法也可以在注射过程中随时使用，以检查针头是否有堵塞。（C）应通过将针头插入胚胎的较大端来注射胚胎。如果进样成功，进样液应该是可见的。 请点击此处查看此图的大图。

图9:注射后护理 。 （A）一旦注射了盖玻片上的所有胚胎，应将盖玻片置于含有1%琼脂糖的新鲜培养皿中。（B）然后可以将带有盖玻片的培养皿保持在湿度室（如图所示）中，直到胚胎孵化。 请点击此处查看此图的大图。

图 10: PMW 敲除表型。 （A）年龄匹配的对照和（B） Pmw 敲除胚胎，发育中的眼睛由黑色箭头表示。 B 中的胚胎是马赛克，因为可以看到一小条色素沉着。（C）年龄匹配的对照和（D） PMW 敲除幼崽，镶嵌在眼睛上显示不同的角度。 D 中的幼崽也是马赛克。白色箭头指向主图片中显示色素沉着丧失的区域。 请点击此处查看此图的大图。

图 11: PMW 敲除序列。 （A） Pmw mRNA的按比例模型，以500 bp的增量标记，指示gRNA结合位点的位置:G1，蓝色;G2，黄色;G3，粉红色。此时产生的任何移码突变都会破坏大部分翻译产品。（B）gRNA位点的基因组背景，全部在一个外显子中（粗体大写文本）。引导结合位点以与 A 相同的颜色突出显示，PAM 带有下划线。跨度为 ~300 bp。外显子的框架翻译如上所示，为大写文本中的单字母缩写。标记了两个特定于眼睛色素转运蛋白的图案。沃克B功能域的CDEPT基序用紫色框住，H环结构域的IHQP基序用绿色框住。这两个结构域对ATP转运蛋白功能至关重要。（C）使用两轮PCR扩增 Pmw 靶区。在凝胶上检查第二轮产品，以寻找由于成功去除导轨之间的区域而导致尺寸偏移的证据。车道:L = 100 bp 梯子;1 = PCR水控制;2 = 缓冲注射的鸡蛋;3-4 = 两组单独的鸡蛋注射三导混合物。只有接受三向导混合物的胚胎才会产生WT带（红色箭头）和完全切除产生的带（白色箭头）。（D）为了确认下部（白色箭头）条带的身份，对该DNA进行了纯化，克隆和测序。顶行是百搭型序列。另外两条线是来自两个克隆的序列。另外三个克隆与底部序列匹配。蓝色突出显示表示指南1的结合位点，而粉红色突出显示表示指南3的结合位点。在这两个等位基因中，这两个引导位点之间的整个区域已被删除。缩写: Pmw = 游隼少女白色 基因;gRNA = 引导 RNA;PAM = 原间隔相邻基序;ATP = 三磷酸腺苷;PCR = 聚合酶链反应;WT = 野生型;KO = 淘汰赛。 请点击此处查看此图的大图。

表1:来自人工产卵环境的代表性鸡蛋集合。 显示了来自四组鸡蛋收集杯的数据，鸡蛋计数从设置后的第二天开始，一直持续到第九天。

表2:3种不同注射混合物注射的存活率和敲除率。

作者没有什么可透露的。