使用麦格纳波特奥里扎伊的色度免疫沉淀测序方法对希斯通修饰分布进行全基因组分析

摘要

在这里，我们提出了一个协议，以分析全基因组分布的色石修改，它可以识别新的目标基因在M.oryzae和其他丝状真菌的发病机制。

摘要

色度素免疫沉淀测序 （ChIP-seq） 是一种强大且广泛使用的分子技术，用于绘制转录因子 （TFs）、染色质调节器和色石修饰的全基因组位置，以及检测整个基因组以发现 TF 结合模式和色石后翻译修饰。染色质修饰活动，如色蛋白甲基化，经常被招募到特定的基因调控序列中，导致染色质结构的局部变化，并导致特定的转录效应。稻米爆炸是全世界水稻上毁灭性的真菌病，是研究真菌与植物相互作用的示范系统。然而，在 麦格纳波特奥里扎伊 ，如何调节其毒性基因的分子机制仍然难以捉摸。更多的研究人员需要使用ChIP-seq来研究组蛋白表观遗传修饰如何调节他们的目标基因。ChIP-seq也广泛用于研究动物和植物中蛋白质与DNA之间的相互作用，但在植物病理学领域应用较少，尚未得到很好的开发。本文介绍了ChIP-seq的实验过程和操作方法，以确定与 M.oryzae 功能目标基因结合的希司他甲基化（如H3K4me3）的全基因组分布。在这里，我们提出了一个协议，以分析全基因组分布的色石修改，它可以识别新的目标基因在M.oryzae和其他丝状真菌的发病机制。

引言

表观遗传学是基因研究的一个分支，它是指基因表达的遗传变化，而不改变基因的核苷酸序列。越来越多的研究表明，表观遗传调节在真核细胞的生长发育中起着重要作用，包括通过折叠和组装成^1、2等高阶结构的动态过程调节和影响基因表达的染色质。色度素重塑和共价色蛋白修饰通过色度素聚合物的变异影响和调节染色质的功能和结构，从而达到调节基因表达^{3、4、5、6}的功能。平石的后翻译修改包括乙酰化、磷酸化、甲基化、单体化、相扑和ADP核糖化^7、8、9。Histone H3K4 甲基化，特别是三甲基化，已映射到转录启动站点，它与真核生物^10、11中的转录复制、重组、修复和 RNA 处理^相关联。

ChIP-seq技术于2007年引进，现已成为全基因组转录调节和表观遗传机制^12、13分析的实验标准。这种方法适用于全基因组尺度，并用于获取组蛋白或转录因子相互作用信息，包括DNA结合蛋白的DNA片段。任何与感兴趣的蛋白质相交的DNA序列都会作为染色质复合物的一部分沉淀。新一代测序技术也用于测序36-100桶DNA，然后与相应的目标基因组匹配。

在植物病原真菌中，研究最近开始研究希司他甲基化修饰如何在致病过程中调节其目标基因。先前的一些研究证明，与平方甲酶相关的基因的调控主要反映在基因沉默和催化二次代谢物（SM）的产生上。MoSet1 是M. oryzae中的 H3K4 甲基酶。该基因的敲除导致H3K4me3修改¹⁴的完全删除。与野生型菌株相比，突变体中基因MoCEL7C的表达在CMC诱导状态和非诱导状态（葡萄糖或大提琴）中受到抑制，MoCEL7C的表达增加^15。在富萨里姆胶质中，KMT6可以促进H3K27me3的甲基化改造，调节真菌的正常发育，并有助于调节含有SM基因簇16、17、18、19^的"神秘基因组"。2013年，康诺利报告说，H3K9和H3K27甲基化通过二次代谢物和调节目标基因抑制的效应因子调节真菌的致病过程^。在阿斯珀吉卢斯，H3K4me2和H3K4me3组的改变与基因活化有关，在控制SM基因簇²¹的染色质水平调节方面起着重要作用。在M.oryzae，Tig1（酵母和哺乳动物中的Tig1同源）是一个哈德（石质去乙酰酶^）22。Tig1基因的敲除导致空突变体中致病性和孢子生产能力的完全丧失。它对过氧环境更敏感，不能产生感染性催眠^22。

由M.oryzae引起的稻米爆炸是世界上大多数水稻种植区最严重的水稻疾病之^一。由于其代表性的感染过程，M.oryzae与许多重要致病真菌的感染过程相似。由于真菌可以轻易地进行分子遗传操作，因此已成为研究真菌与植物相互^{作用的模型}生物体。阻断M. oryzae感染过程的每一步都可能导致感染不成功。感染过程中的形态变化受整个基因组功能和基因转录的严格控制。其中，表观遗传修饰，如平石甲基化，在功能基因的转录调节^中起着至关重要^的作用。然而，到目前为止，在M.oryzae发病基因转录中，对表观遗传修饰的分子机制的研究很少，如平石甲基化和平石乙酰化。因此，在研究这些致病相关基因的上下游调控网络的同时，进一步完善水稻爆菌的表观遗传调控机制，将有助于制定水稻爆破防治策略。

随着ChIP-seq等功能基因组学的发展，特别是在表观遗传学方面，这种高通量数据采集方法加速了染色体的研究。利用ChIP-seq实验技术，可以识别 出M.oryzae 和其他丝状真菌的全基因组分布（如H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3）。因此，这种方法可以帮助阐明表观遗传修饰在植物病理学中的真菌发病机制中如何调节其候选靶基因的分子机制。

方案

1. 从奥里扎伊预制原体

1. 准备燕麦片番茄（OTA）。
   1. 重30-50克燕麦片，在800mL水中煮沸（ddH₂O），煮20分钟。过滤通过两层纱布，并采取过滤。
   2. 挑选成熟的西红柿并剥皮。挤压果汁，过滤两层纱布，收集150ml的过滤果汁。
   3. 将番茄汁和准备好的燕麦过滤液彻底混合，加入 ddH₂O 至 1000 mL。
   4. 在 500 mL 圆锥形烧瓶中加入 250 mL 的 OTA 和 2.5 克的醋粉，并在 20 分钟内加入高压灭菌。储存在 25 °C。
2. 将 25 毫升的自动 OTA 倒入 5 厘米 x 5 厘米的佩特里盘的玻璃杯中。总共准备10个这些培养皿。在 OTA 凝固在培养皿上后，将菜肴倒置存放在 25 °C 下。
3. 使用消毒牙签从 M. oryzae（ 野生型菌株 P131、淘汰菌株 +mobre2、+mospp1 和 +moswd2）中挖出一小块霉菌，并将其放在准备好的 OTA 菜肴上。在光照条件下在 28 °C 下培养它们 4-6 天。
   注:将培养皿倒置以防止污染。
4. 使用 1000 μL 移液器在 OTA 菜肴中加入 1000 μL 液体完整介质 （CM） （0.6% 酵母提取物、0.3% 水解酶、0.3% 酸性病例水解剂、1% 葡萄糖）。
   注: 催眠在 Ota 菜肴上生长了 4 - 6 天。
5. 用接种循环刮掉野生型菌株和淘汰菌株的肌膜。
6. 收集肌电碎片，并将它们转移到250ml的液体完全介质（CM）。
7. 在 28 °C 的三角形烧瓶中生长真菌碎片，持续 36 小时，在 150 rpm 时摇晃。
8. 使用漏斗过滤和收集真菌催眠。
9. 用 500 mL 的 0.7 M NaCl 溶液清洗真菌催眠。
10. 收集真菌的肌塞利姆和称量它。
    注:在称重之前，不需要干燥肌酸。
11. 每1克真菌肌塞添加+1mL裂解酶渗透溶液。
    1. 准备20毫克/mL裂解酶渗透溶液，溶解溶解酶从 三叶草哈齐亚努姆 在0.7M NaCl。
12. 将催眠物置于 28 °C 的 3-4 小时，在 150 rpm 处摇晃。
13. 用 50 mL 的 0.7 M NaCl 溶液清洗溶解催眠。
14. 在 2，000 x g 和 4 °C 下收集原质和离心机 15 分钟。
15. 离心后，小心丢弃超高音。在 4 °C 下以 0.7 M NaCI 缓冲器的 20 mL 中重新使用原质。

2. 体内交互和声波

1. 加入 55 μL 的 37% 甲醛（添加甲醛滴，直到最终浓度为 1%）到 2 mL 的 NaCI 缓冲器，其中包含用于交叉链接的支撑。
2. 在 25 °C10 分钟内孵育原质。
3. 在每个管中加入 20 微升 10 倍甘油，以淬火未反应的甲醛。
4. 在 25 °C 下旋转并孵育 5 分钟。
5. 离心机 15 分钟，2，000 x g 和 4 °C。
6. 离心后，小心丢弃超高音。将颗粒重新悬回 1 mL 的 0.7 M NaCI 溶液中。
7. 离心机 10 分钟，2，000 x g 和 4 °C。
8. 离心后，小心丢弃超高音。在 RIPA 缓冲区 750 μL 中重新使用颗粒（50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、2 m EDTA pH 8、1% NP-40、0.5% 脱氧酸钠、0.1% SDS 和蛋白酶抑制剂）。
9. 加入 37.5 μL 的 20 倍蛋白酶抑制剂。
10. 将原体从上一步转移到 1.5 mL 离心机管。
11. 立即用声波仪进行声波（25% W，输出 3s，停止 5 s，4 °C），约 10 分钟。此步骤的目的是在一段时间内对交叉链接的解质进行声波，以确定最佳条件。
    注:在此步骤中，解冻剂可冻结在 -80 °C。
12. 如果已经确定了声波的最佳条件，则继续下一步。
13. 如果需要，取出5微升原质进行玫瑰凝胶分析（未剪切的DNA）。
14. 用超声波同质化器用声波剪切染色素8分钟（25%W，输出3s，停止5s，4°C）。
15. 样品超声波破碎后，取出部分样品作为"输入"。输入不执行 ChIP 实验，并包含样品被声波化后释放的所有 DNA 和蛋白质。
16. 声波化后，运行1%的玫瑰凝胶电泳，以分析DNA片段的长度。
    注:藻糖凝胶电泳结果表明，DNA片段的长度为200-500桶（图4）。
17. 将声波管放在冰上，以防止蛋白质降解。
18. 离心机 10 分钟，10，000 x g 和 4 °C。
19. 离心后，将离心超离心剂转移到新的 1.5 mL 离心机管中，并存储在 -80 °C 下供以后使用。在此步骤中获得的色度素溶液可用于后续 IP。
20. 在进行 IP 实验之前，将每个染色质样品稀释到 1:10 的比例与 1x RIPA 缓冲器（例如，将 10 μL 的染色质样品添加到 1 μL 的 1×RIPA 缓冲区）。

3. 交叉链接蛋白质/脱氧核糖核酸的IP

1. 派佩特 50 μL 超面磁蛋白珠成 2 mL 离心机管。将管子放在磁架上。让磁珠沉淀。取出超高超。
2. 在管子中加入1mL的1x RIPA缓冲器（在冰上预冷却），并三次清洗超面磁蛋白珠。洗净后，将管子放在磁架上，取出超高分子。在每个管子中加入 100 μL 的 1x RIPA 缓冲器。
3. 在管中加入 300 μL 的胆碱样品（使用 2 x^{10 7} 细胞）、100 微升超面磁蛋白珠和 4 μL H3K4me3 抗体。
4. 使用带有鼠标IgG的样品作为阴性控制。
   注:本协议中使用的鼠标IgG包含 0.01 M 磷酸盐缓冲和 0.15 M NaCl，并将保持在 20 °C 以下冻结（参见 材料表）。
5. 混合好后，将样品放在旋转摇床上，在4°C，30xg下孵育过夜。
   注:有可能减少免疫沉淀（IP）的孵化时间。孵化时间取决于不同的因素（例如抗体、基因靶点、细胞类型等），需要进行经验测试。

4. 收集和冲洗知识产权产品

1. 将超级磁性蛋白珠放在磁性支架上，使它们颗粒状。吸气并丢弃超高人。
2. 通过将珠子重新悬浮在 1 mL 的 1x RIPA 缓冲器中，洗涤超面磁蛋白珠抗体/色度素复合物。
3. 在旋转摇床上冲洗管子5分钟，并在30 x g下取出超高纳特。
4. 加入1 mL低盐免疫复合洗涤缓冲器（0.1% SDS，1% 特里顿 X-100，2 mM EDTA，20 m M Tris-HCl pH 8.1 和 150 mM NaCl）。
5. 在旋转摇床上冲洗管子 5 分钟，取出超高纳特。
6. 在离心机管中加入 1 mL 高盐免疫复合洗涤缓冲器（0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1 和 500 mM NaCl）。
7. 将管子放在旋转摇床上 5 分钟，取出超高音。
8. 在离心机管中用 1 mL 的 LiCl（0.25 M LiCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸、1 m EDTA 和 10 mM Tris-HCl pH pH 8.1）冲洗。
9. 将管子放在旋转摇床上 5 分钟，取出超高音。
10. 再次用 1 mL 0.25 M LiCI 缓冲器冲洗试管，用移液器取下超强剂，然后丢弃超高纳特。
11. 添加 1 mL 的 TE 缓冲器 （10 mM Tris-HCl pH 8.1， 1 m EDTA）。
12. 将管子放在旋转摇床上5分钟，30 x g。
13. 再次用 1 mL TE 缓冲器清洗管子，然后用移液器取出超纳特。
14. 收集珠子。

5. 蛋白质/DNA复合物的脱氧核糖核酸

1. 为所有 IP 和输入管准备 10 μL 的 20% SDS、20 μL 的 1 M NaHCO 3、170 μL 的无菌蒸馏 H₂O） 。
2. 在每个离心机管中加入 100 μL 的脱毛缓冲器。
3. 在 65 °C 下放 15 分钟。
4. 离心机在 10，000 x g 和 4 °C 下离心 1 分钟，并将超高离心剂收集到新的离心机管中。
5. 重复步骤 5.2 - 5.4 并结合 eluates。在输入DNA的 10 μL 中加入 190 μL 的放射缓冲。（总容量 = 200 μL）。

6. 蛋白质/DNA复合物的反向交联

1. 将 8 μL 的 5 M NaCl 添加到所有管子中，并在 65 °C 下孵育 4-5 小时或过夜，以逆转 DNA 蛋白交联。
   注:在此步骤之后，将样品存储在 -20 °C 下，并在必要时在第二天继续协议。
2. 加入 1 μL 的 RNase A，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 将4微升蛋白酶K（以₂₀毫克/兆升溶解在H2 O中，储存在-20°C）到每个管子中，在45°C下孵育1-2小时。

7. 净化和恢复DNA

1. 在离心机管中加入 550 μL 的苯酚/氯仿/同酰酒精混合物（比例为 25:24:1）。
2. 彻底漩涡混合物1分钟。
3. 离心机 15 分钟， 10，000 x g， 并吸气超纳坦。
4. 将提取的超纳特从上一步转移到一个新的 1.5 mL 离心机管。
5. 在管中加入 1/10 卷 3 M 醋酸钠溶液、2.5 卷绝对乙醇和 3 微升糖原（20 毫克/兆升）。
6. 将样品放在冰箱中-20°C过夜，以便降水。
7. 离心机 15 分钟，10，000 x g 和 4 °C。
8. 离心后丢弃超高纳特。用 1 mL 的 75% 乙醇（需要新鲜准备）在 10，000 x g 下清洗颗粒三次。
9. 将洗过的沉淀物放在干净的长凳上，让酒精干燥。
10. 加入50微升无菌去离子H₂O，以充分溶解沉淀物。
11. 将测序适配器与DNA片段结合，并使用高通量测序平台对DNA进行测序。

8. DNA 修复和索莱萨图书馆建设

1. 修复DNA端，使用DNA端修复套件（1-34 μL DNA） 生成钝端DNA， 5 μL 的 10 倍端修复缓冲器，5 μL 的 2.5 mM 每个 dNTP，5 μL 的 10 mM ATP，1 μL 的端修复酶混合，和 H₂O 调整反应体积到 49 μL）。
2. 使用 PCR 净化套件或酚:氯仿提取来净化 DNA。将DNA以 30 微升 1x TE pH 7.4 的 30 微升内重新使用或重新使用。
3. 将"A"添加到 3' 端（从步骤 2 中添加 30 μL 的 DNA，H 2 O 的₂μL，10 倍 Taq 缓冲器的 5 μL，10 μL 的 1 mM dATP 和 3 μL 的 Taq DNA 聚合酶）。将试剂添加到 0.2 mL PCR 离心机管中，混合良好，并在 PCR 机器中以 72 °C 的速度发生反应，时间为 10 分钟。
4. 通过混合 10 μL 的 DNA、9.9 μL 的 H₂O、2.5 μL 的 T4 DNA 韧带缓冲、0.1 μL 适配器寡头混合和 2.5 μL 的 T4 DNA 韧带进行链接器结结。将试剂添加到 0.2 mL PCR 离心机管中，混合均可。在 16 °C 下孵育它们，4 小时。
5. 根据制造商的协议，使用 PCR 净化套件净化 DNA。Elute 与 20-25 μL 的弹性缓冲。
6. 在DNA库建立之前，确定纯化DNA的浓度，以确认其在随后的测序实验中的用途。
7. 使用荧红仪检测DNA浓度。在冰上熔化样品后，在 1000 x g 和 4 °C 下将其彻底混合并离心机 30s。 然后采集适量的样品，在波长为 260 nm 的荧光计中测量。
8. 将具有合格质量和浓度的DNA样本放在 Illumina 测序平台上进行测序。
9. 测序前，使用 PCR 引数、PE1.0 和 PE2.0 以及 2 倍高保真度主组合（10.5 μL DNA、12.5 μL 2 倍高保真主组合、1 μL PCR 引数 PE1.0 和 1 μL PCR 引数 PE2.0）放大 DNA。将试剂添加到 0.2 mL PCR 离心机管中，混合均可。
10. 在 PCR 机器中运行 PCR 反应:95 °C 预成熟 2 分钟;然后 35 周期 95 °C 变性为 10s， 退火在 60 °C 为 15s， 延长在 72 °C 为 5s;最后延长 72 °C 5 分钟。最后，在 4 °C 下孵育反应。
11. 使用DNA进行聚类生成，并在2000年伊卢米娜·希塞克上逐一进行测序。
    注:在此协议中，使用氧化铝流细胞进行聚类生成。根据制造商的指示，在 Illumina 基因组分析仪上执行逐合成顺序。

结果

ChIP-seq 方法的整个流程图如图1所示。ChIP-seq实验使用抗体对H3K4me3在野生型菌株P131和三个空突变菌株，这是没有mobre2，mospp1和moswd2基因，以验证整个基因组的histone H3K4me3分布在M.oryzae的配置文件。 野生型菌株的原体，+mobre2，+mospp1和+moswd2，在25%W，输出3s，停止5s，在4°C准备和声波。 此外，染色质被免疫净化与H3K4me3抗体和发电机珠蛋白A/G。随后，使用苯酚-氯仿方法提取DNA片段，用于构建测序库，并在高通量测序平台上用单端进行测序。

使用H3K4me3抗体的野生型、+mobre2、+mospp1和+moswd2菌株使用ChIP-seq方法的代表性结果见图2。在其功能目标区域，+mob...

讨论

最近，ChIP-seq已成为一种广泛使用的基因组分析方法，用于确定由特定体调修改的TF或浓缩站点的结合部位。与以往的 ChIP-seq 技术相比，新的 ChIP-seq 技术具有高度的灵敏性和灵活性。结果以高分辨率提供，不产生负面影响，例如核酸非特异性杂交引起的噪声信号。虽然这是一种常见的基因表达分析，但许多计算方法已经得到验证，ChIP-seq 数据在噪声和变异性方面的复杂性使得 ChIP-seq 尤其难以克服这一问题。在数据分析方面，管理和分析 ChIP-seq 实验产生的大量数据也是一个尚未充分解决的挑战。

在ChIP-seq实验中有几个关键步骤。首先，原体的准备工作非常重要。有必要控制坍塌时间，以便收集高质量的原体。超声波也很重要，超声波时间应该控制，太长或太短是行不通的。其次，添加的抗体量应足以促进与蛋白质结合的更多DNA片段的富集。在验证在ChIP-seq实验中沉淀的DNA的质量和数量时，使用了Qubit荧波仪。Agilent 2100用于检测DNA的质量浓度和片段分布，为样品是否可用于随后的图书馆建立和测序实验提供了依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性酪蛋白水解物	WAKO	65072-00-6	中等配置
琼脂粉	scientan	9002-18-0	中等配置
脱氧胆酸	MedChemExpress	83-44-3	蛋白质和溶出
DNA 末端修复试剂盒	NovoBiotec	ER81050	修复 被酶或机械剪切
损伤的 DNA 或 cDNADynabeads	Invitrogen	no.100.02D	结合靶标
EB 缓冲液	JIMEI	JC2174	膜和液体
EDTA	ThermoFisher	AM9912	蛋白酶抑制剂
酶酪蛋白水解物	Sigma	91079-40-2	中等配置
葡萄糖	Sigma	50-99-7	中等配置
糖原	ThermoFisher	AM9510	沉淀作用
H3K4me3 抗体	Abcam	ab8580	对 H3K4me3 蛋白的免疫反应
illumina 基因组分析仪	illumina	illumina Hiseq 2000	大配置
Illumina PCR 引物	illumina	CleanPlex	随机通用引物
异戊醇	化学书	30899-19-5	纯化的 DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	特异性去除 RNA
裂解酶	Sigma	L1412-10G	细胞裂解缓冲液
小鼠 IgG	Yeasen	36111ES10	动物正常免疫球蛋白
NaCl 溶液	ThermoFisher	7647-14-5	培养基配置
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	蛋白质复合物洗脱液的制备
NP-40	ThermoFisher	85124	细胞裂解物促进细胞裂解
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004	纯化程序从 DNA 样品中去除引物
蛋白酶抑制剂	ThermoFisher	A32965	一种降低蛋白质活性的蛋白质抑制剂
蛋白酶 K	ThermoFisher	AM2546	DNA 提取试剂
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	中等配置
RIPA 缓冲液	ThermoFisher	9806S	细胞裂解缓冲液
RNase A	ThermoFisher	AM2271	纯化的 DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	掩盖电荷差异
乙酸钠溶液	ThermoFisher	R1181	乙酸缓冲液
脱氧胆酸钠	ThermoFisher	89904	抑制蛋白酶降解
T4 DNA 连接酶	ThermoFisher	EL0011	在 ATP 作为辅酶的条件下，DNA 连接酶
T4 DNA 连接酶缓冲液	ThermoFisher	B69	DNA 连接酶缓冲液
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	缓冲液作用
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	保持膜蛋白稳定
酵母提取物	OXOID	LP0021	培养基配置