使用染色质免疫沉淀测序方法对中国稻瘟菌Magnaporthe oryzae进行全基因组组蛋白修饰分布分析

摘要

本文介绍了一种用于分析组蛋白修饰全基因组分布的实验方案，该方法可鉴定稻瘟病菌及其他丝状真菌致病过程中的新靶基因。

摘要

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）是一种强大且广泛应用的分子技术，用于绘制转录因子（TFs）、染色质调控因子和组蛋白修饰在全基因组上的定位，同时可用于检测整个基因组以揭示转录因子的结合模式和组蛋白翻译后修饰。组蛋白甲基化等染色质修饰活性通常被招募到特定的基因调控序列上，引起染色质结构的局部改变，从而产生特定的转录效应。稻瘟病是一种在全球范围内严重危害水稻的真菌病害，也是研究真菌-植物互作的模式系统。然而，组蛋白修饰如何调控稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）毒力基因的分子机制仍不清楚。越来越多的研究人员需要利用ChIP-seq来研究组蛋白表观遗传修饰对其靶基因的调控作用。ChIP-seq也广泛应用于动植物中蛋白质与DNA相互作用的研究，但在植物病理学领域应用较少，尚未得到充分发展。本文描述了ChIP-seq的实验流程与操作方法，用于鉴定稻瘟病菌（M. oryzae）中与功能靶基因结合的组蛋白甲基化（如H3K4me3）在全基因组范围内的分布情况。本文提供了一套分析组蛋白修饰全基因组分布的实验方案，有助于识别稻瘟病菌及其他丝状真菌致病过程中的新靶基因。

引言

表观遗传学是遗传学研究的一个分支，指在不改变基因核苷酸序列的前提下，基因表达发生的可遗传变化。越来越多的研究表明，表观遗传调控在真核细胞的生长与发育过程中发挥着重要作用，其中包括染色质通过折叠和组装成高级结构的动态过程来调控并影响基因表达^1,2。染色质重塑和组蛋白共价修饰通过改变染色质聚合物的状态，影响和调控染色质的结构与功能，从而实现对基因表达的调控^3,4,5,6。组蛋白的翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、单泛素化、SUMO化以及ADP核糖基化^7,8,9。组蛋白H3K4甲基化，尤其是三甲基化，已被定位至转录起始位点，在真核生物中与转录复制、重组、修复以及RNA加工等过程相关^10,11。

ChIP-se....

方案

1. M. oryzae 原生质体制备

1. 制备燕麦-番茄琼脂（OTA）。
   1. 称取30–50 g燕麦片，加入800 mL去离子水（ddH₂O）中煮沸₂O）中孵育 20 分钟。用两层纱布过滤，收集滤液。
   2. 挑选成熟的番茄并去皮，挤出汁液，用两层纱布过滤，收集150 mL滤液。
   3. 将番茄汁与制备好的燕麦滤液充分混合，并加入ddH₂O。₂O 至 1000 mL。
   4. 向500 mL锥形瓶中加入250 mL OTA和2.5 g琼脂粉，121 °C高压灭菌20 min。25 °C保存。
2. 将25 mL高压灭菌的OTA倒入一个5 cm × 5 cm的玻璃培养皿中。共制备10个这样的培养皿。待OTA在培养皿中凝固后，将培养皿倒置于25 °C条件下保存。
3. 使用无菌牙签从菌丝体中挑取一小块 M. oryzae （野生型菌株P131，敲除菌株 Δmobre2、Δmospp1 和 Δmoswd2）并置于已准备好的OTA培养皿上，在28 °C、光照条件下培养4-6天。
   注意：将培养皿倒置，以防止污染。
4. 使用1000 µL移液器向OTA培养皿中加入1000 µL液体完全培养基（CM）（0.6%酵母提取物，0.3%酶解酪蛋白水解物，0.3%酸水解酪蛋白，1%葡萄糖）....

结果

ChIP-seq 方法的完整流程图如图1所示。为验证稻瘟病菌（M. oryzae）全基因组范围内组蛋白 H3K4me3 的分布图谱，使用 H3K4me3 抗体在野生型菌株 P131 及三个分别缺失 mobre2、mospp1 和 moswd2 基因的空载体突变菌株中开展了 ChIP-seq 实验。将野生型菌株、Δmobre2、Δmospp1 和 Δmoswd2 的原生质体在 4 °C 条件下以 25% 功率进行超声处理，工作 3 秒，间歇 5 秒。随后，利用 H3K4me3 抗体和 Dynabeads protein A/G 对染色质进行免疫纯化。接着，采用酚-氯仿法提取 DNA 片段，构建测序文库，并在高通量测序平台上进行单端测序。

使用H3K4me3抗体通过ChIP-seq方法检测野生型、Δmobre2、Δmospp1和Δmoswd2菌株的代.......

讨论

近年来，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）已成为一种广泛应用的基因组分析方法，用于确定转录因子（TFs）的结合位点或特定组蛋白修饰的富集区域。与早期的ChIP-seq技术相比，新型ChIP-seq技术具有更高的灵敏度和灵活性，能够以高分辨率提供结果，且不会产生诸如核酸非特异性杂交所导致的噪声信号等负面影响。尽管这是一种常见的基因表达分析手段，已有多种计算方法得到验证，但ChIP-seq数据在噪声和变异性方面的复杂性使得该问题对ChIP-seq而言仍尤为难以克服。在数据分析方面，处理和分析ChIP-seq实验所产生的大量数据也仍是一项尚未得到充分解决的挑战。

ChIP-seq 实验包含几个关键步骤。首先，原生质体的制备非常重要，必须控制好酶解时间，以便收集高质量的原生质体。超声处理也非常关键，超声时间需要严格控制，过长或过短均会影响实验效果。其次，抗体的加入量应充足，以促进与蛋白质结合的更多DNA片段得以富集。在验证ChIP-seq实验中沉淀DNA的质量和数量时，使用了Qubit荧光计进行检测。采用Agilent 2100检测DNA的质浓度及片段分布情况，为样本是否可用于后续建库.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性酪蛋白水解物	WAKO	65072-00-6	培养基配制
琼脂粉	scientan	9002-18-0	培养基配制
脱氧胆酸	MedChemExpress	83-44-3	蛋白质及溶解
DNA末端修复试剂盒	NovoBiotec	ER81050	修复由酶切或机械剪切导致的DNA或cDNA损伤
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	靶标结合
EB缓冲液	JIMEI	JC2174	膜与液体
EDTA	ThermoFisher	AM9912	蛋白酶抑制剂
酶解酪蛋白水解物	Sigma	91079-40-2	培养基配制
葡萄糖	Sigma	50-99-7	培养基配制
糖原	ThermoFisher	AM9510	沉淀作用
H3K4me3抗体	Abcam	ab8580	针对H3K4me3蛋白的免疫反应
illumina基因组分析仪	illumina	illumina Hiseq 2000	大型配置
Illumina PCR引物	illumina	CleanPlex	随机通用引物
异戊醇	chemical book	30899-19-5	纯化DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	特异性去除RNA
溶菌酶	Sigma	L1412-10G	细胞裂解缓冲液
小鼠IgG	Yeasen	36111ES10	动物正常免疫球蛋白
NaCl溶液	ThermoFisher	7647-14-5	培养基配制
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	蛋白复合物洗脱液的配制
NP-40	ThermoFisher	85124	促进细胞裂解的细胞裂解液
PCR纯化试剂盒	Qiagen	28004	纯化步骤可从DNA样品中去除引物
蛋白酶抑制剂	ThermoFisher	A32965	降低蛋白质活性的蛋白抑制剂
蛋白酶K	ThermoFisher	AM2546	DNA提取试剂
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	培养基配制
RIPA缓冲液	ThermoFisher	9806S	细胞裂解缓冲液
RNase A	ThermoFisher	AM2271	纯化DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	掩盖电荷差异
乙酸钠溶液	ThermoFisher	R1181	乙酸缓冲液
脱氧胆酸钠	ThermoFisher	89904	抑制蛋白酶降解
T4 DNA连接酶	ThermoFisher	EL0011	在ATP作为辅酶的条件下，DNA连接酶
T4 DNA连接酶缓冲液	ThermoFisher	B69	DNA连接酶缓冲液
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	缓冲作用
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	保持膜蛋白稳定
酵母提取物	OXOID	LP0021	培养基配制