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使用荧光染料罗丹明B研究雄性交配竞争力 埃及伊蚊 蚊子

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DOI：

10.3791/62432

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2021年5月7日

 ,  ,  , 
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用荧光染料作为标记物研究埃及伊蚊（Aedes aegypti）雄蚊交配竞争力的实验方案。将雌蚊与标记雄蚊和未标记雄蚊共同暴露以进行交配，交配后在荧光显微镜下观察其受精囊，以确定其交配对象。

摘要

基于不育或不相容昆虫技术的种群压制项目的成功，取决于释放的雄性个体与野生型雌性交配并使目标种群产生不育后代的能力。因此，在野外释放前，对释放品系雄虫交配竞争能力的实验室评估对于评价其适合度至关重要。传统上，该检测方法是将雌虫同时暴露于两组雄虫（野生型与待释放品系）进行交配，随后通过测定雌虫所产卵中可孵化卵的比例来评估。然而，由于需要先对雌虫进行血液饲喂以促使其产卵，再孵化并计数孵化出的幼虫以确定卵的存活率，该过程耗时且劳动强度大。 

此外，该方法无法区分两种不育个体之间的竞争程度 Wolbachia-感染蚊株的野生型雌蚊与两者交配后仅产生无法孵化的卵。为克服这些局限，本文描述了一种更直接的方法，可在实验室条件下利用荧光染料罗丹明B（rhodamine B, RhB）标记雄蚊，通过将RhB加入蔗糖溶液饲喂雄蚊，从而实现个体标记。交配实验结束后，通过检测雌蚊受精囊中是否存在荧光精子，即可确定其交配对象。该方法成本低廉，可将实验时间缩短90%，并可用于比较两种不育雄蚊之间的交配适合度 Wolbachia-感染的品系。 

引言

目前，饲养并释放不育或不相容雄性个体以抑制Aedes蚊虫种群的方法正在野外进行评估，作为一种新型工具用于预防登革热及其他由Aedes传播的疾病暴发1。当前处于 田间试验阶段 的雄性释放抑制策略包括使用遗传学方法2、辐射处理（昆虫不育技术，SIT）3、内共生细菌Wolbachia（昆虫不相容技术，IIT）4，或后两种技术的联合应用5,6。这些方法的成功在很大程度上依赖于所释放雄性个体与野生型雄性竞争并主动寻找雌性完成交配的能力。否则，无法在目标种群中诱导不育效应。 

例如，在经典的昆虫不育技术（SIT）项目中，雄性昆虫的交配适合度可能受到辐照剂量7,8,9、大规模饲养方案以及种群近交程度10,11,12,13,14等因素的影响。此外，关于交配竞争能力的研究可为蚊虫交配行为提供重要知识，进而为媒介控制策略的制定提供依据。   

在SIT和IIT中，雄性蚊子的交配竞争力通常通过让野生型和释放品系竞争交配来评估  笼中的野生型雌性个体8,11,15,16雌性蚊子随后进行血液饲喂，并孵化其产下的卵以测定卵的孵化率。产下不可孵化卵或孵化率低的雌蚊被认为与释放品系的雄蚊交配，而产下可孵化卵的雌蚊则被认为与野生型雄蚊交配。随后通过弗里德指数（Fried Index）计算交配竞争能力。17不幸的是，该方法耗时耗力，且总体弗里德指数可能受到外部混杂因素的影响，这些因素会影响卵子的存活能力，例如  不当的卵处理和过度干燥可能导致亲和性杂交中的孵化率降低，进而导致弗里德指数（Fried Index）被人为低估。 

 此外，该方法无法对交配竞争力进行直接比较 伊蚊 感染了不同菌株的蚊子 Wolbachia 或暴露于不同剂量辐射的样本。因此，需要一种更直接的方法来应对这些挑战。近期研究18,19 已证明使用荧光染料 RhB 标记雄蚊精液的有效性。标记后的精液在成功交配后会转移并储存于雌蚊的受精囊中，从而可直接测量雌蚊与标记雄蚊的交配行为。罗丹明 B（Rhodamine B）是一种巯基反应性荧光素染料，常作为生物标记物用于包括昆虫在内的动物生态学与行为学研究。在蚊虫研究中，RhB 通过将溶解的 RhB 粉末混入糖水或蜂蜜水中饲喂的方式引入蚊体。18,19,21,22,23,24染料罗丹明B被吸收后，会与蛋白质结合，使组织呈现粉红色，并在荧光光源下发出明亮的橙色荧光。 

强烈的荧光信号和标记的稳定性，加上其对昆虫精液的染色能力，使得研究人员能够监测标记的精液从标记雄虫向雌虫精子储存器官的转移，从而用于交配研究。18,19,21,24使用RhB进行雄性蚊子交配竞争能力检测不仅能够直接测量雌蚊与标记或未标记雄蚊的交配互动，而且可在24小时内获得结果，因为它省去了测定卵活力的步骤，而该过程通常需要10至14天。此外，该方法克服了雌蚊未吸血或在产卵前死亡所导致的潜在数据丢失问题。这一点尤为重要，因为在半野外试验中，使用背负式或机械吸蚊器收集交配后雌蚊时，雌蚊容易受损或死亡。为解决当前依赖雌蚊生育力评估方法的局限性，我们提出一种替代方法，即利用RhB染色直接测定雄蚊交配竞争能力。该方法简化了操作流程，缩短了  将实验时间从约两周缩短至一天，使得能够开展更多重复实验，并可比较两种释放品系的效果。本方案适用于开展基于雄蚊释放的蚊虫种群压制项目的实验室，也可用于常规  质量控制与菌株评价

方案

1. 蚊虫的饲养

  1. 在标准昆虫饲养条件下进行所有蚊虫的饲养及雄蚊交配竞争能力测定，条件为 27 ± 1 °C，相对湿度 75–80%，光周期为 12 小时光照 : 12 小时黑暗。
  2. 为便于本文所述方法中的引用，将两组竞争雄蚊分别指定为 A 组和 B 组。在标准化条件下饲养蚊虫，以确保在测定过程中对其适合度进行公平比较。将幼虫以每 2 L 水中 500 头幼虫的密度进行饲养，并自由提供粉碎的鱼饲料粉末 ad libitum。
    注：为获得代表性结果，A 组和 B 组分别为感染 Wolbachia 的 Ae. aegypti 近交系雄蚊和杂交系雄蚊。
  3. 在蛹期按性别分离雄蚊和雌蚊，并分别置于尺寸为宽 32.5 cm × 深 32.5 cm × 高 32.5 cm 的笼子中（见材料表），笼网孔径为 150 × 150，孔大小为 160 µm。所有成蚊均以 10% 蔗糖溶液维持饲养。

2. 雄蚊和雌蚊的制备

  1. 根据蛹期大小差异（雄蛹小于雌蛹）对蚊子进行雌雄分离（图1）。
  2. 对于每组蚊子（A组或B组），将100只雄蛹分别转移至预先标记的笼子中，用于蔗糖喂养或RhB-蔗糖喂养。
  3. 将雌蛹以每笼40至50只的小批量放入笼中。成虫羽化后，检查各笼中是否存在雄蚊。
    ​注意：成年雄蚊体型小于雌蚊，且触角更浓密、多毛（图2）。交配竞争能力测定中仅可使用未交配的雌蚊。若使用已交配过的雌蚊，将导致所有实验结果无效。因此，在蛹期进行性别分离时必须格外小心。凡混入雄蚊的雌蚊笼，其内的雌蚊不得使用。应额外准备若干雌蚊笼备用。

3. 0.2% 罗丹明B-蔗糖溶液的制备

注意：RhB 干燥状态下为绿色粉末，溶液中呈粉红色。操作该化学品时应穿戴标准个人防护装备（PPE：实验室防护服、丁腈手套和眼部防护具）。为避免吸入，应在通风橱内称量 RhB 粉末。

  1. 配制0.2% w/v的RhB-蔗糖溶液：每100 mL 10% w/v蔗糖溶液中溶解200 mg的RhB粉末，充分混匀以确保所有粉末完全溶解。
    注意：由于RhB对光敏感，应使用棕色瓶，或用铝箔完全包裹透明瓶。

4. 雄性蚊子的饲喂

注意：RhB-蔗糖饲喂优化的数据见补充材料，第1部分。

  1. 准备20个带灯芯的糖饲瓶。在其中10个饲瓶中加入10 mL 10%蔗糖溶液，在另外10个饲瓶中加入10 mL 0.2% 罗丹明B-蔗糖溶液（使用棕色瓶或用铝箔包裹瓶子）。
  2. 将饲瓶分别放入步骤2.2和2.3中准备好的雄蚊笼中（每笼5个饲瓶）。在交配实验前，让雄蚊自由摄食三天。

5. 检测雄性蚊虫中的RhB荧光

  1. 吸取喂食过RhB-蔗糖的雄蚊，置于荧光体视显微镜下观察，确保所有喂食RhB-蔗糖的雄蚊均被成功标记上RhB。
  2. 打开汞灯光源和体视显微镜，让汞灯光源稳定10分钟。设置红色荧光蛋白1（RFP1）的荧光滤光片（激发波长540 nm，发射波长625 nm）。
  3. 每次用口吸管的玻璃管吸取少量蚊虫（四至五只），通过玻璃管在荧光体视显微镜下观察雄蚊虫体。排除未被RhB标记的雄蚊虫。
    注意：被RhB标记的雄蚊在白光下腹部呈粉红色（图3A），在荧光下发出明亮的橙色荧光（图3B）。
  4. 将A组雄蚊分别放入12个覆有网纱（网孔尺寸150 × 150，孔径160 µm）的纸杯中；其中6个纸杯各放入10只喂食蔗糖的雄蚊，另6个纸杯各放入10只喂食RhB-蔗糖的雄蚊。对B组雄蚊重复此步骤。

6. 交配竞争能力检测

  1. 为交配实验准备12个尺寸为60 cm × 60 cm × 60 cm、网孔大小为44 × 32、孔径650 µm的笼子。在其中六个笼子中，各放入10只A组（RhB标记）雄蚊、10只B组（未标记）雄蚊和10只未交配的野生型雌蚊。在另外六个笼子中，各放入10只A组（未标记）雄蚊、10只B组（RhB标记）雄蚊和10只未交配的野生型雌蚊。对这些笼子进行明确标记，以区分两种交配组合。
    注：根据经验，交配实验采用60 cm × 60 cm × 60 cm的笼子，较小的笼子可能促进混合交配。
  2. 按照步骤6.1中的标签，将步骤5.4中准备好的相应雄蚊杯放入交配笼中。移除网罩，并轻轻敲击纸杯，使雄蚊从杯中逸出。小心地将纸杯和网罩从笼中取出，确保无蚊子逃逸。让雄蚊在交配笼中适应至少1小时。
  3. 使用口吸器将未交配的野生型雌蚊转移至12个纸杯中，每杯10只蚊子。
  4. 在雄蚊适应期结束后，将每杯雌蚊分别放入每个交配笼中，并移除网罩。轻轻晃动纸杯，促使残留的雌蚊完全离开纸杯。小心地将纸杯和网罩从笼中取出，确保无蚊子逃逸。
  5. 让蚊子自由交配3小时。
    注：推荐的交配时长是基于对野生型Ae. aegypti的前期观察结果确定的。在将10只雌蚊和20只雄蚊置于60 cm × 60 cm × 60 cm笼子的实验中，3小时内可实现90%的雌蚊受精率（补充材料，第2节）。在此期间不得扰动笼子，因为扰动可能导致交配中断或混合交配。混合交配（即雌蚊与标记和未标记雄蚊均发生交配）会导致偏向RhB标记雄蚊的结果偏差，因为在荧光显微镜下难以区分未标记精子与RhB标记精子。
  6. 为终止交配实验，使用机械吸蚊器将每个笼子中的所有蚊子取出。将蚊子置于冰上冷麻醉至少5分钟。待蚊子完全麻醉后，轻柔地挑出雌蚊，并将其放入用网罩（网孔大小150 × 150，孔径160 µm）密封的独立纸杯中饲养。通过将交配笼上的标签转移至纸杯上，对纸杯进行标记。
    注：实验可在此处暂停，并以10%蔗糖溶液维持雌蚊存活。RhB标记的精液在雌蚊受精囊内至少可稳定保存一周。在解剖前最好保持雌蚊存活，因为死亡和脱水的标本难以进行解剖操作。
  7. 为评估雌蚊受精囊状态，解剖前先将雌蚊置于冰上冷麻醉至少5分钟，并在体视显微镜下进行解剖（视频1）。在光学显微镜（放大倍数100倍）下检查受精囊的受精情况（图4）。对于已受精个体，使用配备RFP1滤光片和相机成像系统的荧光体视显微镜观察其受精囊中是否含有RhB标记的精液。
    ​注：当使用配备成像系统的荧光体视显微镜时，建议采用较长的曝光时间（5秒），以提高检测灵敏度。若雌蚊与标记雄蚊交配，其受精囊将呈现明亮的橙色荧光（图5A）；若雌蚊与未标记雄蚊交配，则其已受精的受精囊不会产生荧光（图5B）。

7. 罗丹明B废液的处理

  1. 排放罗丹明B（RhB）废水前，需先用活性炭处理25，作为普通废水处置。固体RhB废物（标记有RhB的蚊虫、沾有RhB的纸巾和灯芯）应作为化学废物处理。处理RhB废物时，须穿戴标准个人防护装备（PPE）。

结果

wAlbB-SG 是一种在局部地区（新加坡）稳定感染了 Wolbachia wAlbB 菌株的埃及伊蚊（Ae. aegypti）品系。根据本文所述实验方案，我们评估了近交系与远交系 wAlbB-SG 雄蚊的交配竞争能力，以确定近交是否会导致雄蚊交配适合度的下降。近交系已在昆虫饲养室中连续维持了11代，而远交系则是通过将该品系雌蚊与野生型雄性埃及伊蚊回交而获得。实验中将来自近交系和远交系的雄蚊共同竞争与野生型雌性埃及伊蚊（Ae. aegypti）交配的机会。交配竞争能力测定实验设置了三个重复。

结果表明，RhB 不影响雄性的交配适合度，因为雌性受精数据并未偏向或不利于与摄取 RhB-蔗糖的雄性交配（表 1 和 图 6）。由于 RhB 不影响雄性的交配适合度，我们继续根据与近交系或远交系雄性交配的受精雌性百分比来分析数据（表 2 和 图 7）。三次实验重复的结果一致；在所有三个重复实验中，与远交雄性交配的雌性比例显著高于与近交雄性交配的雌性比例（P ≤ 0.05，Mann-Whitney U 检验）。这些结果提示，在实验室条件下经过多代近交后，雄性交配适合度可能存在潜在下降。

昆虫幼虫比较；水中雄性和雌性库蚊，昆虫学研究。
图1：Aedes aegypti 雄性（左）和雌性（右）蛹的侧面观。在相同饲养条件下，可根据体型在蛹期对埃及伊蚊（Ae. aegypti）进行性别鉴定；雄性显著小于雌性。请点击此处查看此图的放大版本。

蚊子解剖结构示意图，红色箭头标示触角和喙的特征。
图 2：Aedes aegypti 成虫雌（右）雄（左）个体的区分。 成年雄蚊（左）的触角比雌蚊更浓密多毛；红色箭头指示触角位置。请点击此处查看该图的放大版本。

蚊虫成像；荧光显微镜突出显示解剖结构；比较分析。
图3：雄性蚊虫的罗丹明B标记。（A）明场显微镜图像；（B）荧光显微镜图像。左侧蚊虫未标记（饲喂10% w/v 蔗糖），右侧蚊虫已标记（饲喂0.2% RhB-蔗糖）。在白光下，标记蚊虫的腹部呈可见的粉红色（A中右侧蚊虫），在荧光显微镜下则发出明亮的橙色荧光（B）。比例尺 = 5 mm。缩写：RhB = Rhodamine B。请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜下显示已受精与未受精细胞；标签指示细胞状态。
图 4：在复合光学显微镜下（100倍放大）观察雌性蚊子的已受精与未受精受精囊。 通过在复合光学显微镜下观察雌性蚊子的受精囊，可确定其受精状态。已受精的雌性蚊子至少含有一个充满精子的受精囊，而未受精雌性蚊子的三个受精囊均为空。在复合光学显微镜下，可见充满精子的受精囊内有丝状、可运动的精子。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞簇的显微镜图像；放大倍数100 μm；细胞分化分析。
图5：在荧光体视显微镜下观察到的雌性蚊子受精囊内含有精液成分。 （A）经RhB标记的以及（B）未标记的受精囊，在接受RhB标记的精液后，在荧光显微镜下呈现明亮的橙色荧光。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

通过散点图 A 和 B 分析蚊子交配成功率，数据来自多次实验重复。
图 6：近交系雄蚊与杂交雄蚊在三次重复实验中使野生型雌蚊受精的数量，采用互换标记方式。 （A）近交系雄蚊用 RhB 标记，杂交雄蚊未标记。（B）杂交雄蚊用 RhB 标记，近交系雄蚊未标记。无论标记状态如何，观察到与杂交雄蚊交配的雌蚊数量更多。请点击此处查看此图的放大版本。

蚊子交配成功率；柱状图；近交与远交；统计比较；昆虫行为研究。
图7：三次实验重复中，与近交或远交雄蚊交配的雌蚊受精比例。 在每次实验重复中，与远交雄蚊交配的雌蚊比例显著更高（P ≤ 0.05，Mann-Whitney U检验）。请点击此处查看该图的高清版本。

视频 1：在体视显微镜下解剖雌性Aedes aegypti以获取储精囊。 请点击此处下载该视频。

♀ × 近交系 (RhB) ♂ a♀ × 杂交 (无标记) ♂ b♀ × 近交系 (无标记) ♂ c♀ × 杂交 (RhB) ♂ d总体受精率
(a+b+c+d/120)
重复1113574077.5% (93/120)
重复262983161.7% (74/120)
重复363663367.5% (81/120)

表1：与RhB标记和未标记的wAlbB-Sg Aedes aegypti近交和远交雄蚊交配的雌蚊数量。 每个重复实验共使用120只雌蚊。

已交配雌性百分比
近交系雄性远交系雄性
重复实验 119% (18/93)81% (75/93)
重复实验 219% (14/74)81% (60/74)
重复实验 315% (12/81)85% (69/81)

表2：与wAlbB-Sg 埃及伊蚊近交系和远交系雄蚊交配的已授精雌蚊百分比。

补充图 S1：基于 RhB 的交配竞争能力检测与传统交配竞争能力检测的工作流程比较。 与传统的交配竞争能力检测相比，基于 RhB 的交配竞争能力检测流程更简化、耗时更短，显著缩短了实验周期。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：成年雄性 Kaplan-Meier 生存曲线 埃及伊蚊 喂食0.2%和0.4%罗丹明B期间及之后-蔗糖饲喂。 （存活率百分比A）雄性野生型和（B) wAlbB-Sg 埃及伊蚊 在摄取0.2%和0.4% RhB-蔗糖的三天期间及之后，与仅摄取蔗糖的对照组相比。 请点击此处下载该文件。

补充表 S1：在 60 cm（宽）× 60 cm（深）× 60 cm（高）的笼子中，雌性果蝇在 1 小时、2 小时和 3 小时时段的受精率（雌雄比为 10:20）。 请点击此处下载该表格。

讨论

标记技术在昆虫学研究中被广泛用于研究昆虫种群动态、扩散、行为及交配生物学26。在昆虫不育技术（SIT）和昆虫不相容技术（IIT）项目中，通过标记可区分释放品系与野外种群，以研究其扩散情况并优化释放比例。所采用的标记方法包括遗传标记27,28、在幼虫食物中添加同位素29,30、荧光粉31以及染料标记32。在利用SIT或IIT抑制蚊虫种群的研究中，雄蚊交配适合度是关键因素，荧光染料已被用作标记物来研究蚊虫的交配生物学18,19。

传统上，释放品系雄性交配竞争力的评估依赖于雌性生育力检测。然而，由于交配后一系列后续实验操作（补充图S1），该检测耗时且劳动强度大。这些操作包括对雌蚊进行血液饲喂、收集卵、卵的孵化，以及统计孵化卵的比例以确定卵的存活率。平均而言，从设置竞争力检测笼开始，到最终确定雄性交配竞争力，该检测需要约30个人工工时和两周的实验工作。

本文介绍了使用荧光染料RhB（以0.2% RhB-蔗糖溶液喂饲蚊虫）的方法， 补充图 S2) 直接测量雌性与RhB标记雄性之间的交配互作。尽管该方案需要使用荧光体视显微镜，但避免了上述耗时的实验操作。平均而言，基于RhB的检测方法约需10个人工小时和一天时间即可获得与雌性生育力检测相当的数据。 >90%的时间节省使研究人员能够进行多次实验重复，从而更可靠地验证雄性交配适合度。此外，该检测方法还可用于比较两种不育或感染沃尔巴克氏体（Wolbachia）的个体之间的交配竞争能力。  蚊子品系。

这种比较在传统的雌性生育力检测中是不可能实现的，因为雌性与这两种品系交配后均会产生无法存活的卵。  尽管如此，实验中任何混合交配都会导致对标记种群的偏倚，因为在同时含有RhB标记和未标记雄蚊精液的雌蚊受精囊中，难以识别未标记的精子。在一项利用RhB评估冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）交配竞争能力的研究中也得出了类似的结论18，该研究发现交配试验中有更高比例的雌蚊与标记雄蚊成功交配。由于先前交配过程中断的雌蚊更可能发生多次交配（多雄交配）33，本研究通过在较大体积的笼子（0.216 m3）中使用较少数量的蚊虫（20只雄蚊与10只雌蚊）来降低这种情况发生的概率。

结果未显示对RhB标记种群的偏好，表明混合交配受到限制。综上所述，在交配竞争性实验中使用RhB标记雄性，是一种评估雄性交配适合度的经济且快速的方法。该方法还可实现对经不同剂量辐照处理、不同饲养条件饲养或感染不同沃尔巴克氏体（Wolbachia）菌株的雄性之间交配竞争性的直接比较，因此对于任何基于雄性释放的蚊虫种群压制项目中的雄性交配适合度评估而言，是一种有价值的工具。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由新加坡国家环境局（NEA）资助。我们感谢公共健康副首席执行官、国家环境局的Chew Ming Fai先生批准发表本研究，以及国家环境局环境健康研究所组总监Ng Lee Ching副教授对本研究的支持。我们还感谢Sim Shuzhen博士和Tan Denise博士对稿件的校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
复合光学显微镜OlympusCX23用于评估受精囊的授精情况
解剖镊BioquipRubis 镊子 (4524)
带 RFP1 滤光片的荧光体视显微镜OlympusSZX16用于检测罗丹明 B 荧光信号
蚊虫饲养笼Bugdorm4F3030宽 32.5 cm × 深 32.5 cm × 高 32.5 cm；网孔规格 150 × 150；孔径 160 µm；用于交配实验前饲养雄性和雌性成蚊
6M610宽 60 cm × 深 60 cm × 高 60 cm；网孔规格 44 × 32；孔径 650 µm
用于交配竞争能力实验
蚊帐网纱150 × 150，孔径 160 µm
罗丹明 BSigma AldrichR6626≥95%（HPLC）
体视显微镜OlympusSZ61用于受精囊解剖
蔗糖MP BiomedicalsSKU 029047138食品级
热带鱼饲料薄片（TetraMin）Tetra77101用于幼虫饲养的鱼饲料

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