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通过组织透明化、免疫染色、共聚焦及光片荧光显微镜技术实现HIV感染组织中免疫细胞群体的三维可视化

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DOI：

10.3791/62441

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2021年5月6日

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1Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Medicine, University of California San Diego

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

组织透明化技术结合免疫荧光显微镜，可实现对完整组织内免疫细胞群体及病毒蛋白的空间可视化与定量分析。利用共聚焦显微镜和光片荧光显微镜对透明化组织进行光学切片，能够构建复杂组织环境的三维模型，并揭示HIV感染过程中呈现的空间异质性。

摘要

人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子，是全球主要的公共卫生问题，全球感染者近4000万人，且尚无广泛可及的治愈手段。尽管已开展大量研究，但对于感染期间及治疗过程中病毒与宿主细胞在组织内的相互作用，仍缺乏全面深入的理解。为克服这些局限，研究人员应用基于水的组织透明化技术CUBIC（透明、无阻碍的大脑/全身成像鸡尾酒法及计算分析）和CLARITY（透明脂质交换的丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/in situ杂交兼容组织水凝胶技术），结合共聚焦显微镜和光片荧光显微镜，对来自动物模型和人类的HIV感染组织中复杂的病毒-宿主细胞相互作用进行可视化观察。通过对完整组织进行光学切片并进行图像分析，可快速重建整个组织中包含的空间信息，并量化感染过程中的免疫细胞群体。这些方法适用于大多数组织来源及多种生物学问题，包括传染病和癌症研究。

引言

生物研究中对定量空间组织成像日益增长的需求，促使组织透明化技术应运而生，以实现对完整组织进行单细胞分辨率的大体积（mm3-cm3）成像。组织包含具有独特结构、组成和功能的复杂生物分子体系。然而，当通过光学显微镜成像时，组织中存在的许多生物分子（例如脂质和发色团）会散射、吸收或发射光线，从而使得大体积成像变得困难。此外，组织通常表现出与标准成像介质和光学镜头不匹配的折射率，导致成像过程中出现光学畸变。使用光学显微镜对大体积组织进行成像的理想方法应包括匹配组织、成像介质和物镜的折射率，同时允许光线深入组织内部穿透，且在处理过程中不破坏完整组织的生物学特征。19世纪末，德国解剖学家Werner Spalteholz首次尝试通过透明化不透明的组织样本来减小组织与成像介质之间的折射率差异1。该组织透明化技术使用了强化学溶剂，可能对组织样本造成损伤，但仍是首次报道的大体积完整组织成像。现代光学显微镜技术结合强大的计算能力用于图像采集与分析，使组织透明化技术重新成为实现大体积完整组织样本单细胞分辨率成像的热门方法。在过去二十年中，数十种先进的组织透明化技术相继出现，包括基于有机溶剂和基于水的各类方法，每种方法在特定应用中各有优缺点。

三维组织成像能够探测在细胞培养中无法重现的更复杂的生物学相互作用。例如，以往已利用全组织/器官成像方法对细胞信号传导模式2、不同类型细胞的空间分布3以及脑连接性4进行了定量绘制。本文描述了一种基于水的组织透明化技术的应用，用于对处于活动性感染状态的完整HIV感染淋巴组织中的不同HIV靶细胞群体进行透明化、免疫染色和可视化。在体内，HIV主要感染CD4+ T细胞，并将其基因组的一个拷贝整合到被感染宿主细胞的基因组中。随后，病毒会劫持被感染宿主细胞的机制进行自我复制，导致病毒扩散、宿主细胞死亡、免疫功能障碍以及长期进展为艾滋病（AIDS）。值得注意的是，被感染T细胞在组织环境与细胞培养环境中的行为存在显著差异。在体外培养的CD4+ T细胞中加入HIV后，可产生大量由HIV诱导的合胞体，其中可能包含数十个细胞核5；而在三维细胞外基质（ECM）水凝胶中培养的原代CD4+ T细胞，或来自HIV感染的人源化小鼠（hu-mice）的组织样本中，通常仅形成含有2–5个细胞核的合胞体6。理解HIV感染者体内病毒在局部细胞间传播及系统性扩散的过程可能更为复杂，涉及多种被感染细胞类型将病毒从组织运输至血管，再至新的组织，从而使游离病毒颗粒和产毒细胞能够接触大量易感淋巴细胞7。这些情况目前尚无法在细胞培养系统中重现，来自动物模型和人类的组织样本仍然是研究复杂生物体背景下病毒致病机制的重要资源。

目前的抗逆转录病毒疗法（ART）通过抑制HIV复制并阻止疾病向艾滋病进展，显著延长了HIV感染者（PWH）的寿命并提高了其生活质量。然而，ART无法清除那些静息状态、不主动产生病毒但已整合了逆转录病毒基因组的潜伏感染免疫细胞。尽管接受ART治疗的大多数个体血液中无法检测到病毒，但一旦中断治疗，病毒载量会迅速反弹，疾病进展也将继续8。由潜伏感染细胞形成的HIV潜伏库具有持久性，这是实现HIV治愈的重大障碍。HIV在组织中的储存库仍缺乏充分认识，因此在ART治疗前、治疗期间及治疗后，深入理解淋巴组织中这些储存库的特性，对于全面阐明病毒致病机制以及评估能够有效清除不主动产生病毒的潜伏感染细胞的新型治疗方法至关重要。

本文应用了两种先前已优化的基于水的组织透明化技术——CUBIC3 和 CLARITY9，用于成像人免疫系统重建的 HIV 感染小鼠（hu-mice）、SIV/SHIV 感染的非人灵长类动物（NHP）以及 HIV 感染者体内多个完整的淋巴组织中的免疫细胞群体。根据成像目标（更高分辨率或更大成像体积）及可用仪器，这些技术可适配共聚焦显微镜或光片荧光显微镜。尽管光学显微镜无法分辨单个病毒颗粒，但通过免疫荧光染色可识别含有病毒及产毒细胞的组织区域，进而利用更高分辨率的方法进行深入分析。本文所述方法可被调整用于以单细胞分辨率可视化体内几乎所有组织，从而量化不同感染状态下特定细胞类型之间的空间关系，并可便捷地推广至与临床高度相关的患者样本，用于传染病或癌症的研究。

方案

所有动物实验均根据批准的机构动物护理方案进行。所有人源组织均根据批准的机构人类研究伦理指南获取。

1. 组织采集与固定（CUBIC 与 CLARITY 方法通用）

  1. 按照先前所述方法识别并解剖淋巴组织10。
  2. 在动物死亡后数分钟内，尽可能安全地使用解剖剪和镊子切除淋巴组织。
  3. 将组织样本放入新配制的冰冻固定液缓冲液中，缓冲液含8%多聚甲醛（PFA）、5%蔗糖和0.1 M三水合二甲胂酸钠，以充分保存组织样本，适用于光镜（LM）、电镜（EM）或免疫电镜（immuno-EM）检测。或者，可使用含4% PFA的0.1 M PBS缓冲液固定样本用于光镜检测。在开始透明化处理前，需将样本固定过夜，以确保病毒完全失活。
    警告：多聚甲醛经皮肤接触或吸入有毒，且为易燃固体；操作时应小心，并存放于易燃品储存柜中。三水合二甲胂酸钠如吞咽或吸入亦有毒性。
  4. 在开始透明化处理前，先对组织拍摄参考图像。
    ​注意：在上述条件下，光镜样本可保存至少1年。若处理表达内源性荧光蛋白的样本，在后续所有步骤中均需避光操作。

2. CUBIC 组织透明化

  1. 将淋巴组织样本在无菌的 0.1 M PBS 中振荡洗涤三次，每次 15 分钟，室温操作，每次更换缓冲液以确保完全去除 PFA。
    注意：含 PFA 的液体应根据机构规定进行处理。
  2. 将淋巴组织样本浸入 CUBIC Reagent-1（参见 材料表）中，在 37 °C 条件下轻轻振荡孵育 3 天。定期拍摄参考图像，以监测脱色过程的进展。
  3. 更换 Reagent-1 后继续孵育额外 3–4 天，或直至组织脱色完全。透明化所需时间取决于组织的体积和类型。为加快组织脱色进程，建议每日更换 CUBIC Reagent-1 并使用较大体积的试剂。
  4. 用 0.1 M PBS 在室温下轻轻振荡洗涤淋巴组织样本三次，每次 30 分钟。
  5. 将淋巴组织样本浸入 CUBIC Reagent-2（参见 材料表）中，在 37 °C 条件下轻轻振荡孵育 2–7 天，或直至组织完全透明。若样本未达到完全透明，重复步骤 2.2–2.5，直至透明化不再进一步进展。定期拍摄参考图像，以监测透明化过程的进展。
  6. 用 0.1 M PBS 在室温下轻轻振荡洗涤淋巴组织样本三次，每次 30 分钟。
  7. 将样本保存于含 0.01% 体积/体积（V/V）叠氮化钠的 CUBIC Reagent-2 中，避光保存（参见 材料表）。
    注意：采用此方法样本可至少保存 6 个月。
    ​警告：叠氮化钠具有高毒性，吸入后有严重危害。建议购买浓度不超过 5% 的稀释溶液。

3. 立方样品的封闭与免疫染色

  1. 用0.1 M PBS在室温下轻轻振荡洗涤淋巴组织样本，每次30分钟，重复三次。
  2. 使用共聚焦显微镜成像时，利用组织切片矩阵将组织切成约0.5–1 mm厚的切片。进行光片荧光显微镜（LSFM）成像时，对整个组织区域进行包埋。
  3. 用 5 mL CUBIC 封闭液在 4 °C 条件下振荡孵育过夜以封闭样本（参见 材料表）。处理非人灵长类动物或人源样本时，在封闭液中使用抗人 FcR；处理小鼠样本时，使用抗小鼠 FcR。
  4. 用 5 mL 一抗孵育样品（参见 材料表) 在不含物种特异性 FcR 的封闭液中，室温振荡孵育 3 天（可选：将浓缩的抗体原液在 2,300 x g 使用前先离心5分钟，以减少聚集抗体的加入。
  5. 室温下振荡洗涤染色样本，总洗涤时间至少为 5 h，期间至少更换五次洗涤缓冲液（参见 材料表).
  6. 用二抗孵育样品（参见 材料表) 在不含物种特异性 FcR 的封闭液中，于室温下振荡孵育 3 天（可选：将抗体在 2,300 x g 使用前于室温孵育5分钟，以减少抗体聚集。
  7. 将染色样本在室温下用洗涤液振荡洗涤五次，总洗涤时间至少为5 h。
  8. 用5 mL DAPI染色液对样品进行染色（参见 材料表向每个组织样本中加入适量 DAPI 染色液，室温孵育 10 分钟。将样本置于 4 °C 避光保存，以备后续成像使用。
  9. 用洗涤液在室温下振荡洗涤淋巴组织样本，每次30分钟，重复三次。
  10. 将染色后的样本置于CUBIC Reagent-2中，在室温避光条件下浸泡过夜，然后进行样本封片。

4. CLARITY 组织透明化

  1. 用无菌的 0.1 M PBS 在室温下振荡清洗淋巴组织样本三次，每次 15 分钟，以去除 PFA。
  2. 将组织样本放入 15 mL 新配制的丙烯酰胺溶液中，在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜（参见材料表）。
    注意：未聚合的丙烯酰胺是一种强效神经毒素，可经皮肤迅速吸收。避免与皮肤接触，一旦接触应立即冲洗。
  3. 让组织样本恢复至室温。
  4. 可选：通过向丙烯酰胺溶液中通入氮气 1 分钟以去除溶解氧。注意使用低流速，避免未聚合的有毒丙烯酰胺溅出（约 1–2 个气泡/秒）。
  5. 将组织样本置于 37 °C 水浴中 1–3 小时进行聚合，每 15 分钟轻轻倒置一次。一旦观察到明显的聚合现象（如液体变黏稠、搅拌时出现Schlieren条纹或组织周围形成透明胶囊），应立即取出样本。
    注意：若丙烯酰胺溶液完全聚合，需切除样本上多余的水凝胶，然后继续后续操作步骤。
  6. 用无菌的 0.1 M PBS 在室温下轻轻振荡清洗组织样本三次，每次 30 分钟，以去除丙烯酰胺溶液。
  7. 将组织样本置于 15 mL 含 8% SDS 的 0.1 M PBS 溶液中，在 37 °C 下轻轻摇动孵育 2–5 天或更长时间以实现透明化。根据需要可定期更换 8% SDS 溶液，并使用最多 50 mL 溶液以加快透明化进程。当样本在视觉上已完全透明或不再进一步透明时，停止透明化过程。定期拍摄参考图像以监测透明化进展。
  8. 在室温下用无菌的 0.1 M PBS 轻轻振荡清洗组织样本，共清洗五次，总时长为 1 天。
  9. 将样本暂时保存于 0.1 M PBS 中（如需长期保存，可加入 0.01% 体积比 (v/v) NaN3），避光保存，直至准备进行内源性荧光成像。
  10. 将组织样本放入 5 mL 成像介质 RI-2 中（参见材料表）。在室温下避光孵育过夜，以确认透明化是否完全，再进行免疫染色。拍摄参考图像以监测组织透明度。

5. CLARITY 样本的封闭与免疫染色

注意：这些步骤与CUBIC透明化组织的封闭和免疫染色类似，但封闭液、洗涤液和染色液的配方不同。

  1. 在室温下，用 0.1 M PBS 轻轻振荡洗涤淋巴组织样本，每次 30 分钟，共洗涤三次。
  2. 若使用共聚焦显微镜成像，使用 0.5 mm 组织切片器和矩阵将组织切成约 0.5–1 mm 厚的切片；若进行光片显微成像（LSFM），则对整个组织样本进行包埋。
  3. 在 4 °C 条件下，用 5 mL CLARITY 封闭液（参见材料表）封闭样本，振荡孵育过夜。
  4. 将一抗（参见材料表）加入封闭液（不含物种特异性 FcR）中，配制成 5 mL 染色液，室温振荡孵育样本 3 天（可选：使用前在 2,300 × g 离心 5 分钟，以减少抗体聚集）。
  5. 用洗涤液在室温下振荡洗涤染色后的样本五次，总洗涤时间至少为 5 小时（参见材料表）。
  6. 将二抗（参见材料表）加入封闭液（不含物种特异性 FcR）中，配制成 5 mL 染色液，室温振荡孵育样本 3 天（可选：使用前在 2,300 × g 离心 5 分钟，以减少抗体聚集）。为缩短整体实验流程，可使用荧光染料标记的一抗，从而无需二抗孵育步骤。
  7. 用洗涤液在室温下振荡洗涤染色后的样本五次，总洗涤时间至少为 5 小时。
  8. 向每个组织样本中加入 5 mL DAPI 染色液（参见材料表），室温孵育 10 分钟。后续成像前，将样本置于 4°C 避光保存于 DAPI 染色液中。
  9. 用洗涤液在室温下振荡洗涤淋巴组织样本三次，每次 30 分钟。
  10. 将组织置于 5 mL 成像介质 RI-2（折射率 = 1.46）中，避光室温孵育过夜，再进行样本封片（参见实验步骤 6 和 7）。

6. 透明化组织样本的封片与共聚焦显微镜成像

  1. 撕下粘性硅胶隔离器一侧的保护层。
  2. 将显微镜盖玻片（22 mm × 40 mm，厚度 0.25 mm）贴附到已撕去保护层的硅胶隔离器一侧，以形成用于样品的防漏液空间。
  3. 撕下粘性硅胶隔离器另一侧的保护层。
  4. 将待成像样品置于硅胶隔离器中央，然后根据需要加入 CUBIC Reagent-2 或 Imaging Media RI-2，直至液面高度与隔离器边缘齐平。
  5. 为尽量减少硅胶隔离器内气泡的滞留，使用 EM 镊子从一侧对齐并轻轻将第二片盖玻片覆盖下去。擦去多余的液体。使用镊子背面轻轻按压样品孔周围的盖玻片，以密封粘合层。将封片后的样品水平避光保存。
    注意：样品在封片后数周至数月内均可进行成像；但成像质量通常会随时间推移而下降。
  6. 将封片好的载玻片放置于显微镜载物台上，使用白光和低倍物镜（2–10×）定位样品。
  7. 根据所选的荧光染料设置荧光采集参数。
    注意：建议分别单独采集各个荧光通道。虽然这会延长采集时间，但可减少光谱重叠和非特异性荧光信号的采集。常用的荧光染料组合包括 DAPI（450 nm）、Alexa488、Alexa594 和 Alexa647（或类似组合），以在图像采集过程中最大限度减少光谱重叠。
  8. 选择合适的放大倍数物镜以成像目标区域。对于大体积或全组织成像并实现单细胞分辨率，使用低倍物镜（2–10×）；对于透明化组织中亚细胞结构的高分辨率观察，使用高倍物镜（20–63×）。应尽可能匹配物镜、成像介质与组织的折射率，以最大限度减少图像采集过程中的光学畸变。
  9. 选择 Z 轴堆栈采集的步长。对于低倍物镜（2–10×），建议步长约为 3–5 µm，以便在多个连续的 Z 层切片中检测单个细胞的荧光信号，用于三维建模，同时减少总采集时间和文件大小。对于高倍物镜（20–63×），建议步长约为 1 µm 或更小，以最大限度减少各 Z 层切片之间亚细胞信息的丢失。
  10. 调整视野缩放，使待成像组织区域在 X 和 Y 方向上尽可能完整地显示，同时尽量减少空白区域。设定 Z 轴上下限采集坐标，以涵盖整个目标成像区域。
  11. 采集 Z 轴堆栈图像。保存并导出文件，供后续使用图像分析软件进行处理。对于某些软件套件，需将文件转换为特定格式（例如 .tiff、.ome-tiff、.jpeg 等）。可使用任何显微镜图像采集软件或开源图像分析软件（如 ImageJ/Fiji）完成格式转换。

7. 在LSFM样品室或比色皿中安装并成像样品

  1. 根据所使用的具体方案，用CUBIC Reagent-2或RI-2填充成像腔。转移液体时避免产生气泡。使用移液器去除多余的气泡。
  2. 将样品浸入成像腔中，并固定样品以限制其移动。
    注意：根据所使用的具体显微镜，可采用将样品包埋于琼脂糖中、用钩状或豪猪适配器悬挂样品、3D打印样品支架，或将样品用粘合剂固定在塑料培养皿上的方法。
  3. 将物镜置于成像溶液中，并对准样品。将安装好的样品在成像腔中静置数小时或过夜，以使比色皿中的溶液与组织充分平衡。
  4. 采集目标区域的Z轴层扫图像（图像采集步骤详见6.7–6.11）。
    ​注意：该方法可实现对体积超过1 cm3的组织进行单细胞分辨率成像。

8. 使用 Imaris 图像分析软件进行表面重建与细胞定量

注意：这些步骤专用于 Imaris 图像分析软件，但也可使用其他软件套件（例如 ImageJ/Fiji、Aivia、Arivis、Amira 等）执行类似的图像处理步骤。

  1. 使用 Imaris 文件转换器将 Z 轴堆叠图像文件转换为 Imaris 原生格式 .ims。这将加快文件转换速度，同时在打开文件后最大限度地减少转换错误和潜在的软件问题。
    注意：某些较新的 LSFMs 允许用户直接将文件保存为 .ims 格式。
  2. 将待分析的 .ims 文件拖入 Imaris 软件的 Arena 区域。通过Display Adjustment面板调整每个颜色通道的对比度或强度。单击左上角的Add New Surfaces 图标。
  3. 单击Next: Source Channel （带向右箭头的蓝色图标）。选择要构建表面的源通道。请勿更改其他参数。
  4. 单击Next: Threshold （带向右箭头的蓝色图标）。
  5. 如需调整阈值（绝对强度），请将阈值线向左或向右拖动。启用Split Touching Objects，并输入以微米为单位的平均细胞直径作为系统分割标准，以生成多个点作为各个独立表面的起始点。
    1. 请勿包含过小或过亮的荧光信号，因为它们可能代表潜在的染色或显微镜伪影。仅通过相应调整平均细胞直径，选择大小和荧光强度均合适的点。
      注意：平均细胞直径因特定组织或细胞类型而异，但通常介于 5–15 µm 之间。
  6. 单击Next: Classify Surfaces（带向右箭头的蓝色标签图标）。通过向左或向右拖动阈值线，调整要包含的表面。确保表面能够精确拟合原始荧光信号，同时将各个细胞的荧光信号彼此分离。
  7. 单击Finish: Execute All Creation Steps and Terminate the Wizard（带两个向右箭头的绿色标签图标）。表面正式构建完成。
  8. 单击左侧面板中标记为 Statistics 的第六个图标，查看细胞数量，即当前情况下所分析特定颜色通道的表面数量。
  9. 确保四个变量Number of Disconnected Components per Time Point, Number of Surfaces per Time Point, Total Number of Disconnected Component, and Total Number of Surfaces的数值相同，该数值即为该颜色通道的细胞计数。

结果

组织透明化技术涉及使用化学混合物处理保存的组织，以从组织中去除不透明的生物分子，同时维持组织结构的完整性。这些组织透明化溶液通过匹配组织与周围成像介质的折射率，以最大限度减少光学畸变，提高组织深层的信噪比，并降低背景自发荧光。在进行免疫荧光染色以及共聚焦和光片荧光显微成像之前，采用两种基于水的光学组织透明化方案——CUBIC3 和 CLARITY9，对保存的HIV/SIV感染的人源化小鼠、非人灵长类及人类组织样本进行透明化处理。

对于CUBIC透明化方案，固定后的组织先用PBS洗涤以去除固定剂，随后浸入CUBIC试剂-1中。CUBIC试剂-1是一种含氨基醇的碱性缓冲溶液，可洗脱血红素等发色团，从而实现组织的脱色与去脂（图1，顶部）。较小的组织样本（约mm3量级）经CUBIC试剂-1处理3天后即可完成脱色；而较大的组织样本（约cm3量级）或富含血红素的组织（如肝脏、脾脏或心脏）则需要更长的孵育时间与更多试剂用量（>1个月，约50 mL），并需每隔2–3天更换一次溶液。脱色完成后，组织经洗涤后转移至CUBIC试剂-2中。CUBIC试剂-2是一种含蔗糖的溶液，折射率约为1.48–1.49，与组织的折射率相匹配，从而提高光的透射率。透明化后的组织在成像前进行免疫染色，并置于CUBIC试剂-2溶液中封片，随后使用共聚焦显微镜或光片显微镜进行成像。本研究对多种不同大小和发色团浓度的人源小鼠（hu-mouse）及非人灵长类动物（NHP）组织进行了CUBIC透明化效果的成像分析（图2）。光学透明化使组织在肉眼观察下明显变得透明，可清晰看到组织“穿透”后方纸张上的网格线和文字。尽管脾脏、肝脏、骨髓和心脏等富含发色团的组织可能无法完全脱色，但仍适用于免疫染色与成像（图2和图5）。

对于CLARITY实验流程，固定后的组织首先用PBS洗涤以去除固定剂，随后在含有热引发剂的40%丙烯酰胺溶液中于4 °C孵育过夜，使组织样本中的蛋白质与丙烯酰胺单体之间形成共价键（图1，底部）。次日，将组织恢复至室温后，置于37 °C水浴中预热，启动丙烯酰胺聚合反应，迅速将样本包裹于水凝胶中。随后，样本在8% SDS溶液中处理2至5天，以去除不透明的脂质。在进行荧光染色前，样本需立即浸入CLARITY专用的折射率匹配溶液（RIMS，Imaging Media RI-2），其中含有90%非离子型密度梯度介质。对于含有大量血红素的组织，可在脱脂步骤结束后增加一步脱色处理9,11,12。本研究在同一人脾组织样本的不同切片上比较了CUBIC与CLARITY透明化方法的效果（图3）。CLARITY透明化过程会产生可见的聚丙烯酰胺凝胶包裹样本，通常在未额外添加脱色步骤的情况下，其脱色效果较CUBIC透明化差9,12。

随后，在两种方案中，均对已清除且完整的组织进行免疫染色，以检测特定的免疫细胞群体。样品经洗涤后，使用含α-FcR的试剂进行封闭，以减少非特异性抗体结合；当使用直接偶联荧光染料的一抗时，染色时间为3天。或者，样品先与未偶联的一抗孵育3天，再与偶联荧光染料的二抗孵育额外3天。组织再次洗涤后，在4 °C条件下与DAPI染料避光孵育过夜，以实现细胞核的可视化。样品经洗涤后，置于CUBIC Reagent-2中孵育24–36小时，或置于成像介质RI-2（CLARITY）中避光孵育过夜。进行共聚焦显微镜成像时，将组织置于适当的折射率匹配溶液（RIMS）中，并固定于载玻片上后成像（图4）。进行光片荧光显微镜（LSFM）成像时，样品需在成像比色皿中完全浸没于RIMS中，避光孵育过夜后再进行成像。

对完整、透明化并经免疫染色的淋巴组织进行共聚焦显微镜观察，可同时可视化多种荧光信号，包括细胞核、免疫细胞标志物以及 HIV/SIV CA（衣壳）蛋白（图5）。通过免疫细胞标志物与HIV蛋白的荧光共定位来确定病毒产生细胞。透明化并染色的HIV感染人脾组织显示多个CD3+ T细胞与HIV p24共定位，表明在完整组织区域内存在病毒产生细胞（图5A-D）。透明化并经免疫染色的SHIV感染非人灵长类动物淋巴结显示，在未检测到病毒的组织区域中CD3+ T细胞和CD68+巨噬细胞的分布情况（图5E），以及存在大量病毒产生细胞的区域（图5F）。这些结果表明，来自不同组织来源的病毒产生细胞可在同一视野中与其他细胞区分开来，并可在复杂的组织环境中检测到稀有的生物学事件。

采用共聚焦显微镜对透明化组织进行光学切片，以生成Z轴层扫图像（Z-stacks）和三维表面模型，从而揭示HIV感染过程中表现出的细胞异质性（图6）。使用Imaris软件套件将Z轴层扫图像重组为Z轴投影图像（图6A），并去除DAPI核染色通道，以便在整个组织体积中清晰显示CD3+ T细胞和HIV衣壳蛋白（p24）的荧光信号（图6B）。通过Imaris软件对Z轴投影荧光信号进行自动分割，生成重建的三维表面模型，用于在整个Z轴层扫范围内对荧光信号进行空间可视化和定量分析（图6C）。三维表面模型分析结果显示，共检测到546个CD3+ T细胞和218个表达HIV p24蛋白的细胞。综上，对透明化HIV感染淋巴组织进行免疫荧光Z轴层扫成像，可实现组织内细胞组成的三维建模，并对组织体积内的免疫细胞群体进行自动化定量分析。

对完整、透明化并经免疫染色的淋巴组织进行光片显微镜（LSFM）成像，实现了在较大体积内对免疫细胞和病毒产生细胞在淋巴组织中分布情况的免疫荧光（IF）成像（图7）。对HIV感染的人源化小鼠结肠组织进行hCD3+ T细胞和HIV p24的免疫染色，结果显示病毒产生细胞的病灶分散存在于大片未见感染迹象的组织区域中（图7A）。对一处病毒产生细胞病灶的放大观察显示，多个病毒产生细胞与潜在靶细胞紧密相邻（图7B）。利用组织自发荧光（红色雾状信号）可呈现整个组织的结构，同时可区分组织内染色强度高于自发荧光的特异性免疫细胞群体（红色椭圆所示）。对整个LSFM Z轴层扫数据集构建的三维模型展示了病毒产生细胞病灶在完整组织区域内的空间分布，从而实现了病毒产生位点相对于整体组织结构的定位映射（图7C）。令人意外的是，病毒产生细胞的病灶常常散布于大片无病毒产生证据的组织区域之间。这些结果有助于量化不同组织中病毒分布参数及感染细胞密度，并可用于分析感染不同阶段或不同治疗干预下的变化。

CUBIC 和 CLARITY 流程示意图、抗体染色、显微成像、组织透明化方法。
图 1：典型的 CUBIC 和 CLARITY 组织透明化、免疫染色与成像工作流程。 CUBIC（上）和 CLARITY（下）的透明化时间因组织的大小和类型而有较大差异。对于 CLARITY 透明化，在进行免疫染色前，需额外加入折射率匹配介质中孵育的步骤，以确认组织已完全透明。当一抗直接偶联荧光染料时，免疫染色通常需要 3 天；若需使用荧光标记的二抗，则通常需要 6 天。样品可使用共聚焦显微镜或光片显微镜（LSFM）进行成像。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠和灵长类器官样本在CUBIC透明化处理前后的对比；HIV p24抗原实验，图像比较。
图2：人源化小鼠和非人灵长类动物组织样本的CUBIC透明化处理。根据组织样本中血红素和脂质密度的不同，各类组织透明化所需时间有所差异。例如，结肠和十二指肠通常所需时间较短（约7天），而脾脏和肝脏则需要更长时间才能变得透明（约30天）。请点击此处查看该图的放大版本。

使用CUBIC和CLARITY方法在培养皿中对组织进行32天的透明化处理。
图3：人类样本上组织透明化方法的纵向比较。 CUBIC（上排）和CLARITY（下排）方法对接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者脾脏组织进行透明化处理。两种方法在第32天均能有效完成组织透明化，适用于免疫染色与成像。CUBIC方法中的脱色步骤明显降低了脾脏样本中血红素引起的自发荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用硅胶隔离器和盖玻片进行组织封片的流程示意图，用于显微镜制样。
图 4：共聚焦显微镜样品封片。 将样品置于由粘性硅胶隔离器（厚度 0.5–1 mm）隔开的两片盖玻片之间进行封片。硅胶隔离器粘附于第一片盖玻片上，组织置于腔室中央（顶部）。向腔室内加入 RIMS 溶液，直至弯月面与腔室顶部齐平或略高于顶部（左侧）。将第二片盖玻片从一侧缓慢压下，避免产生气泡（底部）。使用钝头工具沿腔室边缘轻轻刮压，使盖玻片与硅胶隔离器完全贴合（右侧）。样品随后在标准共聚焦显微镜下进行成像。请点击此处查看该图的放大版本。

显示T细胞、巨噬细胞和SHIV存在的免疫荧光显微镜图像；细胞和蛋白质分析。
图5：透明化完整人脾脏和非人灵长类动物淋巴结的共聚焦显微镜图像。（A-D）对透明化处理的HIV感染人组织进行染色，以显示HIV-1 p24（绿色）、hCD3+ T细胞（红色）和细胞核（青色）。（E）SHIV感染的非人灵长类动物在感染后8周获取的CUBIC透明化淋巴结的共聚焦Z轴切片，经免疫染色显示CD3+ T细胞（品红色）、CD68+巨噬细胞（mac/red）、SHIV p27（绿色）和细胞核（蓝色）。该视野包含T细胞、巨噬细胞及其他细胞类型，但未见SHIV产生细胞（绿色）的证据。F）同一淋巴结相邻区域的共聚焦Z轴切片，显示细胞密度和数量的差异，同时可见病毒产生的CD3+ T细胞（绿色箭头）和CD68+巨噬细胞（黄色箭头）。（G-I）来自（F）中p27染色选定区域的放大视图。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

免疫荧光显微镜，HIV p24，CD3 T细胞，DAPI染色细胞核；细胞分布分析。
图6：HIV感染的人类脾脏组织的Z层叠体积图像及三维重建表面图。（A）来自HIV感染的人类脾脏组织的600 µm × 600 µm × 100 µm Z层叠图像投影，组织经HIV-1 p24（绿色）、hCD3+ T细胞（红色）和细胞核（青色）染色。（B）同一Z投影图像，但未进行细胞核DAPI染色。（C）基于整个Z层叠体积重建的CD3（红色）和p24（绿色）荧光的三维表面模型。请点击此处查看该图的高清版本。

T细胞和HIV p24免疫荧光图像：Z切片、放大、3D模型；显微镜分析。
图7：HIV感染组织中表面体积的光片显微镜成像（LSFM）与三维重建 （A）来自HIV感染人源化小鼠结肠的Z切片图像（1,000 µm × 1,000 µm），经CD3+ T细胞（红色）和HIV p24（绿色）免疫染色。暗红色背景为组织自发荧光，而清晰的红色点状信号代表T细胞。绒毛结构可见于周边，朝向中央管腔，其中分布着多个活跃病毒产生的病灶（白色箭头），而大片区域无病毒存在。方框标示了B图中大致的兴趣区域。（B）组织局部放大图像，显示正在产生病毒的hCD3+ T细胞（黄色）与未感染的T细胞（红色）相邻。图像经旋转并切换至相邻Z切片，以在单一Z平面中展示一个p24阳性细胞聚集灶。背景中的红色自发荧光反映了整体组织结构，同时可见特异性的hCD3+ T细胞染色（红色点状信号；白色箭头）。（C）利用Imaris软件生成的完整体积（1,000 µm × 1,000 µm × 200 µm）三维表面模型，经旋转以显示肠道内不同位置的HIV感染病灶（黄色）。白色箭头指示体积内的各个独立病灶。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

应在死后迅速采集目标淋巴组织，并立即放入预冷的固定缓冲液中，以避免组织发生坏死（组织变暗或变黑），因为坏死会严重影响染色和成像效果。获取所需组织后，应立即将组织浸入冰浴的4%-8%多聚甲醛（PFA）中过夜固定，此步骤还可灭活样本中可能存在的病原体。4% PFA适用于光镜（LM）样本的固定，而8% PFA则可充分保存适用于光镜和电镜（EM）的组织。遵循上述操作，并将样本在4 °C、避光条件下保存于固定液中 ，可有效保存组织用于光镜成像达数年之久。需要注意的是，长期在固定液中储存可能导致染色伪影的产生，尤其是抗原掩蔽现象，这是由于目标蛋白与邻近蛋白发生交联，阻碍了染色抗体对表位的可及性13,14。若组织中表达有内源性荧光蛋白，在整个实验流程中应尽可能避免组织暴露于光照下。通常情况下，内源性荧光蛋白在固定后可维持荧光信号6至12个月，但不同组织样本的荧光保持时间可能存在个体差异。若因蛋白降解导致内源性荧光丧失，通常仍可通过针对目标蛋白的特异性一抗检测荧光蛋白。灌注固定是组织透明化前快速固定的另一种选择12；然而，考虑到处理如HIV等病原体时的安全问题，本方案选择组织解剖后浸入冰浴固定液的方式，以尽可能安全地制备样本。

所述基于水的透明化方案的一个优势在于，它们通常比基于有机溶剂的方案更温和，后者有时会损伤较为脆弱的组织，例如肝脏。与基于有机溶剂的透明化方案相比，基于水的透明化方案通常需要更长时间才能实现样本的完全透明（数周 vs. 数天）。CLARITY 和 CUBIC 方案可通过灌注方式在啮齿类动物体内同时对所有器官进行快速透明化处理11,12；然而，这种方法在非人灵长类动物（NHP）和人类尸体解剖中并不可行。使用 CLARITY 处理的样本通常会表现出一定程度的体积膨胀，而 CUBIC 则显示出对样本体积影响较小9。尽管通常速度更快，许多基于有机溶剂的组织透明化方案会导致组织发生收缩15，这可能使得在细胞密集型组织（如淋巴结和脾脏）中观察单个细胞或亚细胞结构变得更加困难。透明化过程中诱导的膨胀可有效提高成像分辨率，使原本在组织原始尺寸下难以观察的结构变得清晰可见。相反，组织收缩则可有效减小样本的整体尺寸，从而使无需解剖的全器官成像成为可能。CLARITY 和 CUBIC 方案的一个共同优势是，它们能够在保持组织内源性表达的荧光蛋白荧光信号的同时，兼容免疫荧光染色11,12。免疫染色可采用水相或有机相组织透明化方法进行；然而，根据个人经验，与基于有机溶剂的方案相比，基于水的方案具有更高比例的抗体兼容性。研究人员需要根据所成像的组织类型及所研究的生物学问题（例如全器官成像 vs. 特定感兴趣区域成像）来选择合适的组织透明化方法。目前尚无一种通用的组织透明化技术能够适用于所有大体积成像问题的稳健即用型分析，现有方法在不同生物学应用背景下各具优缺点。

进行抗体染色时，需要考虑多个方面。由于CLARITY样本被包埋在丙烯酰胺水凝胶中，通常需要更长的孵育时间12。抗体孵育所需时间还取决于每个样本的体积和厚度。本文所述大多数样本厚度约为2-3毫米，完全穿透染色需3天即可。若目标是成像整个小鼠脑组织，抗体孵育时间可能需要1周或更久12。选择水性或有机组织透明化方法进行免疫荧光成像时，需考虑抗体的兼容性。通常情况下，在CUBIC或CLARITY方法中，适用于细胞培养和组织的抗体成功率约为70%。无论采用水性还是有机组织透明化方法，都必须评估所用每种抗体与特定方法之间的兼容性和有效性。如本方案部分所示，CUBIC和CLARITY处理样本的免疫染色是在透明化完成后进行的。相反，某些基于有机溶剂的方案则需在透明化前完成此步骤，随后进行后固定。

组织必须完全浸没在与其折射率相匹配的成像介质中，这一点至关重要。若未做到这一点，在成像过程中将引入球面像差，并在图像采集期间扭曲所捕获的光线。在载片用于共聚焦显微镜和光片显微镜（LSFM）的样品时，必须小心去除成像介质中的所有气泡，因为气泡可能干扰光线到达或离开样品的路径。可在最终固定样品前，使用移液器手动去除气泡。对于使用共聚焦显微镜成像较厚样品的情况，可将多个硅胶垫片叠加在一起，以容纳厚度超过0.5 mm的组织。建议的一种做法是：将所有组织在显微镜上固定后，在RIMS中平衡数小时至过夜，期间不再移动样品。组织与成像介质的充分平衡，可防止折射率不匹配的溶液混合，从而避免成像过程中产生像差。需要牢记的是，在载片透明化处理后的组织样品时，并不存在一种适用于所有显微镜和所有样品的即插即用型载片方法。本方案讨论的是在特定条件下效果最佳的样品载片选项，但实际载片方法多种多样，具体选择取决于所使用的显微镜类型及研究的生物学问题。这些方法包括但不限于：将样品包埋于琼脂糖中、将样品悬挂在钩子或折射率匹配的塑料细线 上、使用豪猪适配器（porcupine adapter）、3D打印样品支架，或使用粘合剂将样品固定于塑料培养皿上。

共聚焦显微镜适用于成像体积约为 1 mm3-1 cm3 的组织。使用共聚焦显微镜时，可先用 2-10 倍物镜定位感兴趣区域，并以单细胞分辨率获取大体积或全组织的 Z 轴层扫图像。随后切换至 20-63 倍物镜，以获取特定感兴趣区域的高分辨率图像，从而获得亚细胞结构信息。成像经 CUBIC 和 CLARITY 透明化处理的组织时，最理想的物镜是专为 CLARITY/Scale 设计的物镜，其数值孔径应与组织和成像溶液的折射率精确匹配。若此类物镜不可用，则建议使用甘油或油浸物镜（例如 LD LCI Plan-Apochromat 25× 0.8 NA Imm Corr DIC M27 多介质浸入式物镜：工作距离 = 0.57 mm），而非干镜。这将最大限度减少因折射率不匹配而在图像采集过程中引入的光学畸变。20-25 倍物镜可在大体积成像与复杂组织环境中单个细胞染色细节的获取之间实现良好平衡。重要的是，大多数共聚焦显微镜配备有支持成像体积三维拼接的模块。此类图像采集方式可理想地生成包含亚细胞信息的大体积 Z 轴层扫图像。

光片荧光显微成像（LSFM）可实现对大体积组织（>1 cm3）甚至完整器官背景下特定细胞群体的三维可视化。在过去的10年中，组织透明化技术结合LSFM主要聚焦于解析啮齿类动物大脑内的神经连接；然而，近年来的应用已扩展至肿瘤转移微环境16、解剖学结构内细胞分布9,17以及病原体扩散过程18的可视化研究。与体外培养细胞相比，组织中的大多数生物学事件具有非均一性，而LSFM在可视化和量化这些事件（如病毒复制、免疫信号传导、细胞分布等）的空间组织异质性方面尤为擅长。

通过共聚焦显微镜或光片显微镜（LSFM）获取的三维数据集可利用多种图像分析平台进行后期处理。Imaris 软件套件可用于构建表面结构、生成三维动画以及细胞定量；然而，目前存在多种可用的图像分析系统，均能实现高效的图像后期处理与分析。ImageJ/Fiji 免费软件19是大多数实验室均可获取的一种颇具吸引力的替代性图像处理平台。但并不存在一种适用于所有类型图像分析与可视化的通用分析软件。如果无法通过共享设施获得，许多图像分析软件套件的价格可能极为昂贵。最后，对于 LSFM 或大面积拼接共聚焦显微镜所获得的大型三维数据集而言，数据管理是一个关键问题。这些成像平台可能产生庞大的文件（>1 Tb），需要高性能计算机工作站才能实现数据的可视化与定量分析。最终，该成像工作流程可简化对完整组织内空间分布 distinct 的细胞群体的获取与定量，并广泛适用于大多数组织来源及生物系统。

披露

作者无利益冲突需要披露。

致谢

感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校基因组生物学研究所核心设施提供共聚焦显微镜和光片荧光显微镜的使用。感谢“"The Last Gift"”队列中令人敬佩的个体提供人组织样本，该研究由以下基金资助：I147821、DA051915、AI131385 和 P30 AI036214。感谢Nancy Haigwood和Ann Hessell提供SHIV感染的非人灵长类动物组织样本。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺溶液（0.1 M PBS 中，总体积 40 mL）
40% 丙烯酰胺：4 mLBio-Rad1610144
VA-044 热引发剂：0.1 gFujifilm011-19365
CLARITY 封闭液（0.1 M PBS 中，总体积 5 mL）
胎牛血清（FBS）：200 µLAtlas BiologicalsF-0500-D
大鼠抗人或抗小鼠 FcR：50 µLMiltenyi130-092-575(mouse)/130-059-901(human)
叠氮化钠（来自储备液）：5 µLSigma71289-50G
Tween-20：5 µLFisher ScientificBP337-500
CLARITY 洗涤液（0.1 M PBS 中，总体积 50 mL）
叠氮化钠（来自储备液）：50 µLSigma71289-50G
Tween-20：50 µLFisher ScientificBP337-500
CUBIC 封闭液（0.1 M PBS 中，总体积 5 mL）
胎牛血清（FBS）：200 µLAtlas BiologicalsF-0500-D
大鼠抗人或抗小鼠 FcR：50 µLMiltenyi130-092-575(mouse)/130-059-901(human)
叠氮化钠（来自储备液）：5 µLSigma71289-50G
吐温 X-100：5 µLVWRM143-1L
CUBIC 试剂-1（0.1 M PBS 中，总体积 50 mL）
N, N, N’, N’-四(2-羟丙基)乙二胺：12.5 gAldrich122262
吐温 X-100：7.5 gVWRM143-1L
尿素：12.5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC 试剂-2（0.1 M PBS 中，总体积 50 mL）
蔗糖：25 gSigmaS1888-500G
叠氮化钠（粉末形式）：10 gSigma71289-50G
叠氮化钠储备液（去离子 H2O 中，总体积 50 mL）Sigma71289-50G
三乙醇胺：5 gSigma90270-500mL
吐温 X-100：50 µLVWRM143-1L
尿素：12.5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC 洗涤液（0.1 M PBS 中，总体积 50 mL）
叠氮化钠（来自储备液）：50 µLSigma71289-50G
吐温 X-100：50 µLVWRM143-1L
DAPI 染色液（0.5 µg/mL）
DAPI 储备液：1 µL
洗涤液：10 mL
DAPI 储备液（5 mg/mL）
DAPI 粉末：5 mgSigma-AldrichD9542-1MG
DMSO（100%）：1 mLThermoFisherD12345
成像介质 RI-2（dH2O 中）
90% HistodenzSigmaD2158-100G
0.01% 叠氮化钠Sigma71289-50G
0.02 磷酸钠缓冲液，pH 7.5 Sigma-AldrichS9638-250G
0.1% Tween-20Fisher ScientificBP337-500
一抗（封闭液中不含大鼠抗小鼠 FcR，总体积 2 mL）
山羊抗 HIV p24：10 µL（1:200）Creative DiagnosticsDPATB-H81692
小鼠抗人 CD68：10 µL（1:200）DakoM0876
兔抗人 CD3：10 µL（1:200）DakoA0452
8% SDS 溶液（0.1 M PBS 中，总体积 50 mL）
SDS 粉末：4 gSigma-AldrichL3771-500G
二抗（封闭液中不含大鼠抗小鼠 FcR，总体积 2 mL）
AlexaFluor647 标记的驴抗山羊：2 µLInvitrogenA21447
AlexaFluor594 标记的驴抗小鼠：2 µLInvitrogenA21203
AlexaFluor488 标记的驴抗兔：2 µLInvitrogenA21206

参考文献

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