本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。
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摘要
摘要
T细胞介导的免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在清除癌细胞过程中起主导作用。然而，肿瘤微环境（TME）内肿瘤抗原特异性的CD8+ T细胞的来源及其更新机制仍不明确。本实验方案采用稳定表达替代性新抗原卵清蛋白（ovalbumin, OVA）的B16F10-OVA黑色素瘤细胞系，以及T细胞受体（TCR）转基因OT-I小鼠模型，后者体内超过90%的CD8+ T细胞可特异性识别由MHC I类分子H2-Kb呈递的OVA来源肽段OVA257-264（SIINFEKL）。这些特性使得研究肿瘤发生过程中抗原特异性T细胞应答成为可能。
将该模型与肿瘤移植手术相结合，将供体的肿瘤组织移植到与肿瘤相匹配的同系受体小鼠体内，以精确追踪受体来源的免疫细胞向移植供体组织中的浸润过程，从而分析肿瘤固有及外周来源的抗原特异性CD8+ T细胞的免疫应答。研究发现，这两类细胞群之间存在动态转化。综上所述，该实验设计为精确研究肿瘤微环境中CD8+ T细胞的免疫应答提供了新方法，将为肿瘤免疫学研究带来新的启示。
引言
CD8+ T细胞介导的免疫反应在控制肿瘤生长中发挥关键作用。在肿瘤发生过程中，初始CD8+ T细胞通过MHC I类分子限制性识别抗原而被激活，随后分化为效应细胞并浸润至肿瘤组织1,2。然而，在肿瘤微环境（TME）中，持续的抗原刺激以及免疫抑制性因子的作用，促使浸润的肿瘤特异性CD8+ T细胞进入一种称为"耗竭"的低反应状态3。耗竭性T细胞（Tex）在转录和表观遗传层面均不同于急性病毒感染中产生的效应性或记忆性T细胞。这类Tex细胞的主要特征是持续高表达一系列抑制性受体，并伴随效应功能的层级性丧失。此外，耗竭性CD8+ T细胞的增殖能力受损，导致肿瘤特异性T细胞数量减少，使得TME中残存的CD8+ T细胞几乎无法提供足以抑制肿瘤进展的保护性免疫应答3。因此，维持或增强肿瘤内抗原特异性CD8+ T细胞对于抑制肿瘤至关重要。
此外，免疫检查点阻断（ICB）疗法被认为可通过增加T细胞浸润，从而提高肿瘤内T细胞数量并恢复T细胞功能，以增强对肿瘤的抑制作用。ICB治疗的广泛应用已改变了癌症治疗格局，相当一部分患者获得了持久的治疗反应4,5,6。然而，大多数患者及癌症类型对ICB治疗无应答或仅出现短暂应答。肿瘤微环境（TME）中T细胞浸润不足被认为是导致ICB耐药的潜在机制之一7,8。
多项研究已证实，在患者和小鼠模型中，肿瘤浸润性CD8+ T细胞（TILs）具有异质性9,10,11,12。已确认肿瘤组织中表达T细胞因子-1（TCF1）的一群CD8+ T细胞具有类似干细胞的特性，能够进一步分化为终末耗竭型T细胞，并在免疫检查点阻断（ICB）治疗后引发增殖爆发12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22。然而，研究已证明，在肿瘤微环境（TME）中仅存在少量抗原特异性的TCF1+CD8+ T细胞，这些细胞可在ICB治疗后产生扩增的分化子代细胞23,24,25,26。目前尚不清楚这一细胞群体数量是否足以维持细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的持续存在以控制肿瘤进展，也尚需进一步研究其是否由外周组织补充。此外，近期研究表明，预先存在的肿瘤特异性T细胞的再激活能力有限，而在抗程序性死亡蛋白1（anti-PD-1）治疗后会出现新的、此前不存在的克隆型T细胞，提示T细胞对检查点阻断的应答可能源于一组不同T细胞克隆的新迁移27。结合TME中存在旁观者型非肿瘤反应性细胞毒性T细胞亚群的发现，这些结果促使研究人员建立了肿瘤同种异体移植模型，以研究外周来源的CD8+ T细胞的作用11。
迄今为止，多种肿瘤移植模型以及免疫细胞过继性转移技术已广泛应用于肿瘤免疫学领域28。利用这些方法，可对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、外周血单个核细胞以及来源于其他组织的肿瘤反应性免疫细胞进行充分表征。然而，在研究全身性与局部抗肿瘤免疫之间的相互作用时，这些模型难以有效解析来源于外周的免疫细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用。本研究中，将肿瘤组织从供体小鼠移植至肿瘤匹配的受体小鼠，从而精确追踪受体来源免疫细胞的浸润，并同时观察供体来源细胞在肿瘤微环境中的动态变化。
本研究采用稳定表达替代性新抗原卵清蛋白（ovalbumin）的 B16F10-OVA 黑色素瘤细胞系，建立了小鼠同源性黑色素瘤模型。TCR 转基因 OT-I 小鼠体内超过 90% 的 CD8+ T 细胞可特异性识别由 MHC I 类分子 H2-Kb 呈递的 OVA 来源肽段 OVA257-264（SIINFEKL），从而可用于研究在 B16F10-OVA 肿瘤模型中产生的抗原特异性 T 细胞应答。将该模型与肿瘤移植技术相结合，可比较肿瘤固有和外周来源的抗原特异性 CD8+ T 细胞的免疫应答，揭示这两类细胞群体之间的动态转换过程。综上所述，该实验设计为精确研究肿瘤微环境（TME）中 CD8+ T 细胞的免疫应答提供了新方法，进一步阐明了肿瘤特异性 T 细胞在 TME 中的动态变化规律。
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方案
所有小鼠实验均按照第三军医大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用6至8周龄、体重为18-22 g的C57BL/6小鼠和未经处理的OT-I转基因小鼠。雄性和雌性小鼠均可使用，无需随机化或"盲法"处理。
1. 培养基与试剂的制备
- 按先前所述方法制备细胞培养基 D1029：在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
- 通过在 RPMI-1640 中添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素，制备细胞培养基 R10。
注意：培养基 D10 和 R10 在 2–4 °C 下储存时，可保持无菌和稳定至少 2 周。 - 通过在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中添加 2% FBS 和 0.01% 叠氮化钠，制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
注意：加入叠氮化钠后，FACS 缓冲液可在 2–4 °C 下保存数月。 - 将 155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于双蒸水中，配制红细胞裂解（RBL）缓冲液，并调节其 pH 至 7.3。
注意：RBL 缓冲液在室温（RT）下可稳定保存长达 3 个月。 - 通过在 PBS 中添加 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA，制备磁激活细胞分选（MACS）缓冲液。
注意：试剂溶解后，溶液应经 0.22 µm 滤膜过滤，并在无菌条件下保存。 - 制备 2,2,2-三溴乙醇工作液。
- 将 2.5 g 2,2,2-三溴乙醇溶于 5 mL 叔戊醇（2-甲基-2-丁醇）中。在 40 °C、180 rpm 条件下，于恒温振荡水浴中搅拌过夜。
- 将溶液经 0.22 µm 滤膜过滤至无菌容器中，加入双蒸水至终体积为 200 mL，并持续充分混匀，直至溶液澄清透明。
- 测定并调节溶液 pH 至 7.3。用铝箔完全包裹容器以避光，并于 4 °C 保存。
注意：2,2,2-三溴乙醇工作液的终浓度为 12.5 mg/mL。不建议配制更高浓度的溶液，因为高浓度时该物质具有刺激性。 每次使用前应检测工作液的 pH 值，若 pH 低于 5 则应弃用。
2. B16F10-OVA 细胞悬液的制备
注意：细胞培养应在生物安全柜中严格无菌条件下进行。
- 在37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中，用D10培养基解冻并培养一管B16F10-OVA细胞。
- 当细胞融合度达到约80-90%时，进行传代培养。
- 用移液器吸除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。
注意：冲洗贴壁细胞时，切勿将PBS直接强力冲向细胞。应将PBS沿培养瓶或培养皿的侧壁加入，或逐滴加入。 - 吸除PBS，向培养瓶或培养皿中加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动使溶液覆盖整个细胞表面。将培养瓶或培养皿置于37 °C孵育箱中约1分钟，或在室温下孵育至细胞脱落。
注意：可使用倒置显微镜观察细胞是否已完全脱落。 - 加入新鲜D10培养基以终止胰蛋白酶消化。反复吹打细胞悬液，确保所有细胞从培养瓶或培养皿表面完全解离。
- 将B16F10-OVA细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以125 × g离心5-7分钟。
- 弃去上清液，用D10培养基重悬细胞沉淀。将B16F10-OVA细胞悬液分装至含D10培养基的新培养瓶或培养皿中，在37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中继续培养。
- 用移液器吸除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。
- 在肿瘤接种当天，按照步骤2.2.1至2.2.4所述方法收获融合度约90%的B16F10-OVA细胞。弃去上清液，用1 mL PBS重悬细胞沉淀。
- 使用0.4%台盼蓝染色和血细胞计数板对活细胞进行计数。用PBS调节细胞浓度至每100 µL含1 × 106个细胞。将细胞置于冰上保存。
3. 小鼠腹股沟区域植入B16F10-OVA细胞异位肿瘤
- 使用6-8周龄、体重18-22 g的C57BL/6小鼠。雌雄均可，无需随机分组或"盲法处理"。
- 用1 mL结核菌素注射器吸取100 µL制备好的B16F10-OVA细胞悬液。轻弹针筒使气泡上浮至顶部，然后轻轻推动活塞以排除空气。
- 固定小鼠并暴露其腹部。用小指按压左后肢，以绷紧左侧腹股沟区域的皮肤。
- 使用电动剃毛器去除小鼠左下腹部的毛发。用浸有75%乙醇的棉球清洁左腹部后象限区域。
- 将注射器以极浅的角度（0-15°）持握，针尖斜面朝上，从左侧大腿上部进针，穿过皮下组织向前推进0.5-1 cm至腹股沟区域。
- 注射前回抽活塞。若出现负压，完全下压活塞，并观察皮下出现的小团液体（液体囊泡形成）。
注意：若针头内回抽出血液，应拔出针头并在另一位置重新尝试。 - 完成注射后拔出针头，并按规定妥善处理。释放小鼠并将其放回笼中。
- 在B16F10-OVA细胞植入后的第6-8天使用游标卡尺测量肿瘤大小。选择肿瘤直径约为3 mm（绿豆大小）的小鼠，并将其随机均分为两组。
注意：将肿瘤大小相近的小鼠随机分配为供体鼠和受体鼠；从供体鼠获取的匹配肿瘤组织将移植到受体鼠体内。此外，应设置未手术对照组和假手术对照组，以评估手术对过继性细胞转移及小鼠整体健康状况的影响。因此，一组荷瘤小鼠作为未手术对照组，接受CD45.1+CD45.2+或CD45.1+ OT-I细胞，但不进行手术；另一组小鼠作为假手术对照组，接受CD45.1+CD45.2+或CD45.1+ OT-I细胞，并接受与实验组相同的操作手术，但不进行异体移植。
4. 将遗传标记的OT-I T细胞过继转移至荷瘤小鼠
- 在移植前一天，通过腹腔注射的方式，向每只荷瘤小鼠注射溶于200 µL PBS中的4 mg环磷酰胺。
注意：环磷酰胺治疗旨在诱导宿主产生淋巴细胞减少症 "空间" 促进转移细胞的存活及其向淋巴器官的归巢，以实现高效功能。 - 使用具有不同同源标志物的 naïve OT-I 转基因小鼠（6–8 周龄，18–22 g，性别与荷瘤小鼠相同）。使用 CD45.1+ OT-I 小鼠和 CD45.1+CD45.2+ OT-I小鼠用于过继转移OVA257-264 分别将抗原特异性T细胞转入荷瘤的供体小鼠和受体小鼠。
注意：如果过继转移的OT-I细胞带有不同的同源标志物或荧光标记，则可轻松识别其来源。例如，可注射CD45.1+ 将OT-I T细胞注入携带B16F10-OVA的供体小鼠，同时注射CD45.1+CD45.2+ 将OT-I T细胞转入携带B16F10-OVA的受体小鼠。CD45.1 CD45.2 是泛淋巴细胞标志物 CD45（Ly5）的两种同工型之一。其他常用的同源近交系标志物还包括 CD90（Thy1）的不同同工型。本方案适用于携带不同同源近交系标志物的小鼠。为避免排斥反应，OT-I 小鼠应与接受 OT-I 细胞移植的小鼠性别相同。 - 从OT-I小鼠的脾脏和淋巴结中分离淋巴细胞。
注意：本步骤中的以下操作必须在生物安全柜中进行，以保持严格的无菌条件。- 准备两个 60 mm × 10 mm 的培养皿。在一个培养皿中加入 3 mL R10 培养基，另一个培养皿中加入 3 mL RBL 缓冲液。将一个 70 µm 尼龙细胞滤网置于含有 RBL 缓冲液的培养皿中。
- 在异氟烷麻醉舱中安乐死一只OT-I小鼠，随后进行颈椎脱位。
- 取出小鼠的脾脏、腹股沟（下腹部）和腋窝淋巴结，转移至含有3 mL R10并置于冰上的60 mm × 10 mm培养皿中。
注意：处死的OT-I小鼠数量可根据需进行细胞过继转移的荷瘤小鼠数量进行调整。典型的OT-I CD8+ 来自OT-I CD8小鼠的脾脏及双侧腹股沟和腋窝淋巴结的T细胞+ T细胞约为30-100 × 106 每只小鼠的细胞数 - 使用1 mL注射器的末端管口，通过滤网在3 mL RBL缓冲液中研磨脾脏组织。室温孵育3分钟，然后加入3 mL冷的R10培养基终止反应。
- 将淋巴结研磨至仅剩结缔组织。用 R10 冲洗滤膜。将细胞悬液转移至新的 15 mL 一次性离心管中。在 500 × g，4 °C 下离心 6 分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于3 mL MACS缓冲液中。将细胞悬液通过一个新的70 µm细胞筛网，以去除任何絮状物。
- 将细胞悬液在500 × g 4 °C下离心5分钟。倾去上清液。
- 使用小鼠 CD8+ T细胞分离试剂盒（参见 材料表) 用于纯化 CD8+ 根据制造商方案，通过阴性选择法分离T细胞。
注意：使用其他公司生产的试剂盒时，请遵循生产商提供的说明书。 - 将纯化的细胞悬液置于冰上。取少量细胞样品，与台盼蓝混合后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 确定OT-I（活/死）的百分比-CD8+Va2+通过流式细胞术检测细胞。
注意：在细胞转移前，应同时对同源标志物和转基因 TCR 进行染色，以验证细胞表型的正确性。- 加入 5 × 104-1 × 105 将细胞加入1.5 mL离心管中的1 mL FACS缓冲液中，随后以350 × g4 °C 下离心 3 分钟。
- 弃去上清液，轻轻弹击试管底部以重悬细胞。将试管置于冰上。
- 配制以下偶联抗体混合物（用100 µL FACS缓冲液稀释）：抗-CD8（1:200）、抗-TCR Vα2（1:100）、抗-CD45.1（1:200）、抗-CD45.2（1:200）以及活/死细胞染料（1:200）（参见 材料表).
- 涡旋抗体混合物，并在15,000 × g 3分钟，以沉淀抗体聚集体。将混合液置于冰上保存，并避光。
- 用100 µL抗体混合液重悬细胞，通过轻弹管壁充分混匀。置于冰上避光孵育30分钟。
注意：避免扰动管底的抗体聚集体。 - 将沉淀物用 1 mL FACS 缓冲液洗涤两次。在 350 × g4 °C 离心 3 分钟。用 200 µL FACS 缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中。
注意：为了保持待转移OT-I细胞的活性，应尽快进行检测。若染色后的OT-I细胞无法立即检测，请将细胞置于冰上避光保存，或在4 °C冷藏直至分析。 Alternatively，样品可用1-4%多聚甲醛重悬，以实现较长时间（16 h）的保存，防止细胞降解。 - 在流式细胞仪上检测样本。计算活/死细胞的百分比-CD8+Va2+ 通过活/死细胞数量的比值来计算细胞数-CD8+Vα2+ 活细胞与死细胞的数量- 细胞
- 确定OT-I细胞的绝对数量（活/死）-CD8+Va2+) 通过将活/死细胞百分比乘以-CD8+Va2+ 细胞数除以步骤 4.3.9 中获得的活细胞数量。
- 调整OT-I细胞浓度（活/死）-CD8+Va2+) 至 1.5 × 106 /mL，用PBS配制。
- 注射 3 × 105 不同的同源标记OT-I细胞（活/死）-CD8+Va2+在200 µL PBS中通过静脉注射至两组B16F10-OVA荷瘤小鼠体内（荷瘤小鼠自步骤3.8起分为供体鼠和受体鼠）。
- 吸取 200 µL OT-I 细胞（活/死-CD8+Va2+将悬液吸入一支100 U胰岛素注射器（29 G），并参照步骤3.2去除气泡。
- 将小鼠单独置于笼中，笼上放置红外灯照射5-10分钟，以扩张尾静脉。使用合适尺寸的固定装置固定小鼠。拉直尾部，并用75%乙醇喷洒，使静脉显现。
- 将注射器与静脉平行，以0-15°角插入静脉。轻轻回抽活塞，若见回血，即以不超过1 mL/min的速度缓慢而稳定地注入混悬液。
注意：注射部位出现阻力或肿胀表明针头未在静脉内；应向近端移动注射部位。 - 注射完成后，拔出注射器，轻压穿刺部位 3–5 秒以止血。将小鼠放回笼中，并密切观察数分钟，注意有无不良反应。若其活动能力正常且无鼻部分泌物，可将其放回与其他小鼠同笼饲养。
5. 从荷瘤供体小鼠中解剖肿瘤组织
注意：在第5和第6节手术过程中需保持无菌条件。每次使用前后均需通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌。在生物安全柜内，先用75%乙醇对操作区域进行消毒，再进行紫外线照射。操作时应穿戴洁净的手术服、帽子、口罩和无菌手套。
- 在过继转移后8至10天，选择携带肿瘤大小相近（约5 mm直径，如黄豆大小）的供体小鼠进行移植手术。
- 在生物安全柜中准备一个100 mm × 20 mm的培养皿，并加入10 mL无菌冰预冷的PBS。
- 将荷瘤供体小鼠置于异氟烷麻醉舱中实施安乐死，随后进行颈椎脱臼。将小鼠浸入75%乙醇中3–5分钟，然后转移至生物安全柜中。
注意：本步骤后续操作必须在生物安全柜中进行，以保持严格的无菌条件。 - 将小鼠仰卧放置在铺有洁净吸水纸的解剖板上，使用解剖针固定四肢。
- 用剪刀沿中线从尿道口上方剪至剑突。用镊子将皮肤向小鼠身体左侧拉伸，并用解剖针固定皮肤。
- 切除肿瘤时应尽可能保持其包膜完整。使用手术剪小心轻柔地去除肿瘤周围的结缔组织。
注意：为保持肿瘤完整性，切勿剥离肿瘤包膜或将肿瘤组织切成碎片。 - 将肿瘤组织置于含有10 mL无菌冰预冷PBS的100 mm × 20 mm培养皿中，以备后续移植使用。
6. 将供体来源的肿瘤皮下移植到与肿瘤匹配的受体小鼠
注意：应将同种异体移植物植入小鼠同侧下 flank 部位，使其与先前存在的肿瘤共同引流至相同的淋巴结。在本方案中，由于 B16F10-OVA 肿瘤已在第 3 步中接种于小鼠左侧腹股沟区域皮下，因此在此步骤中将供体来源的肿瘤组织移植至受体小鼠的左侧 flank 部位。移植部位可根据首次植入的肿瘤位置进行相应调整。
- 用250 mg/kg的2,2,2-三溴乙醇通过腹腔注射麻醉一只肿瘤匹配的受体小鼠。轻捏小鼠伸肌肢体的脚趾以评估麻醉程度。 等待痛觉反射消失，表明麻醉深度已达到手术要求。若观察到发声或后肢回缩反应，需追加注射 0.01−0.03 mL 的 2,2,2-三溴乙醇。
注意：肿瘤匹配的受体小鼠应与提供异体移植物的供体小鼠性别相同，以避免排斥反应问题。 - 使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥。用电剃刀剃除小鼠左侧 flank 部的毛发，随后涂抹脱毛膏以清除残留的毛发。
注意：避免擦伤皮肤，以免增加污染和感染的风险。 - 将小鼠置于生物安全柜中，使其俯卧于铺有洁净吸水纸的解剖板上，小鼠的纵轴与实验者平行，头部朝向实验者的右侧。
注意：本步骤中的以下操作必须在生物安全柜中进行，以保持严格的无菌条件。 - 用浸有聚维酮碘的棉球擦拭剃毛区域的皮肤。
注意：使用聚维酮碘代替75%乙醇进行消毒，以防止体温流失。 - 用手术镊夹起小鼠髋关节之间中点处的皮肤，用剪刀做一个长约5 mm的垂直切口，然后沿背部中线向头侧延伸切口至约10–15 mm。
- 用剪刀闭合的尖端插入切口，然后张开剪刀，将左侧腹壁的腹膜与皮肤及软组织分离，进行锐性解剖。
注意：为避免损伤皮下组织和腹膜，应提起切口中心的皮肤，然后将闭合的剪刀尽可能贴近皮肤插入。 - 在左侧 flank 处通过多次锐性分离制作皮下 pocket。将包裹完整的供体来源肿瘤组织植入 capsule 内。
注意：假手术对照组小鼠接受相同的手术操作，但不进行供体来源的肿瘤移植。 - 使用间断缝合关闭切口（参见材料列表）。放置2-3针缝线 每次切口后，用浸有聚维酮碘的棉球消毒切口周围的皮肤。
注意：连续两针之间应相距5 mm，且针距切口3 mm。 - 将小鼠置于清洁且温暖的笼子中，保持侧卧位。持续监测，直至其恢复足够的意识，能够维持胸卧位。
- 给予 术后每8小时皮下注射一次剂量为0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡，共给药三次，以缓解疼痛。密切观察小鼠的进食、饮水、活动情况及手术部位。只有在受体小鼠完全恢复后，方可将其放回与其他动物同笼饲养。
注意：小鼠通常在手术创伤后3天内恢复。如果小鼠未能恢复正常进食和活动能力，并出现任何感染迹象，应咨询兽医进行干预或实施安乐死。 - 在指定时间点处死小鼠（按步骤4.3.2实施安乐死），并回收目的细胞用于流式细胞术分析。
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结果
本方案的示意图见图1。在肿瘤接种后第8天，将CD45.1+和CD45.1+CD45.2+的OT-I细胞注射至荷B16F10-OVA肿瘤的C57BL/6小鼠体内。在细胞转移后的第8天，从植入CD45.1+ OT-I细胞的小鼠（供体）中手术分离肿瘤，并将其移植至同侧背部皮下、已植入CD45.1+CD45.2+ OT-I细胞的荷瘤小鼠（受体）体内。通过流式细胞术分析（设门策略见图2），可在肿瘤微环境（TME）中清晰识别出两群CD44+CD8+肿瘤抗原特异性T细胞，分别为来源于供体的CD45.1+细胞和来源于受体的CD45.1+CD45.2+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。随后，在指定时间点分析这两群细胞在异体移植物中的比例，以研究抗原特异性CD8+ T细胞的动态变化。...
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讨论
T细胞介导的免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在清除癌细胞过程中起主导作用。然而，肿瘤微环境中肿瘤抗原特异性CTL的来源尚未阐明30。该肿瘤移植实验方案提供了一个重要线索：尽管肿瘤内存在具有干细胞特性的TCF1+前体CD8+ T细胞，但肿瘤内抗原特异性的CD8+ T细胞可能无法长期存留。值得注意的是，外周来源的肿瘤特异性CD8+ T细胞会持续不断地浸润进入肿瘤组织。
据我们所知，这是一种相对简便且具有说服力的方法，可证实肿瘤微环境（TME）中抗原特异性CD8+ T细胞的维持主要依赖于外周来源的肿瘤特异性CD8+ T细胞的补充，而非肿瘤驻留性TIL细胞的自我更新。尽管本实验方案仅关注供体来源与受体来源TIL细胞的比例，但通过流式细胞术可方便地进一步分析这两群细胞的表型、功能及转录特征。此外，还可联合使用免疫检查点阻断（ICB）抗体，以研究特定细胞亚群对ICB治疗的响应情况。...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金杰出青年基金（编号 31825011，LY 获得）和国家自然科学基金委员会（编号 31900643，QH 获得；编号 31900656，ZW 获得）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤膜 | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL 结核菌素注射器 | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL 离心管 | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U 胰岛素注射器 | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-三溴乙醇（Avertin） | Sigma | T48402-25G | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm 尼龙细胞筛 | BD Falcon | 352350 | |
| APC 抗小鼠 CD45.1 | BioLegend | 110714 | 克隆：A20 |
| B16F10-OVA 细胞系 | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V（牛血清白蛋白） | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 小鼠抗小鼠 CD45.2 | BD Horizon | 562895 | 克隆：104 |
| 细胞培养皿 | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| 环磷酰胺 | Sigma | C0768-25G | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium） | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep 小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS 管 | BD Falcon | 352052 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCanto II | |
| 血细胞计数板 | PorLab Scientific | HM330 | |
| 异氟烷 | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒（适用于 633 或 635 nm 激发） | Life Technologies | L10199 | |
| 针头夹持器 | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| 多聚甲醛 | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE 抗小鼠 TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | 克隆：B20.1 |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓缩液） | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD8a | BioLegend | 100734 | 克隆：53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 手术镊 | RWD Life Science | F12005-10 | |
| 手术剪 | RWD Life Science | S12003-09 | |
| 缝合线 | RWD Life Science | F34004-30 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
