本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。
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摘要
摘要
T细胞介导的免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在清除癌细胞过程中起主导作用。然而，肿瘤微环境（TME）内肿瘤抗原特异性的CD8+ T细胞的来源及其更新机制仍不明确。本实验方案采用稳定表达替代性新抗原卵清蛋白（ovalbumin, OVA）的B16F10-OVA黑色素瘤细胞系，以及T细胞受体（TCR）转基因OT-I小鼠模型，后者体内超过90%的CD8+ T细胞可特异性识别由MHC I类分子H2-Kb呈递的OVA来源肽段OVA257-264（SIINFEKL）。这些特性使得研究肿瘤发生过程中抗原特异性T细胞应答成为可能。
将该模型与肿瘤移植手术相结合，将供体的肿瘤组织移植到与肿瘤相匹配的同系受体小鼠体内，以精确追踪受体来源的免疫细胞向移植供体组织中的浸润过程，从而分析肿瘤固有及外周来源的抗原特异性CD8+ T细胞的免疫应答。研究发现，这两类细胞群之间存在动态转化。综上所述，该实验设计为精确研究肿瘤微环境中CD8+ T细胞的免疫应答提供了新方法，将为肿瘤免疫学研究带来新的启示。
引言
CD8+ T细胞介导的免疫反应在控制肿瘤生长中发挥关键作用。在肿瘤发生过程中，初始CD8+ T细胞通过MHC I类分子限制性识别抗原而被激活，随后分化为效应细胞并浸润至肿瘤组织1,2。然而，在肿瘤微环境（TME）中，持续的抗原刺激以及免疫抑制性因子的作用，促使浸润的肿瘤特异性CD8+ T细胞进入一种称为"耗竭"的低反应状态3。耗竭性T细胞（Tex）在转录和表观遗传层面均不同于急性病毒感染中产生的效应性或记忆性T细胞。这类Tex细胞的主要特征是持续高表达一系列抑制性受体，并伴随效应功能的层级性丧失。此外，耗竭性CD8+ T细胞的增殖能力受损，导致肿瘤特异性T细胞数量减少，使得TME中残存的CD8+ T细胞几乎无法提供足以抑制肿瘤进展的保护性免疫应答3。因此，维持或增强肿瘤内抗原特异性CD8+ T细胞对于抑制肿瘤至关重要。
此外，免疫检查点阻断（ICB）疗法被认为可通过增加T细胞浸润，从而提高肿瘤内T细胞数量并恢复T细胞功能，以增强对肿瘤的抑制作用。ICB治疗的广泛应用已改变了癌症治疗格局，相当一部分患者获得了持久的治疗反应....
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方案
所有小鼠实验均按照第三军医大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用6至8周龄、体重为18-22 g的C57BL/6小鼠和未经处理的OT-I转基因小鼠。雄性和雌性小鼠均可使用，无需随机化或"盲法"处理。
1. 培养基与试剂的制备
- 按先前所述方法制备细胞培养基 D1029：在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
- 通过在 RPMI-1640 中添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素，制备细胞培养基 R10。
注意：培养基 D10 和 R10 在 2–4 °C 下储存时，可保持无菌和稳定至少 2 周。 - 通过在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中添加 2% FBS 和 0.01% 叠氮化钠，制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
注意：加入叠氮化钠后，FACS 缓冲液可在 2–4 °C 下保存数月。 - 将 155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于双蒸水中，配制红细胞裂解（RBL）缓冲液，并调节其 pH 至 7.3。
注意：RBL 缓冲液在室温....
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结果
本方案的示意图见图1。在肿瘤接种后第8天，将CD45.1+和CD45.1+CD45.2+的OT-I细胞注射至荷B16F10-OVA肿瘤的C57BL/6小鼠体内。在细胞转移后的第8天，从植入CD45.1+ OT-I细胞的小鼠（供体）中手术分离肿瘤，并将其移植至同侧背部皮下、已植入CD45.1+CD45.2+ OT-I细胞的荷瘤小鼠（受体）体内。通过流式细胞术分析（设门策略见图2），可在肿瘤微环境（TME）中清晰识别出两群CD44+CD8+肿瘤抗原特异性T细胞，分别为来源于供体的CD45.1+细胞和来源于受体的CD45.1+CD45.2+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。随后，在指定时间点分析这两群细胞在异体移植物中的比例，以研究抗原特异性CD8+ T细胞的动态变化。.......
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讨论
T细胞介导的免疫在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用，其中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在清除癌细胞过程中起主导作用。然而，肿瘤微环境中肿瘤抗原特异性CTL的来源尚未阐明30。该肿瘤移植实验方案提供了一个重要线索：尽管肿瘤内存在具有干细胞特性的TCF1+前体CD8+ T细胞，但肿瘤内抗原特异性的CD8+ T细胞可能无法长期存留。值得注意的是，外周来源的肿瘤特异性CD8+ T细胞会持续不断地浸润进入肿瘤组织。
据我们所知，这是一种相对简便且具有说服力的方法，可证实肿瘤微环境（TME）中抗原特异性CD8+ T细胞的维持主要依赖于外周来源的肿瘤特异性CD8+ T细胞的补充，而非肿瘤驻留性TIL细胞的自我更新。尽管本实验方案仅关注供体来源与受体来源TIL细胞的比例，但通过流式细胞术可方便地进一步分析这两群细胞的表型、功能及转录特征。此外，还可联合使用免疫检查点阻断（ICB）抗体，以研究特定细胞亚群对ICB治疗的响应情况。.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金杰出青年基金（编号 31825011，LY 获得）和国家自然科学基金委员会（编号 31900643，QH 获得；编号 31900656，ZW 获得）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤膜 | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL 结核菌素注射器 | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL 离心管 | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U 胰岛素注射器 | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-三溴乙醇（Avertin） | Sigma | T48402-25G | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm 尼龙细胞筛 | BD Falcon | 352350 | |
| APC 抗小鼠 CD45.1 | BioLegend | 110714 | 克隆：A20 |
| B16F10-OVA 细胞系 | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V（牛血清白蛋白） | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 小鼠抗小鼠 CD45.2 | BD Horizon | 562895 | 克隆：104 |
| 细胞培养皿 | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| 环磷酰胺 | Sigma | C0768-25G | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium） | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep 小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS 管 | BD Falcon | 352052 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCanto II | |
| 血细胞计数板 | PorLab Scientific | HM330 | |
| 异氟烷 | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒（适用于 633 或 635 nm 激发） | Life Technologies | L10199 | |
| 针头夹持器 | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| 多聚甲醛 | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE 抗小鼠 TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | 克隆：B20.1 |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓缩液） | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD8a | BioLegend | 100734 | 克隆：53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| 手术镊 | RWD Life Science | F12005-10 | |
| 手术剪 | RWD Life Science | S12003-09 | |
| 缝合线 | RWD Life Science | F34004-30 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
参考文献
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
