需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

6.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62452

⸱

2021年4月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, School of Medicine, 2Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 3Center for Critical Care Nephrology, University of Pittsburgh, School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。

摘要

由人多能干细胞（hPSCs）生成的肾类器官为肾脏组织提供了无限来源。人类肾类器官是研究肾脏疾病与损伤、开发细胞治疗手段以及测试新疗法的宝贵工具。对于这些应用，需要大量均一的类器官以及高度可重复的检测方法。我们在先前发表的肾类器官培养方案基础上进行了优化，以提高类器官的整体健康状态。该方法是一种简单且稳健的三维培养方案，首先在含有脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和聚乙烯醇，并添加GSK3抑制剂（CHIR99021）的最低成分培养基中培养3天，形成均一的拟胚体；随后转入含敲除血清替代物（KOSR）的培养基中继续培养。此外，通过振荡培养可减少拟胚体的聚集，并维持其大小均一，这对于降低类器官之间的变异性至关重要。总体而言，该方案提供了一种快速、高效且经济的方法，可用于大规模生成肾类器官。

引言

近年来，已开发出多种将人类多能干细胞分化为肾类器官的实验方案1,2,3,4,5肾脏类器官已成为研究再生医学新方法、模拟肾脏相关疾病、开展毒性研究及药物开发的重要工具。尽管其应用广泛，但肾脏类器官仍存在局限性，例如成熟度不足、长期培养能力有限等问题 体外以及人类肾脏中多种细胞类型的缺乏6,7,8近期研究工作集中在通过改进现有方案，提高类器官的成熟度、延长培养周期以及扩展肾脏细胞群体的复杂性。9,10,11,12在本方案的当前版本中5,13，我们已在方案的第一阶段将培养基成分修改为无血清基础培养基，并添加胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSE）、脂质、聚乙烯醇（E5-ILP）和 CHIR99021（图1这些改变提供了一种成分更少、完全明确、无血清且低蛋白的培养基，相较于我们之前的培养基配方更为简化。5,13 且无需添加额外的生长因子。因此，第一阶段培养基的制备比我们先前发表的版本更省时省力，并可降低批次间的差异性5先前的研究表明，胰岛素和转铁蛋白在无血清培养中均具有重要作用14,15然而，高水平的胰岛素可能抑制中胚层分化16我们保持了原始方案中提供的低胰岛素水平，并在检测的第二阶段进一步降低了KOSR（含有胰岛素）的浓度。与其他肾脏类器官形成方案一致，较低水平的KOSR有助于维持肾组织增殖与分化之间的平衡。17此外，我们已降低了第二阶段培养基中的葡萄糖浓度13.

本方法描述了一种用于肾类器官悬浮培养的实验方案，可从初始约60%融合度的人多能干细胞（hPSC）100 mm培养皿中获得多达约1,000个类器官，具体步骤详见原始文献5,13。该方案可轻松放大，起始材料可使用多个100 mm或150 mm培养皿，以进一步增加类器官数量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有使用人多能干细胞（hPSCs）的实验均遵循机构指导原则，并在II级生物安全柜中佩戴适当的个人防护装备进行。所有试剂均为细胞培养级别，除非另有说明。所有培养物均在37 °C、5% CO2的空气环境中孵育。在实验的任何阶段，均可收集类胚体或肾类器官，并进行固定或后续分析处理。用于生成本数据的hPSC细胞系均已得到充分表征并已发表18。

1. 准备培养皿

注意：在传代人多能干细胞（hPSCs）前约1小时，用经干细胞验证的基底膜基质提取物（BME）包被2个100 mm的组织培养皿。可根据生产商说明书预先包被培养皿，用石蜡膜密封后于4 °C保存。

  1. 在II级生物安全柜中准备2个100 mm组织培养处理过的培养皿（1个用于肾类器官实验，1个用于维持细胞系）以及1个15 mL锥形管。
  2. 将8 mL冷的无血清杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）分装至15 mL锥形管中，并将约4 mL分别加入每个100 mm培养皿中，使培养基足以覆盖每个培养皿底部。
  3. 从冷冻保存条件（-20 °C）中取出100 µL基底膜提取物（BME）。使用2 mL移液管从15 mL锥形管中吸取约1 mL冷DMEM，通过缓慢反复吹打使BME分装液在冷DMEM中逐渐解冻，注意避免产生气泡。
    注意：切勿将BME分装液置于室温下静置，应立即使用。
  4. 将解冻后的DMEM/BME混合液转移回含有剩余DMEM的15 mL锥形管中。使用10 mL移液管轻轻上下吹打至少8次，使BME充分稀释并均匀分散，注意避免产生气泡。
  5. 将4 mL稀释后的BME混合液分别加入含有DMEM的每个培养皿中，轻轻旋转培养皿使BME均匀分布。将包被好的培养皿在室温下孵育1小时，或在37 °C下孵育30分钟。
    注意：每100 mm培养皿使用50 µL BME。若使用其他人多能干细胞（hPSC）培养基或细胞系，可能需要调整BME的使用浓度。

2. 人多能干细胞的传代

注意：常规 hPSC 培养时，应在细胞融合度达到 70-80% 时进行传代。

  1. 吸出待传代的hPSC培养板中的培养基。向hPSC培养板中加入约8 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），轻轻晃动以洗涤细胞。
  2. 吸出DPBS，向100 mm培养板中逐滴加入2 mL温和细胞解离试剂（GCDR），覆盖整个细胞层。
    注意：也可使用其他解离试剂。请根据实际情况调整。
  3. 室温孵育约6–8分钟，直至细胞集落开始分散，且在相差显微镜下观察到细胞呈折光性（图2A）。
    注意：不同细胞系所需时间可能有所不同，请根据实际情况调整。
  4. 孵育期间，准备一个50 mL锥形管。加入16 mL hPSC培养基（每100 mm培养板8 mL），并加入Rho相关激酶抑制剂（ROCKi），使其终浓度为5 µM。
  5. 吸出BME包被板中的DMEM，每孔加入8 mL含ROCKi的hPSC培养基。
  6. 当细胞达到所需状态时（如步骤2.3所述，见图2A），吸出GCDR，将培养板向实验者方向倾斜约45°，用细胞刮铲轻轻刮下细胞。
    注意：若细胞已自行脱落，可省略吸除GCDR步骤，直接进行下一步。
  7. 将培养板旋转约90°，再次刮取以收集剩余细胞。保持培养板倾斜约45°，用10 mL移液管加入3 mL hPSC培养基冲洗细胞并收集至管中。
  8. 轻柔吹打数次以分散大块细胞团（不超过2–3次），按目标细胞系所需比例将细胞接种至预处理的培养板中。将培养板放入培养箱后，轻柔地以“8”字形移动培养板，使细胞均匀分布。
    注意：本实验中hPSC细胞系以1:5比例传代，其他细胞系或条件下比例可能不同。接种后过夜勿扰动培养板。
  9. 约24小时后，观察细胞贴壁情况，检查是否有小而独立的细胞集落贴附。吸出用过的培养基，更换为8 mL新鲜hPSC培养基（不添加ROCKi）。
  10. 继续每日观察并更换培养基，直至细胞达到约60%融合度，即可开始肾类器官诱导实验（通常在传代后48至72小时达到）。理想的细胞集落应彼此分离，不发生融合（图2B）。
    注意：为维持细胞的多能性状态，必须将融合度控制在不超过80%。过度融合的培养物、操作粗暴或高代次细胞可能导致非预期的自发分化或肾类器官形成效率降低。

3. 第0天——建立肾类器官检测体系

  1. 开始前，根据配方配制 E5-ILP 和 Stage II 培养基（见表1和表2）。
    注意：培养基可在 4 °C 下保存最多 14 天。
  2. 进行一个肾类器官实验（每 6 孔板需使用一个 100 mm 培养皿），在 50 mL 锥形管中配制完全 E5-ILP 培养基：18 mL E5-ILP 培养基中加入 8 µM CHIR99021（14.4 µL）、3.3 µM ROCKi（6 µL）和 0.1 mM β-巯基乙醇（32.7 µL）。
  3. 将 2 mL 完全 E5-ILP 培养基加入 6 孔超低吸附培养板的每个孔中。
  4. 用约 8 mL DPBS 对汇合度约为 60% 的 hPSCs 进行两次洗涤（见图2B）。吸除 DPBS 后，按每 100 mm 培养皿加入 2 mL 分散酶，逐滴加入以覆盖细胞，于 37 °C 孵育 6 分钟。
    注意：6 分钟后，细胞集落边缘开始卷起（见图2C，红色箭头），而集落其余部分仍附着于皿底。若 6 分钟后未见此现象，可将细胞放回培养箱继续孵育 30 秒。其他 hPSC 培养基或基质可能不适用于此时间参数。基于层粘连蛋白的 BME 包被与分散酶不兼容。若实验室常规使用基于层粘连蛋白的 BME 作为 hPSC 培养基质，请在第 1 节中将其中一块培养皿按本方法所述使用 BME 进行包被，用于肾类器官实验。
  5. 用约 10 mL DPBS 洗涤细胞 3 次。吸除 DPBS 后，将培养皿倾斜约 45°，用细胞刮铲轻轻刮下细胞。
    注意：分散酶未被灭活，因此必须彻底清洗去除。不得减少洗涤次数。
  6. 使用 10 mL 移液管，加入 6 mL 完全 E5-ILP 培养基从培养皿顶部将细胞集落冲洗下来。轻柔吹打数次（通常 2–3 次即可）以打散较大的细胞团块。
  7. 将细胞集落均匀分配至 6 孔板中，每孔加入 1 mL。将 6 孔板置于轨道摇床（设置参数：轨道直径 = 30，往复角度 = 330°，振动角度 = 5° - 2 秒）上，并放入 37 °C 培养箱中（见图2D）。
    ​注意：振动功能对于类器官的均匀分布及防止聚集至关重要。

4. 第2天——通过半量换液进行喂养

注意：在 48 小时内，集落簇将形成类胚体。

  1. 配制完全培养基：为一个6孔板在15 mL锥形管中配制12 mL E5-ILP培养基，并加入8 µM CHIR99021。
    注意：此步骤无需添加β-巯基乙醇和ROCKi。
  2. 让胚状体沉降至孔板底部，将孔板倾斜约45°，然后从上层缓慢吸出培养基，每孔保留约1 mL。
    注意：此阶段的胚状体会迅速聚集，沉降时间不得超过> 5分钟。
  3. 每孔加入2 mL已配制的完全培养基（第4.1节），将孔板放回摇床继续培养。

5. 第3天——将拟胚体转移至II阶段培养基

  1. 准备一个 50 mL 的锥形管和 DMEM（低糖）。让类胚体沉降到培养板底部。将培养板倾斜约 45°，缓慢从顶部吸出培养基，每孔保留约 1 mL。
  2. 使用 10 mL 血清移液管小心地从每孔中收集所有类胚体，并转移至 50 mL 锥形管中。
  3. 用约 1 mL 的 DMEM（低糖）洗涤每孔，以收集残留的类胚体，并将其加入同一 50 mL 锥形管中。
  4. 让类胚体沉降到管底，约 5 分钟。等待期间，向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 第 II 阶段培养基。使用 200 µm 细胞筛过滤掉较大的类胚体（>300 µm）（图 2E）。
    1. 取一个新的 50 mL 锥形管，将 200 µm 细胞筛置于其上方。使用 10 mL 血清移液管小心地将所有类胚体移至细胞筛上。
    2. 用额外约 5 mL 的 DMEM（低糖）冲洗细胞筛，以收集滞留在筛网上的类胚体。让类胚体沉降到锥形管底部。
  5. 当类胚体沉降后，吸去上清液，并用约 10 mL 的 DMEM（低糖）洗涤。
  6. 吸去 DMEM，将类胚体重悬于 6 mL 第 II 阶段培养基中。
  7. 将类胚体转移回 6 孔超低吸附培养板中，均匀分配至 6 个孔内。
  8. 每隔一天进行半量换液，操作如步骤 4.2 和 4.3 所述。
    ​注意：从第 3 天开始，类胚体将呈现“金黄色”且表面光滑、呈球形（图 2F）。大约从第 6 天起，单个类胚体中将开始出现小管结构，随后几天内数量逐渐增加，至第 14 天达到最佳数量和生长状态（图 2G,H)。为消除偶尔出现的聚集体，或在显微镜下观察到无小管结构的极小类胚体，可按照步骤 5.4.1 和 5.4.2 所述，使用 500 µm 和 200 µm 细胞筛分别去除 <200 µm 和大于 >500 µm 的类器官。

6. 转移至旋转烧瓶及换液

注意：从第3天开始，只要实验需要大量类器官，即可使用旋转培养瓶。我们实验室通常在第6至第8天之间进行类器官的常规传代。如果设备不可用，请参见讨论部分中的替代方案。

  1. 将拟胚体转移至含有45 mL第二阶段培养基的125 mL旋转培养瓶中。将磁力搅拌器转速设为120 rpm，并将培养瓶放入培养箱中（图2I）。
  2. 为喂养拟胚体或肾类器官，先让肾类器官在旋转培养瓶底部短暂沉降。从培养瓶一侧臂口打开瓶盖，将吸管插入瓶内，管尖轻触对侧内壁。
  3. 缓慢倾斜吸管向下，吸出约一半培养基。通过同一开口加入20 mL新鲜的第二阶段培养基以补充培养液。

7. 设置6孔磁力搅拌板（6MSP）

注意：如果需要测试多个条件，可以使用6MSP格式替代旋转瓶。在化合物或肾毒素处理时使用6MSP。这种方法可在第二阶段节省培养基用量，同时通过扩散维持营养物质的供应。

  1. 若磁力搅拌子从未使用过，用适合组织培养的洗涤剂在50 mL锥形管中短暂清洗；若 previously used，则需浸泡 > 1 h。
  2. 用无菌DPBS冲洗3次，每次短暂清洗。
  3. 用70%乙醇洗涤1次，持续5分钟，再用无菌DPBS洗涤1次。
  4. 用抗黏附溶液冲洗，并用无菌DPBS洗涤1次，然后吸除液体。
  5. 使用长柄无菌镊子小心地将一个磁力搅拌子放入每个含有拟胚体或肾类器官的6孔板孔中。
  6. 将6孔板置于6MSP装置上，设置转速为120 rpm（图2J）。按照第4.2和4.3节所述，通过半量换液方式维持肾类器官培养。
    注意：为使磁力搅拌子准确就位并开始旋转，可先将功率短暂调至100，待所有搅拌子开始旋转后，再将功率降至25。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在本方案的最新版本中，肾类器官的分化起始于一种成分明确且低蛋白的培养基中。所有实验步骤均在悬浮培养条件下完成，依赖于人多能干细胞（hPSCs）自身分化和组织构建的能力来启动肾小管形成。由一个直径100 mm、融合度约60%的hPSC培养皿起始，通常可获得500至1,000个肾类器官，如我们先前发表的研究5所示。由于能够生成大量类器官，本方案非常适用于化合物筛选。我们常规采用6孔板格式进行化合物测试，但该方案在第二阶段（第3天起）可轻松扩展至其他多孔板格式，以实现更高通量的化合物筛选。对石蜡切片进行免疫荧光染色显示，类器官中存在肾单位的不同节段，即表达肝细胞核因子-1β（HNF1B）和刀豆四棱豆凝集素（LTL）的肾小管（图3A - HNF1B, LTL），以及表达V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（MAFB）和足蛋白（nephrin, NPHS1）的足细胞簇（图3A - MAFB，图3B - NPHS1）。此外...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

先前的研究表明，初始实验方案步骤对于中胚层分化至关重要5,19,20，因此在此阶段实施严格控制的培养基成分十分必要。在实验方案的第一阶段去除未定义成分，如血清、白蛋白和无蛋白杂交瘤培养基II，可能有助于提高不同检测之间分化效率的一致性21。

肾脏细胞的代谢状态对其功能至关重要，葡萄糖水平的变化可导致代谢状态的改变22。既往研究指出，高浓度葡萄糖（高达 25 mM）可诱导内皮细胞功能障碍，并改变肾脏细胞的生长能力及氧化能力22,23,24。高浓度葡萄糖还被报道可改变线粒体功能24

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院R01 DK069403、UC2 DK126122、P30-DK079307以及美国肾脏病学会肾脏研究基金会Ben J. Lipps研究奖学金项目资助，资助对象为AP。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Thermo Fisher21-985-023
防黏附冲洗液STEMCELL Technologies7010
CHIR99021STEMCELL Technologies72054以DMSO配制为10 mM储备液
Corning 一次性旋转瓶Fisher Scientific07-201-152
Corning 超低吸附6孔板Fisher Scientific07-200-601
Corning 低速搅拌器Fisher Scientific11-495-03用于旋转瓶培养的多板磁力搅拌器
DispaseSTEMCELL Technologies7923分装后冷冻保存
DMEM，低糖，含丙酮酸，不含谷氨酰胺，不含酚红Thermo Fisher11054020
DPBS 1x，不含钙，不含镁Thermo Fisher14-190-250
卵形/椭圆形搅拌子2magPI20106
Excelta 通用镊子Fisher Scientific17-456-103在细胞培养超净台中保持无菌
EZBio 一次性培养基瓶，250 mLFoxx Life Sciences138-3211-FLS用于配制10% PVA溶液
Falcon 标准组织培养皿（100 mm）Thermo Fisher08-772E
Fisherbrand 无菌吸管，2 mLFisher Scientific14-955-135
Fisherbrand 细胞刮刀Fisher Scientific08-100-240
Fisherbrand 多功能3D旋转仪Fisher Scientific88-861-047轨道摇床
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor 基底膜基质Thermo FisherA1413302BME。在冰上分装并冷冻保存。其他合适的基质替代品包括Matrigel或Cultrex。
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies7174GCDR
GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher35-050-061L-谷氨酰胺补充剂。
HEPES (1M)Thermo Fisher15-630-080
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺Thermo Fisher51-500-056ITSE
KnockOut  血清替代物 - 多物种Thermo FisherA3181502KOSR。分装后冷冻保存
脂质混合物1，化学成分明确Millipore-SigmaL0288-100ML
MEM 非必需氨基酸溶液Thermo Fisher11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，500 mLFisher ScientificS2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，250 mLFisher ScientificS2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP 控制单元2magVMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP 微孔板搅拌驱动器2magVMF 406006MSP
MP Biomedicals  7X 清洁液Fisher ScientificMP0976670A4适用于组织培养的洗涤剂。 用水配制成5%溶液
mTeSR1STEMCELL Technologies85850人多能干细胞培养基。TeSR-E8、NutriStem XF 和 mTeSR Plus 培养基也经过测试，是合适的替代品。 
Nunc 50 mL 锥形无菌离心管Fisher Scientific12-565-270
Nunc 15 mL 锥形无菌离心管Fisher Scientific12-565-268
青霉素-链霉素Thermo Fisher15-140-122分装后冷冻保存
PlasmocinInvivogenant-mpt抗支原体试剂。 分装后冷冻保存
pluriStrainer® 200 µmFisher ScientificNC0776417细胞筛
pluriStrainer® 500 µmFisher ScientificNC0822591细胞筛
聚乙烯醇 87-90% 水解  (PVA)Millipore-SigmaP8136-250G在DPBS中配制成10%溶液，98°C搅拌至完全溶解，使用138-3211-FLS瓶配制
ROCK抑制剂 Y-27632 (ROCKi)STEMCELL Technologies72304以DPBS配制为10 mM储备液
无菌一次性移液管  - 10 mLFisher Scientific13-678-11E
无菌一次性移液管 - 25 mLFisher Scientific13-678-11
无菌一次性移液管 - 5 mLFisher Scientific13-678-12D
TeSR-E5STEMCELL Technologies5916无血清、低蛋白基础培养基，用于E5-ILP
Variomag distriBOX 2 分配器2magVMF 90512若使用多个MIXdrive时使用

参考文献

  1. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  3. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  4. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
  5. Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715(2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  8. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  9. Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
  10. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  11. Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
  12. Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
  13. Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).
  14. Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
  15. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
  16. Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
  17. Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
  18. Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
  19. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
  20. Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
  21. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  22. Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
  23. Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
  24. Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
  25. Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
  26. Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

类胚体类器官分化旋转烧瓶培养磁力搅拌板肾小管足细胞簇免疫荧光染色内皮细胞扩增
一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。