使用共聚焦显微镜研究Leishmania的吞噬作用

摘要

与吞噬作用相关的机制 利什曼原虫 感染仍知之甚少。本文中，我们描述了用于评估感染早期事件的方法 利什曼原虫 与宿主细胞的相互作用。

摘要

吞噬作用是一个有序的过程，包含识别、结合和内化等不同步骤。专业吞噬细胞通过吞噬作用摄取Leishmania寄生虫，该过程涉及宿主细胞多种受体对寄生虫表面配体的识别。Leishmania与巨噬细胞膜的结合通过补体受体1型（CR1）、补体受体3型（CR3）以及模式识别受体介导。脂磷糖苷（LPG）和63 kDa糖蛋白（gp63）是参与巨噬细胞与Leishmania相互作用的主要配体。在宿主细胞受体初步识别寄生虫配体后，寄生虫被内化，并在含虫空泡内存活和增殖。Leishmania诱导形成的空泡的成熟过程涉及从细胞内囊泡获取多种分子，包括小G蛋白Rab 5和Rab 7、溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）、溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）以及微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）。

本文介绍了利用共聚焦显微镜评估Leishmania与宿主细胞相互作用早期事件的方法，包括（i）结合、（ii）内化以及（iii）吞噬体成熟过程。通过增进对这些决定感染结局的关键因素的认识，我们希望加深对Leishmania感染发病机制的理解，并为最终寻找新的化学治疗靶点提供支持。

引言

利什曼病是一种由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的被忽视热带病，可在脊椎动物宿主中引起广泛的临床表现，包括皮肤利什曼病、黏膜皮肤利什曼病和内脏利什曼病¹。 世界卫生组织（WHO）估计，全球有超过十亿人面临感染风险，每年报告的新病例超过一百万例²。

Leishmania 属为专性胞内原虫，可在宿主细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞）内生存³。Leishmania 与巨噬细胞的相互作用是一个复杂的过程，涉及多种宿主细胞受体与寄生虫配体之间的直接结合，或通过补体受体介导的调理作用实现^4,5。经典的表面受体如 CR1、CR3、甘露糖-岩藻糖、纤连蛋白、Toll 样受体和清道夫受体，均可介导寄生虫与巨噬细胞的黏附^6,7,8。这些受体可识别 Leishmania 表面的分子，包括 63 kDa 糖蛋白（gp63）和糖脂类脂磷糖（LPG）<....

方案

细胞来自健康供体，相关程序已获得国家研究伦理委员会批准（编号：94648218.8.0000.0040）。

1. 细胞培养

1. 人单核细胞来源的巨噬细胞
   注意：为了获得人单核细胞来源的巨噬细胞 体外 分化为巨噬细胞，从健康供体采集血液，并按照 D. English 和 B. R. Andersen 的方法分离外周血单个核细胞（PBMC）²¹.
   1. 采集外周血（50 mL）后，将其倒入肝素抗凝管中，并在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释血液。将稀释后的肝素抗凝血轻柔地加至预先分装的密度梯度介质上方。
   2. 将试管在 252 × g 在24 °C下孵育30分钟，以避免溶血。
      注意：设置离心机刹车为关闭状态，以避免梯度层混合。离心后，从底部到顶部形成不连续的梯度层：红细胞、密度梯度介质、外周血单个核细胞环和血浆。
   3. 将位于密度梯度介质层与血浆层之间的外周血单个核细胞环转移至新离心管中，并用 PBS 填充以洗去多余的密度梯度介质。
   4. 洗涤细胞一次，在 4 °C 条件下以 190 × g 离心 10 分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL完全RPMI培养基中。
   6. 计数细胞并接种 2 × 10⁶ 细胞在5....

结果

本研究报告旨在评估从患有L. braziliensis-LCL或L. braziliensis-DL型皮肤利什曼病（CL）患者中分离出的L. braziliensis在吞噬过程中发生的早期事件。利用共聚焦显微镜，我们研究了与寄生虫吞噬相关的主要事件：结合、内化以及吞噬体成熟过程。我们首先评估了人单核细胞来源的巨噬细胞对L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL的结合与吞噬作用。结果显示，L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL在与巨噬细胞结合方面无显著差异（图1）。此外，在宿主细胞对L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL的吞噬作用方面也未观察到差异（图2）。最后，我们比较了感染细胞中由L. braziliensis-LCL或L........

讨论

Leishmania-巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，涉及多个可能影响疾病发展的步骤⁵。为了更好地理解非调理素化的Leishmania与宿主细胞相互作用的机制，我们描述了一种利用共聚焦荧光显微镜评估Leishmania感染从早期到晚期吞噬作用的实验方案。使用涉及两种或多种荧光染料的荧光技术来研究细胞生物学机制，包括免疫标记和荧光标记蛋白的表达，使我们能够分析多种蛋白的定位，同时评估细胞形态。这些方法所提供的优势使其成为监测病原体与宿主细胞相互作用的最佳工具³⁴。

为了更好地理解涉及不同颗粒的吞噬过程，有必要在分子水平上分析这一高度动态的过程³⁵。共聚焦荧光显微镜已被使用数十年，用于此目的，并已被证明是通过测定被内化的颗粒数量或参与宿主-病原体相互作用早期阶段的蛋白质类型来定量吞噬作用的优秀工具³⁴。本研究提出利用共聚焦显微镜分析来自不同临.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	21985023
AlexaFluor 488 标记的山羊抗兔 IgG	Thermo Fisher Scientific	Tem varios no site
抗 LC3 抗体	Novus Biologicals	NB600-1384
牛血清白蛋白 (BSA)	Thermo Fisher Scientific	X
CellStripper	Corning	25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) 染料	Thermo Fisher Scientific	C34552
Centrífuga	Thermo Fisher Scientific
环丙沙星	Isofarma	X
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	X
共聚焦荧光显微镜 (Leica SP8)	Leica	Leica SP8
胎牛血清 (FBS)	Gibco	10270106
荧光显微镜 (Olympus Lx73)	Olympus	Olympus Lx73
庆大霉素	Gibco	15750045
谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	35050-061
HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)	Gibco	X
Histopaque	Sigma	10771
M-CSF	Peprotech	300-25
NH4Cl	Sigma	A9434
正常山羊血清	Sigma	NS02L
Nucleofector 2b 装置	Lonza	AAB-1001
Nucleofector 溶液	Lonza	VPA-1007
多聚甲醛	Sigma	158127
鬼笔环肽	Invitrogen	A12379
佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 (PMA)	Sigma	P1585
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂盒	Life Technologies	P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基	Gibco	11875-093
皂苷	Thermo Fisher Scientific	X
Schneider 昆虫培养基	Sigma	S0146
碳酸氢钠	Sigma	S5761
丙酮酸钠	Sigma	S8636
Triton X-100	Sigma	X