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方法文章

使用共聚焦显微镜研究Leishmania的吞噬作用

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DOI：

10.3791/62459

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2021年7月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

与吞噬作用相关的机制 利什曼原虫 感染仍知之甚少。本文中，我们描述了用于评估感染早期事件的方法 利什曼原虫 与宿主细胞的相互作用。

摘要

吞噬作用是一个有序的过程，包含识别、结合和内化等不同步骤。专业吞噬细胞通过吞噬作用摄取Leishmania寄生虫，该过程涉及宿主细胞多种受体对寄生虫表面配体的识别。Leishmania与巨噬细胞膜的结合通过补体受体1型（CR1）、补体受体3型（CR3）以及模式识别受体介导。脂磷糖苷（LPG）和63 kDa糖蛋白（gp63）是参与巨噬细胞与Leishmania相互作用的主要配体。在宿主细胞受体初步识别寄生虫配体后，寄生虫被内化，并在含虫空泡内存活和增殖。Leishmania诱导形成的空泡的成熟过程涉及从细胞内囊泡获取多种分子，包括小G蛋白Rab 5和Rab 7、溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）、溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）以及微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）。

本文介绍了利用共聚焦显微镜评估Leishmania与宿主细胞相互作用早期事件的方法，包括（i）结合、（ii）内化以及（iii）吞噬体成熟过程。通过增进对这些决定感染结局的关键因素的认识，我们希望加深对Leishmania感染发病机制的理解，并为最终寻找新的化学治疗靶点提供支持。

引言

利什曼病是一种由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的被忽视热带病，可在脊椎动物宿主中引起广泛的临床表现，包括皮肤利什曼病、黏膜皮肤利什曼病和内脏利什曼病1。 世界卫生组织（WHO）估计，全球有超过十亿人面临感染风险，每年报告的新病例超过一百万例2。

Leishmania 属为专性胞内原虫，可在宿主细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞）内生存3。Leishmania 与巨噬细胞的相互作用是一个复杂的过程，涉及多种宿主细胞受体与寄生虫配体之间的直接结合，或通过补体受体介导的调理作用实现4,5。经典的表面受体如 CR1、CR3、甘露糖-岩藻糖、纤连蛋白、Toll 样受体和清道夫受体，均可介导寄生虫与巨噬细胞的黏附6,7,8。这些受体可识别 Leishmania 表面的分子，包括 63 kDa 糖蛋白（gp63）和糖脂类脂磷糖（LPG）9。这些分子是前鞭毛体表面最丰富的成分，在干扰宿主免疫应答、促进寄生虫在哺乳动物细胞内定植方面发挥关键作用10。当寄生虫表面配体与巨噬细胞受体结合后，F-肌动蛋白在哺乳动物细胞表面聚集，包裹被吞噬的寄生虫。随后形成一种由寄生虫诱导的区室结构，称为含虫空泡（parasitophorous vacuole, PV），其具有吞噬溶酶体的特征11。一旦进入这些吞噬溶酶体，寄生虫将经历一系列对其存活和增殖至关重要的改变3。

PV的生物发生是一个高度调控的膜运输过程，对这种病原体的胞内存活至关重要12。该区室的形成源于吞噬体与宿主细胞内吞途径区室之间的连续融合事件。经典的细胞生物学研究表明，PV的成熟涉及单体G蛋白Rab5和Rab7蛋白的获取，它们分别主要与早期内体和晚期内体的成熟相关13。此外，这些区室还获得了溶酶体相关膜蛋白1和2（LAMP1、LAMP2），即溶酶体膜的主要蛋白质组分，以及微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3），一种自噬体标志物14。尽管存在明显的相似性，PV形成的动力学15,16以及这些区室的形态因Leishmania物种的不同而有所差异。例如，L. mexicana或L. amazonensis引起的感染会诱导形成含有大量寄生虫的大型区室17。相比之下，其他物种如L. braziliensis和L. infantum则形成较小的液泡，每个液泡通常仅含有一到两个寄生虫18。

尽管人们对宿主细胞与Leishmania的相互作用已有一定了解，但宿主受体与寄生虫配体接触后所触发的早期事件尚未完全阐明。这些事件被认为是寄生虫感染结局的决定因素，且依赖于寄生虫种类、宿主细胞中被招募来识别寄生虫的受体类型以及巨噬细胞信号通路的激活19,20。因此，鉴定参与Leishmania诱导的吞噬泡（PV）形成的分子，并明确这些分子在感染建立及结局中所起的作用，显得尤为关键。本文描述了一种用于监测Leishmania吞噬过程中早期事件的方法，包括结合、内化、吞噬体形成及其成熟过程。本研究有助于阐明PLC、Akt、Rab5、Rab7和LC3在不同Leishmania物种诱导的PV形成中的作用。尤为重要的是，该实验方案可用于研究其他参与PV成熟过程的蛋白质的功能。未来的研究将进一步拓展人们对Leishmania与宿主细胞相互作用机制的认识，并为新型化学治疗策略的设计提供依据。

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方案

细胞来自健康供体，相关程序已获得国家研究伦理委员会批准（编号：94648218.8.0000.0040）。

1. 细胞培养

  1. 人单核细胞来源的巨噬细胞
    注意：为了获得人单核细胞来源的巨噬细胞 体外 分化为巨噬细胞，从健康供体采集血液，并按照 D. English 和 B. R. Andersen 的方法分离外周血单个核细胞（PBMC）21.
    1. 采集外周血（50 mL）后，将其倒入肝素抗凝管中，并在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释血液。将稀释后的肝素抗凝血轻柔地加至预先分装的密度梯度介质上方。
    2. 将试管在 252 × g 在24 °C下孵育30分钟，以避免溶血。
      注意：设置离心机刹车为关闭状态，以避免梯度层混合。离心后，从底部到顶部形成不连续的梯度层：红细胞、密度梯度介质、外周血单个核细胞环和血浆。
    3. 将位于密度梯度介质层与血浆层之间的外周血单个核细胞环转移至新离心管中，并用 PBS 填充以洗去多余的密度梯度介质。
    4. 洗涤细胞一次，在 4 °C 条件下以 190 × g 离心 10 分钟。
    5. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL完全RPMI培养基中。
    6. 计数细胞并接种 2 × 106 细胞在500 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基中培养，培养基中添加25 mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸] (HEPES)、2 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 g/mL 环丙沙星和10% 灭活胎牛血清 (FBS)（完全RPMI培养基），于37 °C、5% CO₂条件下培养7天2 在24孔板中培养，通过贴壁使单核细胞分化为巨噬细胞。
  2. THP-1 细胞培养
    1. 以 2 × 10 的浓度培养 THP-1 细胞系5 75 cm² 培养瓶中加入 10 mL 完全 RPMI 培养基培养细胞2 培养瓶
    2. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中维持细胞培养2 7天。
    3. 在 4 °C 条件下以 720 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀，并将沉淀重悬于完全 RPMI 培养基中。
    4. 在血细胞计数板中计数细胞。
    5. 将细胞以 2 × 10⁵ 个/毫升的浓度接种于 13 mm 玻璃盖玻片上5 每孔加入含100 nM佛波酯（PMA）的500 μL完全RPMI培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 以诱导 THP1 细胞分化为巨噬细胞。
    6. 三天后，用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，以去除含有PMA的培养基。
    7. 将已分化的 THP-1 细胞在不含 PMA 的完全 RPMI 培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 再继续培养2天后，开始实验。

2. 寄生虫培养与CellTracker Red染色

注意：为了通过荧光显微镜观察寄生虫，可使用CellTracker Red荧光染料（CMTPX）进行染色。或者，也可根据制造商说明书使用其他标记物，如羧基荧光素，或使用持续表达GFP、RFP或其他荧光报告基因的前鞭毛体。用于感染细胞的寄生虫应为来自无菌前鞭毛体培养物、传代不超过7代的生长稳定期寄生虫。

  1. 在含有5 mL Schneider's培养基的细胞培养瓶中培养Leishmania spp. 前鞭毛体，培养基中添加50 μg/mL庆大霉素和10%胎牛血清（FBS），接种密度为每1,000 μL培养基含1 × 105个寄生虫。
  2. 将寄生虫无菌培养物置于24 °C的生化需氧量（B.O.D.）培养箱中孵育，每日使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行计数，连续5天观察寄生虫形态（细长形）及运动能力。当两次相隔8小时的连续计数结果显示虫体数量相近时，判定寄生虫进入稳定生长期。
  3. 当寄生虫达到稳定生长期后，将其与4 mL含1 μM CMTPX的0.9% NaCl溶液混合，在37 °C、5% CO2条件下避光孵育15分钟。
  4. 按1:1比例加入胎牛血清（FBS），并将寄生虫悬液继续孵育1分钟。
  5. 用PBS洗涤寄生虫三次，每次以1,781 × g离心10分钟。
  6. 将寄生虫沉淀重悬于1,000 μL完全RPMI培养基中。
  7. 使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对寄生虫进行计数。

3. 评估 利什曼原虫 与巨噬细胞结合

  1. 在24孔板中每孔加入500 μL完全RPMI培养基，接种2 × 105个THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞，孔内预先放置13 mm玻璃盖玻片。
  2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24 h。
  3. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，并在4 °C下用完全RPMI培养基孵育10 min。
  4. 按A. L. Petersen22所述方法，以10:1的比例加入静止期前鞭毛体，然后在4 °C下以720 × g离心5 min。
  5. 在4 °C下孵育5 min。
  6. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，以去除未被内化的前鞭毛体。
  7. 在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15 min。
  8. 将盖玻片在15 mM NH4Cl溶液中室温孵育15 min。
  9. 用含0.15%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤三次，再用封闭液（PBS中含3% BSA）室温孵育1 h。
  10. 用PBS洗涤三次，然后在室温下用0.15% PBS-皂苷透化15 min。
  11. 加入鬼笔环肽（按1:1,200稀释），室温避光孵育1 h。
  12. 使用封片剂将盖玻片封片。
  13. 使用63×/1.4物镜的共聚焦荧光显微镜采集图像。

4. 评估 利什曼原虫 巨噬细胞的吞噬作用

  1. 在24孔板中每孔加入500 μL完全RPMI培养基，接种2 × 105个THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞，并放置13 mm玻璃盖玻片。
  2. 于37 °C、5% CO2条件下培养细胞24 h。
  3. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，随后在4 °C条件下于24孔板中用完全RPMI培养基孵育10 min。
  4. 按照A. L. Petersen22所述方法加入处于静止期的Leishmania spp.，感染比例为10:1（寄生虫：宿主细胞），然后在4 °C下以720 × g离心10 min。
  5. 在4 °C条件下孵育细胞5 min。
  6. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，以去除未被内化的前鞭毛体。
  7. 在添加补充物的RPMI培养基中于37 °C孵育细胞1 h。
  8. 用4%多聚甲醛固定细胞15 min。
  9. 使用合适的封片介质封固盖玻片。
  10. 在荧光显微镜下使用100×/1.4物镜，随机选取视野计数不少于400个细胞。

5. 评估 利什曼原虫 诱导的液泡成熟

注意：THP-1 细胞转染应按照 M. B. Maess、B. Wittig 和 S. Lorkowski23 所述方法进行。本文对此方案进行了简要总结，并做了少量修改。核转染（nucleofection）是一种特定的转染方法，需要使用核转染仪（nucleofector）。作为替代方法，也可使用脂质体转染试剂（lipofectamine）24 和慢病毒转导 25 对细胞进行转染。

  1. 为了研究生物发生过程 利什曼原虫诱导PV，用PLC转染THP1细胞26,27，Akt26,27，Rab 528,29,30 或 Rab 728,29,31 质粒
    ​注意：本方法可用于转染除上述基因外的其他基因至 THP-1 细胞。
  2. 将THP-1细胞以1.5 × 10⁵接种7 在含有100 ng/mL PMA和50 µM 2-巯基乙醇的10 mL完全RPMI培养基中，于75 cm²组织培养瓶中培养48小时。
  3. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞一次。
  4. 使用非酶细胞解离液解离细胞，并在室温下以250 × g离心5分钟。
  5. 将THP-1细胞重悬于1 mL RPMI培养基中，并在Neubauer计数板中进行细胞计数。
  6. 再次以250 × g在室温下离心THP-1细胞10分钟。弃去上清液。
  7. 重悬 2 × 106 在100 µL Nucleofector溶液中加入细胞，并与0.5 µg编码目的蛋白的质粒共孵育，该质粒带有荧光蛋白标签。
  8. 将含有 THP-1 细胞和核酸的悬液转移至电转杯中。
  9. 使用 Nucleofector 程序 Y-001 转染 THP1 细胞。
  10. 回收转染的细胞（2×10⁶）6) 并将细胞以500 μL RPMI培养基接种于含13 mm玻璃盖玻片的24孔板中（每转染使用4孔）。
  11. 将THP-1细胞在完全RPMI培养基中于37 °C孵育0.5、2、4、6、12和24小时。
  12. 重复步骤 3.13 和 3.13。

6. LC3 招募的评估 利什曼原虫 spp. PVs

注意：自噬膜标志物 LC3 可用于检测吞噬体是否具有自噬特征。LC3 向吞噬体的招募 利什曼原虫-诱导的 PVs 可通过使用抗 LC3 抗体对细胞进行免疫标记来评估，方法如 C. Matte 之前所述32 和 B. R. S. Dias33.

  1. 在24孔板中，将2 × 105个THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞接种于含500 μL完全RPMI培养基的13 mm玻璃盖玻片上。
  2. 在37 °C、5% CO2条件下培养细胞24小时。
  3. 用0.9% NaCl溶液洗涤细胞两次，并在完全RPMI培养基中孵育。
  4. 按照A. L. Petersen22所述方法，以10:1（寄生虫：宿主细胞）的比例加入处于静止期的Leishmania spp.前鞭毛体，并在4 °C下以720 × g离心5分钟。
  5. 在37 °C孵育30分钟或4小时，随后洗涤两次并固定细胞，以评估感染早期阶段LC3向Leishmania诱导的吞噬泡（PV）膜的募集情况。
    1. 或者，为评估感染后期阶段LC3向PV膜的募集情况，可在感染4小时后对另一组巨噬细胞洗涤两次，以去除未被内化的前鞭毛体。将感染的细胞在完全RPMI培养基中继续孵育12小时和24小时，最后洗涤两次并固定。
      注意：固定后的细胞可在4 °C下保存于PBS或0.9% NaCl溶液中，直至进行标记。
  6. 在室温下，用含0.1% Triton X-100、1% BSA、20%正常山羊血清、6%脱脂奶粉和50%胎牛血清（FBS）的溶液对固定细胞同时进行封闭和透化处理，持续20分钟。
  7. 将细胞与抗LC3抗体（1:200稀释于PBS中）在室温下孵育2小时。
    注意：作为免疫荧光染色的阴性对照，应将一组细胞与来源于一抗宿主动物的免疫球蛋白G（IgG）在等同于一抗使用浓度的条件下孵育。
  8. 在室温下用0.9% NaCl溶液洗涤细胞三次。
  9. 将细胞与AlexaFluor 488标记的山羊抗兔IgG（1:500）或其他优选的荧光染料标记的二抗在室温下孵育1小时。
  10. 在室温下用0.9% NaCl溶液洗涤细胞三次。
  11. 使用优选的封片介质封固盖玻片。
  12. 使用63x/1.4物镜通过共聚焦荧光显微镜采集图像。

7. 共聚焦显微镜图像采集与Fiji定量分析

注意：应使用共聚焦激光扫描显微镜采集免疫荧光图像。为获得更高的分辨率，请使用63倍油镜物镜。

  1. 将13 mm的玻璃盖玻片在室温下放置至少30分钟，并避免光照。
  2. 用吸水纸清洁盖玻片。
  3. 在物镜上滴加一滴浸油，然后放置载玻片。
  4. 向上移动物镜，直到油与载玻片接触。
  5. 在显微镜下观察并调节焦距，选择63x油镜选项。
  6. 打开Leica程序，将激光波长调节至488、552和405。
  7. 选择图像分辨率为1,024 × 1,024。
  8. 点击Live按钮，设置Z轴层厚，然后点击Begin选项；再次操作后点击End按钮。建议设置切片厚度为20 μm，以获得分辨率良好的共聚焦图像。
  9. 等待图像采集完成，然后在Leica工具中选择"最大投影"选项。
  10. 保存实验数据。
  11. 将lif或tiff格式的图像导出至计算机，并打开FIJI程序。
  12. 打开实验文件，使用超堆栈设置视图堆栈，然后选择单独打开文件并拼接图块。
  13. 在Fiji工具栏中选择自由手绘工具，手动仔细勾画细胞轮廓。
  14. 点击Analyze按钮并进行测量，以观察荧光强度。
  15. 对每组中的每个细胞重复此过程。
  16. 保存测量结果，并将其导出至电子表格编辑软件。
  17. 将数据导入统计分析软件，进行统计分析。

8. 统计学分析

注意：进行数据分析和绘图时，请使用统计分析软件。

  1. 打开程序。
  2. 输入获得的数据并检验正态性参数。
  3. 对于符合正态分布的数据，采用学生t-检验；对于非参数检验，采用Mann-Whitney检验。
  4. 当p值小于0.05时，认为数据差异具有统计学显著性。
  5. 绘制数据图表，包含集中趋势指标（均值或中位数）和变异程度指标。

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结果

本研究报告旨在评估从患有L. braziliensis-LCL或L. braziliensis-DL型皮肤利什曼病（CL）患者中分离出的L. braziliensis在吞噬过程中发生的早期事件。利用共聚焦显微镜，我们研究了与寄生虫吞噬相关的主要事件：结合、内化以及吞噬体成熟过程。我们首先评估了人单核细胞来源的巨噬细胞对L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL的结合与吞噬作用。结果显示，L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL在与巨噬细胞结合方面无显著差异（图1）。此外，在宿主细胞对L. braziliensis-LCL和L. braziliensis-DL的吞噬作用方面也未观察到差异（图2）。最后，我们比较了感染细胞中由L. braziliensis-LCL或L....

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讨论

Leishmania-巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，涉及多个可能影响疾病发展的步骤5。为了更好地理解非调理素化的Leishmania与宿主细胞相互作用的机制，我们描述了一种利用共聚焦荧光显微镜评估Leishmania感染从早期到晚期吞噬作用的实验方案。使用涉及两种或多种荧光染料的荧光技术来研究细胞生物学机制，包括免疫标记和荧光标记蛋白的表达，使我们能够分析多种蛋白的定位，同时评估细胞形态。这些方法所提供的优势使其成为监测病原体与宿主细胞相互作用的最佳工具34。

为了更好地理解涉及不同颗粒的吞噬过程，有必要在分子水平上分析这一高度动态的过程35。共聚焦荧光显微镜已被使用数十年，用于此目的，并已被证明是通过测定被内化的颗粒数量或参与宿主-病原体相互作用早期阶段的蛋白质类型来定量吞噬作用的优秀工具34。本研究提出利用共聚焦显微镜分析来自不同临...

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披露

资助方在研究设计、数据收集或分析、发表决定以及稿件撰写方面均未发挥任何作用。作者声明，本研究的开展不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。

致谢

感谢巴西巴伊亚州奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会戈恩萨洛·莫尼兹研究所及显微镜学部门提供的协助。本研究由INOVA-FIOCRUZ项目（编号79700287000）资助，P.S.T.V. 获得了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）的研究生产力资助（305235/2019-2）。质粒由加拿大多伦多大学Mauricio Terebiznik惠赠。作者谨此感谢Andris K. Walter在英文语言修改及稿件编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488 标记的山羊抗兔 IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
抗 LC3 抗体Novus BiologicalsNB600-1384
牛血清白蛋白 (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) 染料Thermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
环丙沙星IsofarmaX
CO2 培养箱Thermo Fisher ScientificX
共聚焦荧光显微镜 (Leica SP8)LeicaLeica SP8
胎牛血清 (FBS)Gibco10270106
荧光显微镜 (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
庆大霉素Gibco15750045
谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
正常山羊血清SigmaNS02L
Nucleofector 2b 装置LonzaAAB-1001
Nucleofector 溶液LonzaVPA-1007
多聚甲醛Sigma158127
鬼笔环肽InvitrogenA12379
佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 (PMA)SigmaP1585
磷酸盐缓冲液 (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂盒Life TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基Gibco11875-093
皂苷Thermo Fisher ScientificX
Schneider 昆虫培养基SigmaS0146
碳酸氢钠SigmaS5761
丙酮酸钠SigmaS8636
Triton X-100SigmaX

参考文献

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