使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

摘要

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。

摘要

器官发育、功能维持与再生依赖于定位于特定解剖空间——即干细胞微环境（干细胞龛）中的干细胞。小鼠不断生长的门齿是研究组织特异性干细胞的优良模型。该门齿的上皮组织特异性干细胞位于牙齿近端的一个称为颈环的微环境结构中，持续提供新细胞以补偿牙齿自 sharpening 尖端因不断磨损而损失的细胞。本文介绍了一种分离并培养含有干细胞及其微环境的小鼠门齿近端组织的详细方案。该方案为改良的Trowell型器官培养法，可实现 体外 组织块（外植体）以及厚组织切片在由金属网格支撑的滤膜上于液/气界面进行培养。此处描述的器官培养方案可实现常规方法难以完成的组织操作 体内 结合荧光报告分子的使用，该系统可实现对活体组织中特定细胞群体（包括干细胞）的鉴定与长期示踪。该平台可用于检测多种调控分子及药理学化合物对干细胞及其微环境的影响，从而为研究干细胞的调控机制与维持过程提供有力工具。

引言

小鼠门齿能够持续生长，是由于支持牙齿成分不断生成的干细胞（SC）在其一生中均得以保留。这些干细胞包括上皮干细胞，其可生成成釉细胞以形成釉质；以及间充质干细胞（MSCs），其可生成成牙本质细胞以形成牙本质，以及其他多种细胞¹。在持续生长的门齿中，上皮干细胞最初被鉴定为标记滞留细胞^2,3，随后研究发现其表达多种已知的干性基因，包括 Sox2⁴。这些细胞与其他器官中的上皮干细胞具有共同特征，并定位于位于门齿唇侧的颈环结构中的干细胞微环境（niche）内。该微环境是一个由细胞和细胞外基质组成的动态结构，可调控干细胞的活性⁵。谱系追踪研究表明，Sox2+ 上皮干细胞能够再生牙齿的整个上皮部分，并在继发性牙齿形成过程中发挥关键作用^6,7。具有牙本质修复或再生潜能的间充质干细胞主要通过血管和神经从牙器官外部募集而来^8,9,10,1....

方案

本方案涉及动物的使用，所有操作均经赫尔辛基大学动物使用与护理伦理委员会及动物设施批准。

1. 器官培养皿的制备

1. 所有操作均在超净工作台中进行。使用70%乙醇清洁工作台面，并使用经高压灭菌的玻璃器皿和溶液。用玻璃珠灭菌器对剪刀及其他金属器械进行灭菌。
2. 将通常保存在70%乙醇中的滤膜用1×PBS洗涤三次以去除乙醇（图1），然后将滤膜切成矩形小片（3 × 3–5 × 5 mm）。
   注意：洗涤后的滤膜片可在4 °C的1×PBS中保存数天。
3. 配制培养基（1:1的DMEM:F12，添加1% [v/v] 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（溶于0.85% NaCl）、10% [v/v] 胎牛血清、150 µg/mL 抗坏血酸，以及0.2% [v/v] 青霉素[10,000 I.U./mL]和链霉素[10,000 µg/mL]）。4 °C保存。
4. 将直径为30 mm的金属网格（孔径1–2 mm，可用于组织成像）放入35 mm培养皿中。加入足够培养基，使液面刚好接触网格表面且不产生气泡。将配制好的培养皿置于37 °C预热，直至组织分离完成并准备进行培养（置于含5% CO₂和90%–95%湿度的标准培养箱中）。

2. 切牙解剖及近端分离

结果

上皮干细胞位于一个称为颈环的微环境中，该结构位于门齿的近端（图3A）。颈环在形态上是独特的结构，由内釉上皮和外釉上皮组成，包裹着星网状层——一层排列疏松的上皮细胞核心（图3B，C）。每颗门齿中有两个颈环（图3A），但只有唇侧颈环含有干细胞。上皮干细胞定位于颈环顶端的星网状层及其相邻的釉上皮区域^20，21。这些干细胞产生的子代细胞特征性地表达 Sfrp5，并进一步分化为高度增殖的过渡扩增细胞，进而生成多种细胞类型，包括分泌釉质的成釉细胞^2，7。从干细胞向成釉细胞的分化过程可在本文所述的器官培养系统中重现²。

讨论

体外器官培养已被广泛用于研究调控器官生长和形态发生的诱导潜能及上皮-间充质相互作用。Thesleff 实验室已展示了如何改进 Trowell 型器官培养的 Saxén 方法，并将其用于牙齿发育的研究¹⁴。由于实验条件可重复，且荧光报告系统不断进步，该方法已成为监测牙齿形态发生过程及其中不同细胞群体的有力工具。本文描述了如何应用该方案研究上皮干细胞及其所处的微环境。

一种用于从幼龄及成年动物中分离切牙近端（包含干细胞微环境）的技术在此被描述。该方法的成功取决于组织分离所需的时间（直接影响组织活性）以及能否完整分离出未受损且唇侧颈环结构完好的近端组织。在骨组织已发生矿化的成年动物中，这一操作尤为困难。本方案展示了如何利用可控的机械力破碎矿化的骨组织，从而在显著短于其他已发表方案所需的时间内，获得完全完整且具有活性的软组织。²⁵组织分离后可进行培养 体外，无论是整体还是厚切片。厚组织切片法的缺点在于每个切片中仅包含部分颈环结构，因此无法在不同切片中获得可重复.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 塑料注射器
一次性 20/26 号皮下注射针头	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14287
超精细邦剪刀	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
南美来源胎牛血清（CE）	LifeTechn.	10270106	分装保存，置于 -20°C 保存
玻璃珠灭菌器，Steri 250 秒灭菌器	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）	Gibco	35050-038
Isopore 聚碳酸酯滤膜，0.1 µm，25 mm 直径	MerckMillipore	VCTP02500	室温下保存于 70% 乙醇中
L-抗坏血酸	Sigma	A4544-25g	用 MilliQ 水稀释至 100 mg/mL，过滤除菌后分装为 20μL 等份，避光，-20°C 保存
低熔点琼脂糖	TopVision	R0801
金属网格			可商业购买，或使用不锈钢网（耐腐蚀，网孔尺寸 0.7 mm）自制。剪成直径约 30 mm 的圆片，边缘弯折至 3 mm 高度。用钉子打孔。
显微镊子	Medicon	07.60.03
多聚甲醛	Sigma-Aldrich
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）	Gibco	15140-148
培养皿，钠钙玻璃	DWK Life Sciences	9170442
35 mm 培养皿，带通气孔	Duran	237554008
90 mm 培养皿，无通气孔经典款	Thermo Fisher	101RT/C
小剪刀