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方法文章

使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

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DOI：

10.3791/62462

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2021年7月8日

 , 
1Research Program in Developmental Biology, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2Department of Oral and Maxillofacial diseases, Faculty of Medicine, University of Helsinki

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。

摘要

器官发育、功能维持与再生依赖于定位于特定解剖空间——即干细胞微环境（干细胞龛）中的干细胞。小鼠不断生长的门齿是研究组织特异性干细胞的优良模型。该门齿的上皮组织特异性干细胞位于牙齿近端的一个称为颈环的微环境结构中，持续提供新细胞以补偿牙齿自 sharpening 尖端因不断磨损而损失的细胞。本文介绍了一种分离并培养含有干细胞及其微环境的小鼠门齿近端组织的详细方案。该方案为改良的Trowell型器官培养法，可实现 体外 组织块（外植体）以及厚组织切片在由金属网格支撑的滤膜上于液/气界面进行培养。此处描述的器官培养方案可实现常规方法难以完成的组织操作 体内 结合荧光报告分子的使用，该系统可实现对活体组织中特定细胞群体（包括干细胞）的鉴定与长期示踪。该平台可用于检测多种调控分子及药理学化合物对干细胞及其微环境的影响，从而为研究干细胞的调控机制与维持过程提供有力工具。

引言

小鼠门齿能够持续生长，是由于支持牙齿成分不断生成的干细胞（SC）在其一生中均得以保留。这些干细胞包括上皮干细胞，其可生成成釉细胞以形成釉质；以及间充质干细胞（MSCs），其可生成成牙本质细胞以形成牙本质，以及其他多种细胞1。在持续生长的门齿中，上皮干细胞最初被鉴定为标记滞留细胞2,3，随后研究发现其表达多种已知的干性基因，包括 Sox24。这些细胞与其他器官中的上皮干细胞具有共同特征，并定位于位于门齿唇侧的颈环结构中的干细胞微环境（niche）内。该微环境是一个由细胞和细胞外基质组成的动态结构，可调控干细胞的活性5。谱系追踪研究表明，Sox2+ 上皮干细胞能够再生牙齿的整个上皮部分，并在继发性牙齿形成过程中发挥关键作用6,7。具有牙本质修复或再生潜能的间充质干细胞主要通过血管和神经从牙器官外部募集而来8,9,10,11，因此为研究间充质干细胞群体的募集、迁移与归巢提供了理想的模型。

研究施万细胞 体内 由于许多遗传学和/或药理学操作可能影响器官稳态和/或产生致死性后果，因此并不总是可行。因此，器官培养为研究干细胞（SCs）及其微环境的调控提供了极佳的工具 体外. 利用金属网格的器官培养系统最初由 Trowell 建立12 用于研究器官发育，并由Saxen进一步改进13 研究肾脏发育中的诱导信号。自那以来，这一 体外 培养整个器官或其部分的方法已在不同领域成功应用。在牙齿发育研究领域，该方法被广泛用于研究调控牙齿发育的上皮-间充质相互作用14 以及继发性牙齿形成15Thesleff 实验室的工作已证明该系统可用于牙齿生长和形态发生的时序分析、各种分子和生长因子对牙齿生长影响的研究，以及牙齿发育过程的延时活体成像。16,17近年来，该方法已被用于研究门齿干细胞（SCs）及其微环境的调控机制18,19，此处将对其进行详细描述。

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方案

本方案涉及动物的使用，所有操作均经赫尔辛基大学动物使用与护理伦理委员会及动物设施批准。

1. 器官培养皿的制备

  1. 所有操作均在超净工作台中进行。使用70%乙醇清洁工作台面，并使用经高压灭菌的玻璃器皿和溶液。用玻璃珠灭菌器对剪刀及其他金属器械进行灭菌。
  2. 将通常保存在70%乙醇中的滤膜用1×PBS洗涤三次以去除乙醇（图1），然后将滤膜切成矩形小片（3 × 3–5 × 5 mm）。
    注意：洗涤后的滤膜片可在4 °C的1×PBS中保存数天。
  3. 配制培养基（1:1的DMEM:F12，添加1% [v/v] 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（溶于0.85% NaCl）、10% [v/v] 胎牛血清、150 µg/mL 抗坏血酸，以及0.2% [v/v] 青霉素[10,000 I.U./mL]和链霉素[10,000 µg/mL]）。4 °C保存。
  4. 将直径为30 mm的金属网格（孔径1–2 mm，可用于组织成像）放入35 mm培养皿中。加入足够培养基，使液面刚好接触网格表面且不产生气泡。将配制好的培养皿置于37 °C预热，直至组织分离完成并准备进行培养（置于含5% CO2和90%–95%湿度的标准培养箱中）。

2. 切牙解剖及近端分离

  1. 根据批准的动物护理方案处死动物。
  2. 将小鼠断头并解剖下颌骨。首先去除皮肤以暴露下颌骨，然后切开咬肌，使下颌骨与上颌骨及头部其余部分分离。
  3. 当下颌骨被分离后，移除舌头及尽可能多的软组织。
  4. 收集所有下颌骨，并将其置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，冰上保存，以提高组织的存活率。
  5. 将一个下颌骨转移至玻璃培养皿中，在体视显微镜下使用一次性20/26 G皮下注射针解剖门齿。沿中线切开下颌骨，切断骨联合。清除骨表面的软组织和肌肉组织，以获得更清晰的视野。
    ​注意：必须使用玻璃培养皿，因为这样不会使针头变钝。
  6. 从不足10日龄动物获取的下颌骨较软且更脆弱，因此应使用一次性20/26 G皮下注射针纵向切开下颌骨的每一半，以暴露门齿。对于超过10日龄的小鼠，则使用镊子夹住下颌骨并折断骨骼以暴露牙齿。
  7. 轻柔地将门齿从周围骨组织中分离，并切除包含颈环的近端部分。
  8. 切下近端部分，并去除矿化的釉质和牙本质基质。
  9. 将收集的近端部分保存在杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中，冰上放置，直至准备进行培养。

3. 培养

  1. 将滤膜矩形片小心放置在预热培养皿中网格的上方。
  2. 使用体视显微镜正确调整组织块的方向。
  3. 置于标准培养箱中，37 °C、5% CO2、90%–95% 湿度条件下培养。
  4. 每隔一天更换培养基，并小心更换新鲜培养基，避免产生气泡。使用连接体视显微镜的相机每日观察组织生长情况并拍照记录。

4. 向培养物中添加可溶性因子

  1. 添加可溶性因子和感兴趣的分子到培养基中，以研究它们对干细胞调控的影响。
    ​注意：任何分子（生长因子、信号分子、阻断抗体、药理学化合物如抑制剂或激活剂、载体等）的给药方案取决于其半衰期和溶解度。这些参数也决定了应使用的适当对照。

5. 分子与组织学分析

  1. 移除培养基。
  2. 小心地向组织中加入预冷的甲醇，以防止组织从滤膜上脱落。
  3. 让甲醇作用 5 分钟。
  4. 将带有组织外植块的滤膜转移至样品管中。
  5. 在 4 °C 条件下，用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定外植块 10–24 小时。
  6. 按照既定的实验方案进行组织学处理（石蜡包埋、冷冻切片等）或免疫染色。

6. 组织切片的培养

注意：本实验方案有多种变体，均同样有效，具体选择取决于操作者的速度和个人偏好。这些变体主要涉及用于收集组织并维持其活性的缓冲液。可选用克雷布斯缓冲液（Krebs buffer）、添加2%葡萄糖及抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS），或单纯的PBS。若使用克雷布斯缓冲液，应提前1天配制，并于4 °C保存。

  1. 实验前，通过将 2–2.5 g 低熔点琼脂糖溶解于 50 mL 沸腾的 2% 葡萄糖/PBS 中，制备 4%–5% 的低熔点琼脂糖溶液，随后将该溶液置于 45 °C 水浴中保温。
  2. 安装振动切片机，用 70% 乙醇清洗，并加入含抗生素的冰冻 2% 葡萄糖/PBS（含 100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素）。
  3. 解剖切牙近端并将其收集至含抗生素的冰冻 2% 葡萄糖/PBS 中。
  4. 将一个切牙近端放入含有 4%–5% 低熔点琼脂糖的模具中，在体视显微镜下将其调整至所需方向，并置于冰上使琼脂糖凝固。
  5. 修整凝固后的琼脂糖块，并将其置于振动切片机中，切取厚切片（150–300 µm）。
  6. 将切片收集至含有含抗生素的冰冻 2% 葡萄糖/PBS 的培养皿中。
  7. 使用刮铲将厚切片转移至放置在预热网格（按第 1.3 节方法制备）上的滤纸矩形区域。
  8. 将厚切片在培养箱中孵育，并进行成像（图 2）。

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结果

上皮干细胞位于一个称为颈环的微环境中，该结构位于门齿的近端（图3A）。颈环在形态上是独特的结构，由内釉上皮和外釉上皮组成，包裹着星网状层——一层排列疏松的上皮细胞核心（图3B，C）。每颗门齿中有两个颈环（图3A），但只有唇侧颈环含有干细胞。上皮干细胞定位于颈环顶端的星网状层及其相邻的釉上皮区域20，21。这些干细胞产生的子代细胞特征性地表达 Sfrp5，并进一步分化为高度增殖的过渡扩增细胞，进而生成多种细胞类型，包括分泌釉质的成釉细胞2，7。从干细胞向成釉细胞的分化过程可在本文所述的器官培养系统中重现2。

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讨论

体外器官培养已被广泛用于研究调控器官生长和形态发生的诱导潜能及上皮-间充质相互作用。Thesleff 实验室已展示了如何改进 Trowell 型器官培养的 Saxén 方法，并将其用于牙齿发育的研究14。由于实验条件可重复，且荧光报告系统不断进步，该方法已成为监测牙齿形态发生过程及其中不同细胞群体的有力工具。本文描述了如何应用该方案研究上皮干细胞及其所处的微环境。

一种用于从幼龄及成年动物中分离切牙近端（包含干细胞微环境）的技术在此被描述。该方法的成功取决于组织分离所需的时间（直接影响组织活性）以及能否完整分离出未受损且唇侧颈环结构完好的近端组织。在骨组织已发生矿化的成年动物中，这一操作尤为困难。本方案展示了如何利用可控的机械力破碎矿化的骨组织，从而在显著短于其他已发表方案所需的时间内，获得完全完整且具有活性的软组织。25组织分离后可进行培养 体外，无论是整体还是厚切片。厚组织切片法的缺点在于每个切片中仅包含部分颈环结构，因此无法在不同切片中获得可重复...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由 Jane 和 Aatos Erkko 基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 塑料注射器
一次性 20/26 号皮下注射针头Terumo
DMEMGibco61965-026
杜尔贝科磷酸盐缓冲液Gibco14287
超精细邦剪刀F.S.T.14084-08
F-12Gibco31765-027
南美来源胎牛血清（CE）LifeTechn.10270106分装保存，置于 -20°C 保存
玻璃珠灭菌器，Steri 250 秒灭菌器Simon Keller Ltd4AJ-6285884
GlutaMAX-1（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）Gibco35050-038
Isopore 聚碳酸酯滤膜，0.1 µm，25 mm 直径MerckMilliporeVCTP02500室温下保存于 70% 乙醇中
L-抗坏血酸SigmaA4544-25g用 MilliQ 水稀释至 100 mg/mL，过滤除菌后分装为 20μL 等份，避光，-20°C 保存
低熔点琼脂糖TopVisionR0801
金属网格可商业购买，或使用不锈钢网（耐腐蚀，网孔尺寸 0.7 mm）自制。剪成直径约 30 mm 的圆片，边缘弯折至 3 mm 高度。用钉子打孔。
显微镊子Medicon07.60.03
多聚甲醛Sigma-Aldrich
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）Gibco15140-148
培养皿，钠钙玻璃DWK Life Sciences9170442
35 mm 培养皿，带通气孔Duran237554008
90 mm 培养皿，无通气孔经典款Thermo Fisher101RT/C
小剪刀

参考文献

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