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一种用于多重微球流式分析系统的快速、多重双报告基因IgG和IgM SARS-CoV-2中和检测方法

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DOI：

10.3791/62487

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2021年4月6日

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1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

采用一种用于基于微球的多重检测的流式分析系统，该系统提供双报告信号读出，用于开发多重血清学和抗体中和检测方法，可同时检测SARS-CoV-2的中和性IgG和IgM抗体。

摘要

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行凸显了对新型病原体（如SARS-CoV-2）进行快速、高通量、高灵敏度和高特异性血清学检测方法的迫切需求。多重血清学检测具有显著优势，因其可同时分析针对多种抗原的抗体，从而优化病原体覆盖范围，并控制病原体变异及个体宿主反应差异带来的影响。本文介绍一种基于荧光微球的SARS-CoV-2 IgG三重检测方法，可同时检测针对三种主要SARS-CoV-2抗原的IgM和IgG抗体，即刺突（S）蛋白、刺突蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合域（RBD）以及核衣壳（Nc）蛋白。该检测方法在症状出现21天及以上采集的血清样本中，IgG检测性能与SARS-CoV-2参考检测方法相当；而在症状出现5天内采集的样本中，其灵敏度更高。此外，采用可溶性ACE2进行中和检测时，证实了抗体对S蛋白和RBD的结合可被有效抑制。

引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行凸显了快速开发和实施快速、高通量、高性能血清学检测方法的重要性，这类方法可用于新发病原体（如SARS-CoV-2）的诊断与监测。多重血清学检测在大流行期间具有极高价值，因其可同时分析针对多种抗原的抗体，从而实现广泛的病原体覆盖，并控制病原体本身及宿主感染应答中的变异性。近期已有研究报道了一种基于荧光微球的多重检测方法——SARS-CoV-2 IgG 3Flex（3Flex），该方法可检测针对SARS-CoV-2刺突（S）蛋白、刺突蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合域（RBD）以及核衣壳（Nc）蛋白的抗体1。研究表明，3Flex在症状出现后≥21天采集的血清样本中，其性能与参考的SARS-CoV-2 IgG检测相当；而在症状出现后≤5天采集的样本中，其灵敏度更高。此外，在中和实验体系中，通过使用可溶性ACE2证实了其对S和RBD抗原抗体结合的抑制作用。基于微球的多重检测技术已被广泛采纳为一种成熟的多重血清学检测平台，在大规模筛查中具有明显优势，包括结果出具时间短、样本需求量小以及人力成本降低2,3,4。

近期，一种新型流式分析仪器已投入使用，该仪器具备先前研究中所展示系统相同的高重数、高通量能力1，并新增了两个报告通道的优势。在单个反应中同时检测两种荧光报告信号的能力，使得每个样本的每种分析物可获得两项检测结果，特别适用于通常需在不同反应孔中分别进行的同种型检测应用5。双报告通道功能可在一半数量的反应孔中、使用一半的样本体积，获得每个样本两倍的数据，因此相较于单报告系统具有明显优势。本研究详细阐述了标准血清学检测方案，并描述了其向中和检测的转化过程。此外，本文还介绍了将单报告检测转化为双报告血清学检测，进而转化为双报告中和检测的方法，以同时测定针对SARS-CoV-2 S蛋白、RBD及Nc抗原的IgG和IgM同种型中和抗体。检测流程的可视化概览见图1。

方案

本研究使用了先前用于SARS-CoV-2诊断分析的剩余人血清样本，该研究已获得罗切斯特大学机构审查委员会的批准。

1. 试剂与设备

  1. 从商业来源获取冠状病毒抗原以及人源 IgG 和 IgM。
  2. 从仪器供应商处获取质控（AC）微球试剂盒（编号 45 和 220）。AC 微球试剂盒 45 用于监测单报告通道（RP1）仪器上的中位荧光强度（MFI）采集情况，AC 微球试剂盒 220 用于监测第二报告通道（RP2）上的 MFI 采集情况。
  3. 获取检测抗体，以及用于偶联验证的抗原特异性兔血清和抗体。
  4. 使用生物素标记的抗体进行检测，检测时可选用链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）或链霉亲和素-荧光染料 Super Bright 436 偶联物（SASB；激发波长 405 纳米（nm），发射波长 436 nm）。
  5. 获取人 ACE2 蛋白（即 SARS 受体）。使用前，将冻干的 ACE2 蛋白溶于无核酸酶水（非 DEPC 处理，经高压灭菌并用 0.2-µm 滤膜除菌）中，配制成 1 mg/mL 的浓度，并在 4 °C 下保存。
  6. 所有反应均在 96 孔非结合表面（NBS）黑色平底板中进行。在检测孵育步骤中，使用 96 孔微孔板铝膜密封。洗涤步骤使用磁板分离器进行。

2. 抗原偶联和抗体偶联对照微球的制备

  1. 按照 Cameron 等人1所述方法，将磁性、聚苯乙烯、颜色编码的微球（直径 6.5 µm）与 S、RBD 和 Nc 抗原共价偶联。冠状病毒抗原的偶联浓度为：S 抗原 10 pmol/106 微球，RBD 和 Nc 抗原均为 100 pmol/106 微球。对照微球使用人 IgG 或 IgM 进行偶联，制备方法见先前文献1，IgG 和 IgM 的偶联浓度为 5 µg/106 微球。
  2. 偶联完成后，测定微球浓度，并按照所述程序6将每种储备液稀释至 1 × 106 微球/mL。
  3. 按照 Cameron 等人1所述方法，使用兔源抗原特异性抗体或阳性人血清验证抗原偶联效果。
    1. 使用本检测中的生物素化抗人 IgG/SAPE 检测试剂验证人 IgG 的偶联，使用藻红蛋白（PE）标记的山羊抗人 IgM 验证 IgM 的偶联。
      注：由于尚不明确这些试剂的最佳使用浓度，因此需通过抗原特异性血清或抗体的梯度稀释实验进行偶联验证。对于血清，采用连续倍比稀释；对于以 mg/mL 为单位的抗体原液，则采用连续 µg/mL 稀释系列。
  4. 在用于多重微球混合液之前，将用于监测两个报告通道 MFI 采集的检测对照（AC）微球稀释至 1 × 106 微球/mL 的浓度。

3. 新鲜多重微球混合液的制备

  1. 每天新鲜配制多重微球混合液，从各自偶联微球和对照微球储备液中配制，浓度为 1 × 106 个微球/mL。
    ​注意：多重微球混合液的配制应确保在 50 µL 体积中每种微球区域含有 2,500 个微球。有关如何为任意数量反应配制多重微球混合液的计算方法，参见 Angeloni (2020)6 发表的博客。

4. 样品稀释

  1. 通过混合10 μL血清样本与990 μL稀释液，制备1:100的血清样本稀释液 µL 血清加入 990 µ含0.05% Tween 20、0.02%叠氮化钠和1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBS-TBN缓冲液）
  2. 将样本再次稀释10倍，加入20 µ1:100 稀释液的 L 加至 180 µL PBS-TBN
    ​注意：血清样本包括阴性血清（来自2019年即COVID-19大流行前采集的标本）和阳性血清（来自SARS-CoV-2 PCR阳性患者），代表低滴度和高滴度抗体水平。阳性样本采集于 ≈3 至 >症状出现后60天（DFSO）。所有血清样本和IgG去除的阴性对照血清按如下所述稀释至1:1000。中和试验中，血清按如下中和试验方案（第6和第8节）所述稀释至1:500。

5. 单报告基因血清学检测方案

  1. 向每孔分配好的 96 孔非结合微孔板中加入 50 µL 多重微球混合液。
  2. 用移液器向相应孔中加入 50 µL 1:1000 稀释的血清或 PBS-TBN；孔中血清的最终稀释度为 1:2000。
  3. 用微孔板铝箔封膜覆盖板孔，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  4. 从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
  5. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
  6. 在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。
  7. 按以下步骤洗涤反应孔（第一次样品孵育后洗涤）。
    1. 将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
    5. 在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。
  8. 按以下步骤洗涤反应孔（第二次样品孵育后洗涤）。
    1. 将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
    5. 将微孔板从磁板上取下。
  9. 将生物素标记的抗人 IgG 与 SAPE 新鲜混合，将抗体稀释至 0.62 µg/mL，SAPE 稀释至 1 µg/mL，然后向每孔加入 100 µL。
  10. 用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  11. 从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
  12. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
  13. 在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。
  14. 按以下步骤洗涤反应孔（第一次检测抗体孵育后洗涤）。
    1. 将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从板式振荡器上取下微孔板，放回磁板上静置 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
    5. 在保持微孔板置于磁板上的同时，用吸水纸轻压微孔板底部吸除残留液体。
  15. 按以下步骤洗涤反应孔（第二次检测抗体孵育后洗涤）。
    1. 将微孔板从磁板上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖微孔板，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从板式振荡器上取下微孔板，放置于磁板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁板上，取下铝箔封膜，小心将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻甩去孔内上清液。
    5. 将微孔板从磁板上取下。
  16. 向每孔加入 100 µL PBS-TBN。
  17. 用铝箔封膜覆盖，于 37 °C 振荡 2 分钟。
  18. 从板式振荡器上取下微孔板，取下铝箔封膜，按照用户手册在流式分析仪上读取每孔 50 µL 样品。以下提供简要说明。
    1. 点击屏幕左上角的下拉菜单，进入板配置界面。
    2. 选择运行板。
    3. 点击弹出图标，弹出板载架。
    4. 将微孔板放入板载架，点击收回图标，将板载架收回。
    5. 点击运行图标，开始运行微孔板。

6. 单一报告基因中和实验方案

  1. 按照上述第3节所述方法，制备新鲜的多重微球混合液。
  2. 将患者和对照血清稀释1:500，步骤如下：
    1. 取10 µL血清加入990 µL PBS-TBN中，制成1:100稀释血清。
    2. 取40 µL 1:100稀释血清加入160 µL PBS-TBN中，进一步稀释5倍。
  3. 向96孔非结合型微孔板的每个指定孔中加入50 µL多重微球混合液。
  4. 向每孔中加入25 µL浓度为2 µg/mL的ACE2稀释液。
  5. 用微孔板铝箔封膜密封板孔，置于加热板式振荡器上，37 °C、600 rpm条件下振荡孵育2分钟。
  6. 从振荡器上取出微孔板，揭去铝箔封膜。
  7. 向指定孔中加入25 µL 1:500稀释的血清或PBS-TBN。
  8. 用微孔板铝箔封膜密封板孔，置于加热板式振荡器上，37 °C、600 rpm条件下振荡孵育15分钟。
  9. 后续实验步骤，请参照上述5.4至5.18.5步骤进行。

7. 转换为双报告基因 IgG 和 IgM 血清学检测方法

  1. 按照上述第2节所述制备抗原偶联微球。
    注意：额外加入一组与人IgM偶联的微球，用于监测抗IgM检测试剂的添加情况；同时加入另一组AC微球（220），用于监测RP2的MFI采集。所有微球储备液浓度均为1 × 106 个微球/mL，用于按如下说明配制多重微球混合液。
  2. 按照上述第3节所述新鲜配制多重微球混合液。
  3. 按照上述第4节所述，将血清样本和去IgG阴性对照血清稀释至1:1000。
  4. 向96孔非结合微孔板中每个指定孔加入50 µL多重微球混合液。
  5. 用移液器向相应孔中加入50 µL 1:1000稀释的血清或PBS-TBN，孔中血清的最终稀释倍数为1:2000。
  6. 用微孔板铝箔封膜覆盖板子，置于37 °C加热板式振荡器上，以600 rpm振荡孵育15分钟。
  7. 从振荡器上取下板子，放置于磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。
  8. 保持板子在磁板上，移除铝箔封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。
  9. 在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。
  10. 按以下步骤洗涤反应孔（样品孵育后第一次洗涤）。
    1. 将板子从磁板上取下，向每孔加入150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖板子，于37 °C以600 rpm振荡2分钟。
    3. 从振荡器上取下板子，放回磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持板子在磁板上，移除封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。
    5. 在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。
  11. 再次使用PBS-TBN洗涤反应孔（样品孵育后第二次洗涤），步骤与上述7.10.1–7.10.5完全相同。
  12. 将板子从磁板上取下。
  13. 新鲜配制所需组合的检测试剂混合液，并向每孔加入50 µL或100 µL。
    注意：由于可用的储备试剂有限，含与BV421报告染料（激发波长405 nm，发射波长421 nm）偶联的抗人IgG抗体的检测试剂混合液每孔使用50 µL；其他所有检测试剂混合液每孔使用100 µL。
  14. 用微孔板铝箔封膜覆盖板子，置于37 °C加热板式振荡器上，以600 rpm振荡孵育15分钟。
  15. 从振荡器上取下板子，放置于磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。
  16. 保持板子在磁板上，移除铝箔封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。
  17. 在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。
  18. 使用PBS-TBN按以下步骤洗涤反应孔（检测抗体孵育后第一次洗涤）。
    1. 将板子从磁板上取下，向每孔加入150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖板子，于37 °C以600 rpm振荡2分钟。
    3. 从振荡器上取下板子，放回磁板分离器上2分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持板子在磁板上，移除封膜，小心将板子倒置于废液容器上方，轻轻甩出各孔中的上清液。
    5. 在仍保持板子置于磁板上的同时，将板子在吸水纸上轻拍以去除残留液体。
  19. 再次使用PBS-TBN洗涤反应孔（检测抗体孵育后第二次洗涤），步骤与上述7.17.1–7.17.5完全相同。
  20. 将板子从磁板上取下。
  21. 向每孔加入100 µL PBS-TBN。
  22. 用铝箔封膜覆盖，于37 °C振荡2分钟。
  23. 从振荡器上取下板子，移除封膜，按照上述步骤5.18.1–5.18.5所述，用流式分析仪读取每孔50 µL样本。

8. 转换为双报告基因中和实验

  1. 使用如上步骤 7.1 所述的偶联微球。
  2. 按照步骤 7.2 所述制备新鲜的多重微球混合液。
  3. 将血清样本和 IgG 去除的阴性对照血清按 1:500 进行稀释，方法如下：
    1. 通过将 10 µL 血清加入 990 µL PBS-TBN 中，制备 1:100 的稀释液。
    2. 将 1:100 的稀释液进一步稀释 5 倍：取 40 µL 的 1:100 稀释液加入 160 µL PBS-TBN 中。
  4. 向 96 孔非结合微孔板的每个指定孔中加入 50 µL 多重微球混合液。
  5. 向每孔中加入 25 µL 浓度为 2 µg/mL 的 ACE2 稀释液。
  6. 用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 2 分钟。
  7. 从振荡器上取下微孔板，移除铝箔封膜。
  8. 向指定孔中加入 25 µL 1:500 稀释的血清或 PBS-TBN。
  9. 用铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  10. 从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
  11. 保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。
  12. 在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。
  13. 按以下方法清洗反应孔（第一次样品孵育后洗涤）：
    1. 将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。
    5. 在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。
  14. 再次使用 PBS-TBN 清洗反应孔（第二次样品孵育后洗涤），操作与上述步骤 8.13.1–8.13.5 完全相同。
  15. 将微孔板从磁体上取下。
  16. 根据所需试剂组合制备新鲜的检测试剂混合液，并向每孔中加入 50 µL 或 100 µL。
    注：由于储备试剂用量有限，含与 BV 报告染料偶联的抗人 IgG 的检测试剂混合液每孔使用 50 µL（参见材料表）。其他所有检测试剂混合液每孔使用 100 µL。
  17. 用微孔板铝箔封膜覆盖，置于 37 °C 加热板式振荡器上，以 600 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  18. 从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
  19. 保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。
  20. 在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。
  21. 按以下方法清洗反应孔（第一次检测抗体孵育后洗涤）：
    1. 将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。
    5. 在保持微孔板处于磁体上的同时，用吸水纸轻拍微孔板底部以吸除残留液体。
  22. 再次使用 PBS-TBN 清洗反应孔（第二次检测抗体孵育后洗涤），操作与上述步骤 8.21.1–8.21.5 完全相同。
    1. 将微孔板从磁体上取下，向每孔中加入 150 µL PBS-TBN。
    2. 用新的铝箔封膜覆盖，于 37 °C 以 600 rpm 振荡 2 分钟。
    3. 从振荡器上取下微孔板，置于磁性板分离器上 2 分钟，使微球与反应混合液分离。
    4. 保持微孔板在磁体上，移除铝箔封膜，小心地将微孔板倒置于废液容器上方，轻轻弹击以去除各孔中的上清液。
    5. 将微孔板从磁体上取下。
  23. 向每孔中加入 100 µL PBS-TBN。
  24. 用铝箔封膜覆盖，于 37 °C 振荡 2 分钟。
  25. 从振荡器上取下微孔板，移除铝箔封膜，按照步骤 5.18.1–5.18.5 所述，用流式分析仪读取每孔 50 µL 的信号。

结果

单报告分子血清学检测的优化。
所有 SARS-CoV-2 抗原的偶联策略已在 Cameron 等人，20201 以及上述步骤 2.1 中描述。偶联确认策略在上述步骤 2.3 中说明。为实现高效偶联，中位荧光强度（MFI）值应显著高于无血清/无抗体阴性对照反应，并且随着检测试剂用量减少，MFI 信号应呈现剂量依赖性下降。通常，MFI 信号比背景 MFI 高约 1,000 MFI 单位或以上，表明蛋白偶联效率良好，该结果依赖于所用检测试剂的浓度和特异性。采用该方法，对两批微球进行了 S、RBD 和 Nc 抗原偶联的验证（图 2）。所有抗原的 MFI 信号均显著高于背景 MFI，并在检测试剂梯度稀释时表现出剂量反应关系。数据还显示，两批不同偶联微球之间的 MFI 水平具有良好的可重复性。

单报告基因检测的优化方法如 Cameron 等人，20201 所述进行。每种抗原以不同的偶联浓度，分别与代表高、中、低及阴性水平的多个血清样本的不同稀释度进行测试。此外，由于该检测用于测定 IgG 滴度，因此还使用经 IgG 去除处理的血清作为额外的阴性对照样本。不同抗原偶联水平下代表性样本稀释系列的结果如图3所示。该初步稀释系列采用固定浓度的检测试剂进行检测，以获得具有代表性的抗原特异性及背景 MFI 水平的可能范围。根据这些数据，进一步确定并测试了额外的样本稀释范围和抗原偶联水平（数据未显示）。

接下来，针对不同的血清稀释度和抗原偶联水平，优化了检测试剂的浓度。图4展示了使用6份阳性样本和2份阴性样本的代表性数据。在进一步测试了数百份新冠流行前的阴性血清样本后，如第5节所述，确定了最终检测方案中最佳的抗原偶联水平和检测试剂浓度。

转化为单报告基因中和试验
通过在加入血清样本之前，使用ACE2（作为竞争性试剂）与磁珠进行孵育，可将单报告基因血清学检测转化为中和试验。通过滴定所添加ACE2的量，可观察到IgG与S蛋白和RBD抗原结合受到抑制，如图5所示。尽管11份患者血清中IgG滴度各不相同，但随着ACE2浓度增加，每份血清的MFI信号均显著降低。与预期一致，ACE2仅影响S蛋白和RBD的MFI信号，而对Nc抗原无影响。

所有样品相对于0 µg/mL ACE2的MFI信号残余百分比见图6。对于大多数样品，随着ACE2浓度增加，S蛋白和RBD的信号损失均超过>30%。如预期所示，ACE2对Nc信号无影响。

转化为双报告基因IgG和IgM血清学检测方法
在双报告基因IgG和IgM检测中，采用标准的单报告基因检测条件，测试了两种报告基因通道中不同抗体与报告分子的组合。RP1通道与以往的流式分析仪器类似，可检测PE等报告染料的“橙色”荧光。第二个通道RP2则采用紫光激发激光，用于检测在402 nm激发、发射光谱峰值位于421–441 nm范围内的染料所发出的“蓝色”荧光。

测试了多种不同浓度的抗人IgG和IgM抗体组合，样本稀释倍数为标准的2,000倍，孵育条件详见第6节。初步测试使用与DyLight 405报告染料（DL 405；激发波长400 nm，发射波长420 nm）偶联的抗IgM抗体作为RP2通道的检测试剂，共检测了11份PCR阳性样本，其症状出现后天数（DFSO）范围为5至>60天，另加一份IgG去除血清样本。该检测试剂在RP2通道中未产生较强的信号，如图7A、B、C所示。对于IgM RP2 MFI较高的样本，RBD和Nc抗原的信号最强（图7B、C）。尽管部分样本在此阶段IgM滴度应有所升高，但使用该IgM检测试剂时，观测到的MFI值均未超过140 MFI单位。此外，与相同浓度下使用的PE标记抗IgM RP1报告试剂相比，抗IgM偶联DL 405时，IgM对照微球的MFI动态范围明显不足（图7D）。

由于缺乏适用于IgM的合适RP2报告标记检测试剂，因此测试了原始的生物素标记抗IgG抗体与SASB联用在RP2通道中的应用效果。使用SASB时，IgG在RP2通道中的信号动态范围虽不及SAPE，但仍具有适合检测S、RBD和Nc特异性IgG滴度的范围（图8）。这些结果促使我们进一步测试了不同的RP1 IgM和RP2 IgG检测试剂组合，如下所述。

转换为双报告基因中和试验
通过在添加血清样本之前增加一步与ACE2和磁珠的孵育，将双报告基因血清学检测法转换为中和试验。使用起始浓度为16 µg/ml的ACE2进行2倍系列稀释，并按照上述方法对11个样本组及去抗体血清进行检测。此外，还测试了三种不同的RP1 IgM和RP2 IgG检测抗体组合，所用样本包括11个样本组及去抗体血清对照。最终确定的最佳组合及试剂浓度详见表1。

在IgG检测中，测试了原始单报告分子检测中使用的生物素标记抗人IgG/SASB以及另一种与BV报告染料偶联的抗IgG。尽管BV偶联物在RP2上的MFI信号较高，但其IgG滴度的MFI信号强度在不同ACE2滴定浓度下存在差异（图9A、C、E）。与BV偶联物相比，生物素标记抗人IgG/SASB组合在ACE2滴定过程中表现出更一致的MFI信号下降趋势，显示出剂量反应关系，尽管其MFI信号水平较低。此外，BV偶联物在不同ACE2浓度下的信号波动也干扰了在不同IgG滴度范围内准确评估ACE2抑制率的能力，而生物素标记抗人IgG/SASB组合则无此问题（图9B、D、F）。对于MFI信号较低的样本（如DFSO 3样本），其滴度不足以评估这些试剂的性能或测定IgG的中和能力。

为确定RP1通道中的IgM滴度，将PE标记的抗IgM抗体与DyLight 549报告染料标记的抗人IgM抗体（DL 549；激发波长562 nm，发射波长576 nm）在表1所列浓度下进行了比较。在这两种试剂中，PE标记的抗IgM抗体在所测试样本中产生的平均荧光强度（MFI）高于DL 549标记的抗人IgM抗体（图9A、C、E）。用于检测试剂添加情况的IgM对照微球，其平均MFI值分别为：PE标记抗IgM约17,000，DL 549偶联物为2,723。尽管存在这些差异，使用DL 549偶联物仍可检测到不同ACE2浓度对MFI的影响。在测定ACE2对IgM结合的抑制百分比时，两种IgM检测试剂之间差异微小且无统计学意义（图9B、D、F）。

组合报告分子孔中终浓度 (µg/mL)
RP1RP2
1PE 标记抗 IgM2-
生物素标记 Ig-0.62
SASB-4
2DyLight 549 标记抗人 IgM1-
Brilliant Violet 421 标记抗人 IgG-1
3DyLight 549 标记抗人 IgM1-
生物素标记 Ig-0.62
SASB-4

表1：测试的RP1和RP2报告染料组合列表。评估了多种不同的RP1和RP2报告染料，用于检测IgG和IgM滴度。上述三种组合在不同的RP1检测模式下进行了测试，并用于中和实验的优化。对于使用SASB的RP2组合，显示了生物素化检测抗体和SASB的浓度。*最终浓度表示在反应孔中的最终浓度。

血清学与中和试验工作流程图；微球混合、孵育、检测步骤。
图 1：突出显示主要检测实验方案步骤的流程图。请点击此处查看此图的放大版本。

S、RBD、Nc蛋白偶联确认，条形图显示MFI与血清稀释度的关系，抗体分析。
图2：抗原偶联的确认。 抗原以每106个微球分别偶联100、10和1 pmol的剂量进行偶联。对于S和RBD抗原，使用兔抗S血清，并用PE标记的抗兔IgG进行检测。对于Nc抗原，使用Protein G纯化的兔多克隆抗Nc抗体。图中显示了偶联10 pmol S抗原（A）、100 pmol RBD抗原（B）和100 pmol Nc抗原（C）的微球的滴定曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

偶联优化柱状图；稀释度与MFI；血清比较；图表A、B、C。
图3：不同抗原偶联水平下血清稀释度的优化。 使用不同 pmol 抗原/106 微球的偶联条件，检测了代表高、中、低及阴性水平的血清样本。采用第5节所述检测方案，对4倍梯度稀释的血清样本使用多种偶联抗原微球混合物进行检测。图中显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）抗原滴定曲线的MFI值。 请点击此处查看该图的放大版本。

ELISA 优化柱状图；抗体检测数据分析，样本与浓度比较。
图 4：确定最佳血清稀释度和检测试剂浓度。 对8份血清样本（包括2份阴性患者样本和6份低至高阳性的样本）在不同血清稀释度下，使用三种不同浓度的检测试剂进行了检测。S蛋白（A）、RBD（B）和Nc（C）的MFI结果如图所示。根据本实验及其他未展示的数据，最终选择1:2,000的样本稀释度和0.62 µg/mL的生物素标记检测抗体浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

中和反应优化柱状图；A-C，ACE2 μg/mL 与 HmL；血清分析结果。
图 5：单报告基因中和实验的优化。 如第6节所述，通过加入以ACE2作为竞争物的孵育步骤，将单报告基因血清学实验改进为中和抗体检测实验。采用标准实验条件，对一组共11个样本（涵盖低至高滴度的阳性血清）以及一个IgG吸附型血清样本，使用起始浓度为4 µg/mL的ACE2进行两倍系列稀释后进行检测。在此ACE2浓度范围内，S抗原（A）和RBD抗原（B）的MFI值随ACE2浓度增加而降低，但Nc抗原（C）无此现象。请点击此处查看该图的放大版本。

抑制信号分析，S，RBD，Nc；柱状图，与ACE2结合的剩余MFI百分比；数据比较。
图6：与ACE2结合时信号的抑制百分比。 显示了11个样本（来自图4）的剩余信号百分比。对于每个样本，无论其IgG滴度如何，在最高浓度的ACE2条件下，S抗原（A）和RBD抗原（B）的MFI信号最大降低均达到或超过30%。而对于Nc抗原（C），在所测试的任何浓度ACE2下均未观察到显著的信号抑制。请点击此处查看该图的放大版本。

显示免疫分析中不同浓度下IgM和IgG RFU信号的柱状图。
图7：使用DyLight 405标记的抗IgM作为RP2 IgM检测试剂的测试。 采用一组11个样本及IgG去除血清，测试DL 405标记的抗IgM作为RP2检测试剂的效果。图中显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）的RP2 IgM MFI信号。在所有样本和抗原中，RBD与样本H组合产生的MFI信号最高，约为140 MFI单位（B）。即使在IgM对照微球组上，整个抗体滴度范围内RP2通道的信号也低于1,000 MFI，且未表现出在RP1通道中使用PE标记抗IgM检测抗体时所观察到的动态范围增加现象（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。

分析S、RBD、Nc IgG RP2信号的柱状图；血清样本比较。
图8：使用Biotin anti-IgG作为RP2报告分子优化SASB。 采用一组11个样本及IgG去除血清，测试在标准0.62 µg/mL Biotin anti-IgG条件下SASB的系列稀释效果。结果显示了S（A）、RBD（B）和Nc（C）在RP2通道中的IgG MFI值。请点击此处查看该图的放大版本。

显示比较分析结果的多个数据表；高亮部分揭示了变化趋势。
图9：三种不同RP1 IgM与RP1 IgG检测试剂混合物的比较。 在11个样本和IgG去除血清上测试了三种不同的检测抗体混合物。所用组合及最终浓度详见表1。所有样本均使用2倍稀释的ACE2，起始浓度为16 µg/mL。展示了病程第3天（DFSO 3）、第12天（DFSO 12）和第30天（DFSO 30）样本的数据。RP1 IgM（橙色）和RP2 IgG（蓝色）的MFI信号分别显示在A（DFSO 3）、C（DFSO 12）和E（DFSO 30）中。ACE2残余MFI百分比分别显示在B（DFSO 3）、D（DFSO 12）和F（DFSO 30）中。与无ACE2对照组相比，信号降低>30%的结果以浅绿色高亮显示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究拓展了一种多重荧光微球检测方法3Flex的功能，该方法可定性评估针对SARS-CoV-2感染的IgG免疫应答1。尽管目前许多针对COVID-19的血清学检测仅检测单一抗原，但该检测可同时评估S、RBD和Nc抗原，并包含内部抗体同种型对照7。此外，该方法使用ACE2作为指示剂，用于检测针对SARS-CoV-2的中和抗体滴度。

多抗原检测在未来可能特别有助于区分感染者与疫苗接种者的免疫反应。对于SARS-CoV-2，如果仅评估S蛋白和RBD抗体，则无法判断抗体反应是源于既往感染还是疫苗接种。目前所有在用的疫苗均未靶向Nc抗原，因此通过同时检测S/RBD和Nc抗原，可以区分既往病毒感染（Nc和S/RBD抗体阳性）与疫苗接种反应（仅S/RBD抗体阳性，Nc抗体阴性）。

在本研究中，3Flex 血清学和中和试验（第5和第6节）已转移至一种新型双报告基因流式分析仪器（第7和第8节）。基于微球的多重检测的典型免疫测定方案与标准ELISA方案相似，均遵循类似的步骤，包括样本孵育、检测抗体/报告分子孵育以及结果分析8。先前的研究也已证明，标准ELISA检测可成功转移至基于微球的多重检测平台9。

检测方案可从之前的单报告基因仪器无缝转移至新的双报告基因系统，测试样本和对照的结果证实了这一点（图4 和 图5）。在血清学检测中，所有阳性血清样本均表现出典型的剂量依赖性信号下降，该下降与样本稀释倍数增加及检测抗体浓度降低相对应，而阴性样本的信号则保持在背景水平。类似地，在中和检测中，S蛋白和RBD的信号随ACE2竞争物浓度的增加而降低，而Nc蛋白的信号则无此变化；相比之下，经IgG去除处理的血清在加入ACE2后信号变化较小。将磁珠与ACE2预先孵育2分钟后再加入血清样本（如第6和第8节所述），与将磁珠、ACE2和血清同时混合的方法进行了比较，结果显示两者差异不大（数据未显示）。然而，由于采用磁珠与ACE2预孵育步骤所得结果更为一致，因此该步骤被最终确定为中和检测方案的正式操作流程（第6和第8节）。

由于双报告系统引入了第二个荧光报告通道，因此将两种检测方法均改造为分型检测，以同时测量IgG和IgM反应。流式分析仪的双报告功能可在每个样本的多重检测中，针对每种分析物收集两种报告检测试剂的荧光信号，从而有效使每个样本在单次检测中产生的数据量翻倍。为开发和优化双报告检测方案，评估了多种市售的报告染料和检测抗体在新RP2通道中的表现（图7 和 图8），以确定当前可用的最佳选项。与DL 405报告染料偶联的抗IgM抗体在RP2通道中表现不佳（图7），因此后续评估了生物素标记的抗IgG抗体联合SASB在RP2通道中的检测效果（图8）。在双报告中和检测中，比较了三种RP1与RP2检测试剂的组合（表1 和 图9），以确定同时检测IgG和IgM中和抗体的最佳组合。尽管在使用PE-抗IgM的RP1通道与使用DL 549-抗IgM的RP2通道之间，信号强度存在显著差异，但在ACE2的结合抑制率测定结果上并无显著差异。

目前的方法和本研究存在若干局限性。首先，方法开发和优化过程中测试和使用的样本数量仅限于8至11个样本。在后续扩大研究中将测试更多样本，以验证该方法是否已完全优化。其次，所测试的报告荧光染料及报告染料组合数量有限。未来需对所有可用报告染料进行所有可能组合的进一步测试，以确定哪些试剂可在本方法中成功应用。实验中使用的与生物素偶联的抗IgG抗体不同于与BV 421报告染料偶联的抗IgG抗体。因此，尽管BV 421标记的抗IgG信号强度存在变异，但这种差异可能源于抗体特异性，而非报告染料本身所致。测试其他可用的BV 421偶联抗体，可能发现另一种在RP2通道中表现良好的抗体。后续研究还将评估PE标记的抗IgM与BV 421标记的抗人IgG组合，分别用于RP1和RP2通道的检测。最后，尽管仪器具备双报告通道功能，但每个反应仅限检测两种同种型（两个参数）。若需检测更多同种型或实现完整的同种型分析，则需在不同孔中使用相同的两个报告通道进行额外的独立反应。

基于微球的多重检测技术可实现快速灵活的实验设计，并易于整合到常规实验室工作流程中3,4,10。本研究展示了将先前描述的SARS-CoV-2 3Flex血清学和中和抗体检测方法转移至流式分析系统的过程简便性：使用单一报告分子可检测IgG，或经轻微修改后，利用两种报告分子同时检测IgG和IgM反应。与单报告分子平台相比，双报告分子方案具有明显优势，因其可在反应孔数量减半、样本用量减半的情况下，获得每样本两倍的数据量。通过选用合适的报告荧光染料和检测抗体，可在双报告分子流式分析仪上轻松开发并执行分型检测。

披露

Stephen Angeloni 和 Sherry Dunbar 是 Luminex Corporation 的员工，该公司生产了本研究中使用的一些试剂和仪器。 本文的开放获取出版由 Luminex Corporation 资助

致谢

本报告由美国奥斯汀的Luminex公司资助。作者感谢马修·西尔弗曼博士（Biomedical Publishing Solutions，佛罗里达州德尔雷比奇）在科学编辑方面提供的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACE2（人源）（重组）AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
生物素-SP（长间隔）AffiniPure 山羊抗人 IgG，Fcγ 片段特异性Jackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
牛血清白蛋白MilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 清洗/水浴超声仪Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure 驴抗人 IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96 孔黑色平底聚苯乙烯 NBS 微孔板Corning3650
Corning 96 孔微孔板铝封膜（非无菌）Corning6570
DyLight 405 AffiniPure 山羊抗人 IgM，Fc5μ 片段特异性Jackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 山羊抗人 IgM Fc5μ 特异性Jackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129已停产，但可从多个供应商处获得
eBioscience 链霉亲和素 Super Bright 436 偶联物ThermoFisher Scientific62-4317-82
Fisherbrand 微孔板孵育振荡器ThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，PE 标记ThermoFisher ScientificP-2771MP
Luminex 磁性微孔板分离器Luminex CorporationCN-0269-01
MagPlex 微球Luminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 山羊抗人 IgM Fc5μ 特异性Jackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
磷酸盐缓冲液MilliporeSigmaP3813Sigma-Aldrich
SARS 核衣壳蛋白抗体Novos BiologicalsNB100-56683未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化
SARS 核衣壳蛋白抗体Novos BiologicalsNB100-56049未偶联，兔源，多克隆，Protein A 纯化
SARS 刺突蛋白抗体Novos BiologicalsNB100-56047未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化
SARS 刺突蛋白抗体Novos BiologicalsNB100-56048未偶联，兔源，多克隆，Protein G 纯化
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白 S1 抗体，兔单克隆抗体SinoBiological40150-R007
叠氮化钠MilliporeSigmaS2002Sigma-Aldrich
链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）ThermoFisher ScientificS21388优级品
试管旋转混合仪ThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP 抗体偶联试剂盒Luminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO

参考文献

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).
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  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

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bead IgG IgM ACE2

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