基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测 SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

摘要

本文所述方案介绍了HiBiT-受体结合域蛋白复合物的制备方法及其在快速、灵敏检测SARS-CoV-2抗体中的应用。

摘要

新型冠状病毒病（COVID-19）大流行的出现，增加了对更优血清学检测方法的需求，以评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的流行病学影响。随着SARS-CoV-2感染病例数量不断上升，对更高效的抗体检测方法的需求也日益迫切。目前的抗体检测方法往往在灵敏度与检测速度之间做出权衡：或牺牲灵敏度以提高速度，或虽具高灵敏度但耗时较长。大量SARS-CoV-2中和抗体以受体结合域（RBD）为靶标，而RBD是SARS-CoV-2主要的免疫原性结构域之一。我们近期设计并开发了一种高灵敏度的生物发光标记RBD（NanoLuc HiBiT-RBD），用于检测SARS-CoV-2抗体。下文描述了制备HiBiT-RBD复合物的步骤，以及利用该工具快速检测靶向RBD抗体的实验方法。由于HiBiT-RBD蛋白产物在较宽温度范围内具有良好的稳定性，且实验流程较短，可在1小时内完成，因此该方案可被视为检测患者血清样本中SARS-CoV-2抗体的一种更高效的替代方法。

引言

新型冠状病毒SARS-CoV2的近期出现¹截至3月30日，已导致超过280万例死亡和1.28亿例感染^th, 2021²由于缺乏可靠且成熟的SARS-CoV-2临床治疗方案，人们已做出诸多努力以限制病毒的进一步传播，更重要的是，致力于开发有效的、可靠的治疗方法或疫苗³迄今为止，世界卫生组织报告已有50多种COVID-19疫苗候选物处于临床试验阶段⁴检测抗SARS-CoV-2抗体对于确定疫苗接种后体液免疫应答的长期稳定性以及评估COVID-19康复患者的免疫状态具有重要意义⁵一些研究表明，康复的 SARS-CoV-2 患者在 1 年后可能会失去大部分针对 RBD 的结合抗体^5,6,7,8,9需要进一步研究以更好地理解持久免疫力，而更灵敏的抗体检测平台将有助于推动相关工作。关于轻症 SARS-CoV-2 感染后免疫力持续存在的报道提示可能存在长期抗体应答，这也是一个值得关注且有价值的研究方向。快速且准确的检测方法对于监测个体血清中的抗体至关重要，可为了解人群免疫状况提供更多信息。

与其他冠状病毒类似，SARS-CoV-2 通过其突出的刺突糖蛋白与血管紧张素转换酶-2（ACE2）结合，从而启动一系列事件，导致病毒膜与细胞膜融合^6,7。最近多项研究已证实，刺突蛋白的受体结合域（RBD）在引发针对 SARS-CoV-2 的强效且特异性抗体反应中起关键作用^8,9,10,11。特别是 Premkumar 等人观察到患者血浆中 RBD 结合抗体滴度与 SARS-CoV-2 中和活性之间存在相关性，这进一步支持 RBD 是病毒结构中具有免疫原性的区域⁹。鉴于此，目前可用于检测 SARS-CoV-2 抗体的许多诊断方法耗时且成本较高，需要长时间的孵育和洗涤步骤（如酶联免疫吸附测定 [ELISA]），或存在灵敏度和准确性不足的问题（如侧向流动免疫分析 [LFIA]）¹²。因此，开发一种定量、快速、高灵敏度、响应迅速且相对低成本的 COVID-19 来源抗体血清学补充检测方法，将有助于满足 SARS-CoV-2 流行病学监测对可靠血清学检测的需求。

目前血清学检测方法的局限性促使研究人员探索生物发光报告系统作为未来血清学调查中潜在诊断工具的可能性。生物发光是一种自然界中存在的酶与底物反应，伴随光的发射。Nanoluc 荧光素酶是目前已知最小的（19 kDa）且最亮的系统，相较于Renilla 荧光素酶（36 kDa）和萤火虫荧光素酶（61 kDa）具有显著优势^13,14。此外，Nanoluc 在前述系统中具有最高的信噪比和稳定性。其高强度的信号输出使得即使极低水平的报告融合蛋白也能被有效检测¹⁵。Nanoluc 双分子技术（NanoBiT）是 Nanoluc 系统的一种分裂形式，由两个片段组成：小片段 BiT（11 个氨基酸；SmBiT）和大片段 BiT（LgBiT），二者通过低亲和力相互作用（K_D = 190 µM）结合形成发光复合物¹⁶。NanoBiT 已被广泛应用于多种研究中，包括蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定^15,17,18,19以及细胞信号通路的研究^11,20,21。

最近，一种对 LgBiT 具有显著更高亲和力（K_D = 0.7 nM）的小肽被引入，即以 HiBiT Nano-Glo 系统取代 SmBiT。由于 Nano-Glo "加样-混匀-检测" 检测方法具有高亲和力和强信号，HiBiT 成为一种适用于定量检测的发光肽标签。在该方法中，通过构建对目标蛋白结构干扰最小的表达载体，将 HiBiT 标签连接至目标蛋白。HiBiT 与蛋白融合后可主动结合 LgBiT 亚基，形成功能完整的高活性荧光素酶，在加入检测试剂后产生可检测的生物发光信号（图1）。类似地，我们开发了一种基于 HiBiT Nano-Glo 的系统，用于快速测定 SARS-CoV-2 康复个体血清中的中和抗体滴度，并已成功构建了带有 HiBiT 标签的 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）。本文描述了使用常规实验室设备和标准操作流程制备 HiBiT-RBD 生物报告分子的详细方案，并展示了该生物报告分子如何应用于一种快速高效的检测方法，用于检测靶向 SARS-CoV-2 RBD 的抗体。

方案

注意：以下所述方案符合伦理指南，方案编号为 20200371-01H。

1. HiBiT-RBD 生物报告系统的制备与评价

1. 生产足量的HiBiT-RBD生物报告分子
   1. 准备细胞培养
      1. 配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。随后将培养基置于37 °C水浴中预热。
      2. 开启生物安全柜（BSC），使用70% v/v乙醇对柜内表面进行消毒。
   2. 培养细胞系
      1. 从-80 °C或液氮中取出细胞系，在37 °C水浴中解冻。
         注：合适的细胞系应易于培养、转染效率高，并适用于外源蛋白的表达。本实验方案使用人胚胎肾HEK293细胞。
      2. 将解冻后的细胞与至少10 mL完全培养基混合，用移液器将细胞悬液转移至10 cm培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37 °C、5% CO₂、85–95%湿度的细胞培养箱中培养。
      3. 在显微镜下观察细胞，待细胞融合度达到80–90%时，吸除培养基，用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）使细胞从培养皿表面脱落。
         注：HEK293细胞较易脱落，因此洗涤步骤应轻柔操作，以避免细胞意外脱落和损失。
      4. 约5分钟后，在显微镜下观察细胞。若所有细胞均已悬浮，加入至少4 mL培养基，将细胞悬液转移至新的无菌离心管中。使用血细胞计数板计数细胞，并将1 × 10⁶个细胞接种至6孔板的每个孔中用于转染。
         注：24小时后，细胞融合度应达到80%或以上。
   3. HiBiT-RBD质粒的转染
      1. 使用1 µg HiBiT-RBD表达质粒与合适的转染试剂混合。室温孵育10–15分钟，然后将全部混合液体逐滴加入6孔板的各孔中。
         注：请遵循转染试剂生产商提供的转染操作说明。本实验中，将一定量的转染试剂与DMEM混合后加入已用DMEM稀释的质粒（1 µg）中（参见材料表）。可使用含报告基因（如绿色荧光蛋白[GFP]）的质粒作为对照，以监测转染效率。
      2. 次日，将含有转染混合物的培养基更换为完全培养基。转染后48小时观察转染对照孔。
         注：若转染成功且效率较高（超过80%的细胞表达GFP），则细胞已准备好用于收集HiBiT-RBD生物报告分子。该表达载体还包含His标签，可用于纯化蛋白，替代使用总上清液。
      3. 将上清液收集至1.5 mL微量离心管中。向细胞中加入500 µL 1×被动裂解缓冲液（PLB），室温孵育并轻轻振荡15分钟以裂解细胞。
         注：上清液和裂解液可在-20 °C保存至少6个月，完整性仅有轻微损失。根据Azad等人的研究²²，该报告分子在广泛的pH范围（4–12）和温度范围（4–42 °C）内均具有良好的稳定性。
2. 通过荧光素酶检测评估生物报告分子的发光信号
   1. 准备反应组分
      1. 使用上清液作为生物报告分子的来源。
         注：上清液和裂解液均含有HiBiT-RBD生物报告分子，均可用于检测。但基于下述原因，推荐使用上清液作为检测来源。
      2. 使用前将LgBiT和底物稀释至1×（储存浓度为100×）。
         注：有关LgBiT的详细信息，请参见材料表。
   2. 荧光素酶检测
      1. 将每个孔或离心管中的50 µL上清液转移至96孔板中，每孔加入50 µL 1× LgBiT，室温孵育5分钟。
      2. 打开化学发光仪软件，向每孔加入50 µL 1×底物（furimazine），将96孔板放入化学发光仪中，运行检测程序。
         ​注：为防止活性酶在信号检测前消耗底物，应在读板前立即加入底物。

2. 使用快速且灵敏的检测方法检测抗RBD抗体

1. HiBiT-RBD 抗体检测实验
   1. 按照方案第 1.1 节所述方法制备 HiBiT-RBD 生物报告分子。
      注意：建议在后续实验中使用上清液，因其更易于收集，且含有成熟糖基化的蛋白形式。此外，裂解液中含有多种其他蛋白，可能干扰 HiBiT-RBD 与抗体的相互作用。
   2. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 50 µL 含 HiBiT-RBD 的上清液与 1 µg 商品化 SARS-CoV-2-RBD 抗体混合。向溶液中加入 20 µL 免疫球蛋白结合蛋白（Protein G）。用 PBS 补足总体积至 300 µL。
      注意：混合物的总体积可减少至 150 µL。不建议使用更低的总体积，因其可能导致抗体与生物报告分子混合不充分。
   3. 将离心管置于管式振荡器或旋转混合仪上孵育 30 分钟。在 12,000 × g 条件下离心 30 秒，弃去上清液，并用 PBS 洗涤。重复该步骤三次，以去除未结合的 HiBiT-RBD。最后用 50 µL PBS 重悬沉淀，转移至 96 孔板中。
   4. 加入 50 µL 1× LgBiT，静置 5 分钟。随后加入 50 µL 1× NanoLuc 底物，立即使用化学发光仪读取发光信号。

3. 从患者血清样本中高通量检测 SARS-CoV-2 特异性抗体

1. 按照方案第1.1节操作，制备大量HiBiT-RBD生物报告分子，用于高通量检测。
2. 每个样本在96孔板的一个孔中，将20 µL磁珠蛋白G与50 µL HiBiT-RBD上清液混合。向每孔加入10 µL血清样本，并用PBS补足至总体积150 µL。
   注意：如步骤2.1.2所述，应同时使用非特异性IgG（阴性对照）和SARS-CoV-2中和抗体（阳性对照），浓度均为1 µg/mL。此外，也可检测来自免疫小鼠的血清样本中的抗体。本实验中所用血清样本来自渥太华综合医院院区，经批准的程序采集，并获得个体知情同意。
3. 在室温下振荡孵育30分钟。将板置于磁力洗涤仪上，使蛋白G-抗体复合物沉淀。
   注意：磁力洗涤仪的特定结构会将复合物沉淀在各孔的侧壁上。
4. 弃去每孔中间部分的溶液，加入PBS进行洗涤。至少重复洗涤三次，以去除过量的HiBiT-RBD。每孔加入50 µL 1× PBS和50 µL 1× LgBiT，室温孵育至少5分钟。
5. 准备好发光仪软件，然后加入50 µL 1×底物。将板放入仪器中，运行软件并记录信号。比较血清样本、对照样本和背景（空孔）的信号值。

结果

记录了转染细胞的含HiBit-RBD的细胞裂解液及其上清液的信号（图2），以评估合适的蛋白来源。分别使用HiBiT-RBD和LgBit作为对照，数据显示，当两部分单独存在时背景信号较低，而两者结合时产生强信号。因此，HiBiT-RBD与LgBiT的相互作用是形成具有活性的酶、进而实现底物消化和产生生物发光所必需的（图1）。

加入蛋白G有助于抗体沉淀（图3）。该检测用于比较商业化的SARS-CoV-2中和抗体与对照IgG的信号。特异性抗体信号较强，而对照抗体的信号接近发光背景水平（图4A）。使用表达外源RBD的、在M蛋白第51位具有突变（Δ51）的重组减毒溶瘤型水泡性口炎病毒（VSV）对小鼠进行免疫接种。来自免疫小鼠的血清产生了较强的信号，而注射对照VSV的小鼠则无信号（图...

讨论

感染SARS-CoV-2的人数不断上升，以及全球疫苗接种工作的持续推进，迫切需要灵敏且快速的血清学检测方法，以便用于大规模血清学调查。近期研究表明，基于分裂纳米荧光素酶的生物报告系统可用于开发此类检测方法。我们近期开发了HiBiT-RBD生物报告系统，用于设计一种能够快速、可靠地检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体的检测方法（图4C）。

该实验中有几个关键步骤。由于系统效率依赖于RBD蛋白的表达，因此应通过蛋白质印迹法（western blotting）验证蛋白表达水平。此外，必须使用阳性对照（例如针对RBD的商用抗体）和阴性对照抗体。建议添加Nanoluciferase蛋白作为生物发光检测的阳性对照。该蛋白产物还含有His标签，可用于大量血清样本的纯化。

与其它竞争性方法相比，使用该生物报告系统具有多项优势。首先，有经验的操作者可在不到一小时内完成完整的检测流程，显著快于ELISA等现有检测方法。其次，该检测所需的最少样品制备和操作步骤，使其在低成本大规模生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5倍被动裂解缓冲液	Promega	E194A	30 mL
Bio-Plex 手持式磁力洗涤仪	Bio-Rad	171020100
DMEM	Sigma	D6429-500ml
Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E2940	100 mL 试剂盒
胎牛血清（FBS）	Sigma	F1051
HiBiT-RBD 质粒			gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT	Promega	N3030
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce Protein G 磁珠	Thermo Fisher Scientific	88848
PolyJet 体外 DNA 转染试剂	Signagen	SL100688.5
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体	SinoBiological	40592-MM57
Synergy Mx 微孔板读板仪	BioTek		96孔板读板仪，化学发光检测功能
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	2520056	0.25%