基于HiBiT生物报告系统的SARS-CoV-2受体结合域抗体检测 SARS-CoV-2, 受体结合域, 抗体检测, HiBiT, 生物报告系统, 免疫分析, 发光检测, 血清学检测, 病毒中和抗体, 体外检测

摘要

本文所述方案介绍了HiBiT-受体结合域蛋白复合物的制备方法及其在快速、灵敏检测SARS-CoV-2抗体中的应用。

摘要

新型冠状病毒病（COVID-19）大流行的出现，增加了对更优血清学检测方法的需求，以评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的流行病学影响。随着SARS-CoV-2感染病例数量不断上升，对更高效的抗体检测方法的需求也日益迫切。目前的抗体检测方法往往在灵敏度与检测速度之间做出权衡：或牺牲灵敏度以提高速度，或虽具高灵敏度但耗时较长。大量SARS-CoV-2中和抗体以受体结合域（RBD）为靶标，而RBD是SARS-CoV-2主要的免疫原性结构域之一。我们近期设计并开发了一种高灵敏度的生物发光标记RBD（NanoLuc HiBiT-RBD），用于检测SARS-CoV-2抗体。下文描述了制备HiBiT-RBD复合物的步骤，以及利用该工具快速检测靶向RBD抗体的实验方法。由于HiBiT-RBD蛋白产物在较宽温度范围内具有良好的稳定性，且实验流程较短，可在1小时内完成，因此该方案可被视为检测患者血清样本中SARS-CoV-2抗体的一种更高效的替代方法。

引言

新型冠状病毒SARS-CoV2的近期出现¹截至3月30日，已导致超过280万例死亡和1.28亿例感染^th, 2021²由于缺乏可靠且成熟的SARS-CoV-2临床治疗方案，人们已做出诸多努力以限制病毒的进一步传播，更重要的是，致力于开发有效的、可靠的治疗方法或疫苗³迄今为止，世界卫生组织报告已有50多种COVID-19疫苗候选物处于临床试验阶段⁴检测抗SARS-CoV-2抗体对于确定疫苗接种后体液免疫应答的长期稳定性以及评估COVID-19康复患者的免疫状态具有重要意义⁵一些研究表明，康复的 SARS-CoV-2 患者在 1 年后可能会失去大部分针对 RBD 的结合抗体^5,6,7,8,9需要进一步研究以更好地理解持久免疫力，而更灵敏的抗体检测平台将有助于推动相关工作。关于轻症 SARS-CoV-2 感染后免疫力持续存在的报道提示可能存在长期抗体应答，这....

方案

注意：以下所述方案符合伦理指南，方案编号为 20200371-01H。

1. HiBiT-RBD 生物报告系统的制备与评价

1. 生产足量的HiBiT-RBD生物报告分子
   1. 准备细胞培养
      1. 配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。随后将培养基置于37 °C水浴中预热。
      2. 开启生物安全柜（BSC），使用70% v/v乙醇对柜内表面进行消毒。
   2. 培养细胞系
      1. 从-80 °C或液氮中取出细胞系，在37 °C水浴中解冻。
         注：合适的细胞系应易于培养、转染效率高，并适用于外源蛋白的表达。本实验方案使用人胚胎肾HEK293细胞。
      2. 将解冻后的细胞与至少10 mL完全培养基混合，用移液器将细胞悬液转移至10 cm培养皿中，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37 °C、5% CO₂、85–95%湿度的细胞培养箱中培养。
      3. 在显微镜下观察细胞，待细胞融合度达到80–90%时，吸除培养基，用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）使细胞从培养皿表面脱落。
         注：HEK293细胞较易脱落，因此洗涤步骤应轻柔操作，以避免细胞....

结果

记录了转染细胞的含 HiBit-RBD 的细胞裂解液和上清液的信号（图 2），以评估合适的蛋白来源。分别使用 HiBiT-RBD 和 LgBit 作为对照，数据显示，与两部分结合时产生的强信号相比，背景信号较低。因此，HiBiT-RBD 与 LgBiT 的相互作用是产生活性酶以进行底物消化并产生生物发光活性所必需的（图 1）。

加入蛋白G有助于抗体沉淀（图3）。本实验用于比较一种商业化的SARS-CoV-2中和抗体与对照IgG的信号。特异性抗体信号强，而对照抗体信号接近发光本底水平（图4A）。使用表达外源RBD的、携带M蛋白第51位点突变（Δ51）的重组减毒溶瘤型水疱性口炎病毒（VSV）对小鼠进行免疫。与注射对照VSV的小鼠无信号相比，免疫小鼠血清产生了强烈的信号（图4B.......

讨论

感染SARS-CoV-2的人数不断上升，以及全球疫苗接种工作的持续推进，迫切需要灵敏且快速的血清学检测方法，以便用于大规模血清学调查。近期研究表明，基于分裂纳米荧光素酶的生物报告系统可用于开发此类检测方法。我们近期开发了HiBiT-RBD生物报告系统，用于设计一种能够快速、可靠地检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体的检测方法（图4C）。

该实验中有几个关键步骤。由于系统效率依赖于RBD蛋白的表达，因此应通过蛋白质印迹法（western blotting）验证蛋白表达水平。此外，必须使用阳性对照（例如针对RBD的商用抗体）和阴性对照抗体。建议添加Nanoluciferase蛋白作为生物发光检测的阳性对照。该蛋白产物还含有His标签，可用于大量血清样本的纯化。

与其它竞争性方法相比，使用该生物报告系统具有多项优势。首先，有经验的操作者可在不到一小时内完成完整的检测流程，显著快于ELISA等现有检测方法。其次，该检测所需的最少样品制备和操作步骤，使其在低成本大规模生.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5倍被动裂解缓冲液	Promega	E194A	30 mL
Bio-Plex 手持式磁力洗涤仪	Bio-Rad	171020100
DMEM	Sigma	D6429-500ml
Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统	Promega	E2940	100 mL 试剂盒
胎牛血清（FBS）	Sigma	F1051
HiBiT-RBD 质粒			gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT	Promega	N3030
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce Protein G 磁珠	Thermo Fisher Scientific	88848
PolyJet 体外 DNA 转染试剂	Signagen	SL100688.5
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体	SinoBiological	40592-MM57
Synergy Mx 微孔板读板仪	BioTek		96孔板读板仪，化学发光检测功能
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	2520056	0.25%