生物膜力探针（BFP）是一种 原位 动态力谱学（DFS）技术。BFP可用于测量活细胞上分子相互作用的弹簧常数。本方案介绍了通过BFP检测到的分子键的弹簧常数分析方法。
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摘要
摘要
一种生物膜力探针（BFP） recently emerged as a native-cell-surface or 原位 动态力谱学（DFS）纳米工具，可用于测量单分子结合动力学、评估配体-受体相互作用的力学特性、可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋的是可阐明受体介导的细胞力学感知机制。近年来，BFP 已被用于测量分子键的弹簧常数。本方案详细描述了进行分子弹簧常数 DFS 分析的逐步操作流程。具体讨论了 BFP 的两种操作模式，即微球-细胞模式和微球-微球模式。本方案重点是从 DFS 原始数据中推导出分子键和细胞的弹簧常数。
引言
作为一种活细胞动态力谱（DFS）技术，BFP将一个人类红细胞（RBC；图1）改造为具有0.1–3 pN/nm范围内的相容弹簧常数、超灵敏且可调的力传感器1,2,3。为了探测配体-受体相互作用，BFP可在力、空间和时间分辨率上分别达到约1 pN（10-12 N）、约3 nm（10-9 m）和约0.5 ms（10-3 s）的DFS测量能力4,5。其实验装置包含两个相对的微移液管，分别称为探针（Probe）和靶标（Target）。探针微移液管吸住一个红细胞，并通过生物素-链霉亲和素相互作用在其顶端固定一个微珠。该微珠表面包被有目标配体（图1A）。靶标微移液管则吸住一个表达目标受体的细胞或微珠，分别对应于微珠-细胞（图1B）和微珠-微珠（图1C）两种模式5。
BFP的构建、组装以及DFS实验方案此前已有详细描述1,6简而言之，BFP触碰循环包含5个阶段：接近、碰撞、接触、回缩和解离（图1D）。红细胞水平顶点位置记为 Δx红细胞初始时，无应力（零力）状态下的红细胞变形量Δx红细胞 是 0（表1）。随后，靶标由压电平移器驱动，撞击并撤回探针珠（图1D）。首先由靶标压缩红细胞探针，产生负向红细胞变形量Δx红细胞 < 0. 在 Bond 事件中，回缩阶段从压缩相转变为拉伸相，伴随红细胞变形量 Δ 为正值x红细胞 > 0 (图2C 和 D）。根据胡克定律，BFP 承受的力可被测量为 F = k红细胞 × Δx红细胞, 其中 k红细胞 (表1) 是BFP的红细胞弹簧常数。在键断裂并完成一个接触循环后，探针微珠返回零力位置，此时Δx红细胞 = 0 (图1D).
为了确定红细胞膜剪切模量 kRBC，我们测量并记录探针微管的内孔半径（Rp）、红细胞半径（R0）以及红细胞与探针微球之间的圆形接触区域半径（Rc）（图1A）。随后，根据Evans模型（公式1）7,8，利用LabVIEW程序作为虚拟仪器（VI）控制BFP系统（图S1A）8,9，计算 kRBC 的值。
（公式 1）
在建立BFP并获得DFS原始数据后，本文展示了如何分析配体-受体对或细胞的弹簧常数。已利用糖基化蛋白Thy-1与表达整合素α5β1的K562细胞之间相互作用的DFS原始数据（Thy-1-α5β1；图3A 和 3B）10，以及纤维蛋白原与包被有整合素αIIbβ3的微珠之间相互作用的DFS原始数据（FGN-αIIbβ3；图3C）11,12，分别演示了微珠-细胞（Bead-Cell）和微珠-微珠（Bead-Bead）分析模式。
BFP 实验准备
有关 BFP 实验准备和仪器使用的详细信息，请参见先前发表的实验方案3。简言之，人红细胞（RBC）在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中使用 Biotin-PEG3500-NHS 进行生物素标记。目的蛋白在磷酸盐缓冲液中通过 MAL-PEG3500-NHS 共价偶联至硼硅酸盐玻璃微珠。为了与生物素标记的红细胞结合，探针微珠还需使用 MAL-SA 涂覆链霉亲和素（SA）。请参见材料表和表 2。
为了组装BFP（图1，左侧），将使用第三个称为“辅助”（Helper）的微移液管输送探针小球，并将其粘附到红细胞（RBC）的顶端1,3。链霉亲和素（SA）包被的探针小球与生物素化红细胞之间的共价相互作用远强于目标配体-受体键。因此，解离阶段可解释为配体-受体键的断裂，而非探针小球从红细胞上的脱落。
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方案
1. 获取可分析的 DFS 事件
- 在软件（例如 LabVIEW VI）中启动实验，进行 BFP 控制和参数设置（图 S1A）。
- 在 BFP Monitor 软件中观察探针微球与靶微球/细胞重复接触的情况（图 S1B）。
- 通过调节碰撞力和接触时间，使前 50 次接触中的黏附频率 ≤ 20%，以确保 ≥ 89% 的 DFS 黏附事件由单个分子键介导12,13,14。
注意：对于每一对微球-细胞/微球，我们执行 200 次重复接触循环。为了获得可用于发表的数据质量，通常需完成 n ≥ 3 对微球-微球或微球-细胞的实验。- 在每对实验结束时，由 BFP 控制和参数设置软件提示，将力-时间数据保存至用户指定的文件夹中。
- 使用 BFP 数据采集平台（图 S1C）收集键合事件的力-时间原始数据，示例见图 2A。
- 打开 BFP 数据分析软件，点击黄色文件夹图标，通过双击选择相应的原始数据文件。
- 运行程序，然后点击上下按钮切换不同事件。使用异常值排除标准（图 S2）筛选无效事件。选择导出数据类型为力-时间格式，并点击导出图表数据按钮。
2. 将力-时间曲线转换为力-位移曲线
- 将对应于回缩阶段的数据段导出至电子表格（图2A，方框选区），该数据与弹簧常数分析相关。
- 使用电子表格软件绘制力-时间曲线。为获得力-位移曲线，将时间值（图2A，x轴）乘以压电陶瓷移动速度（即预设值4,000 nm/s），转换为总位移值（Δxtot）。
- 通过从每个采集到的位移值中减去最小位移值，将第一个数据点归零。此水平平移操作不影响回缩阶段的上升斜率，也不影响后续的弹簧常数计算。
- 值得注意的是，BFP被视为一个串联弹簧系统，其中总位移Δxtot（表1）包括红细胞变形ΔxRBC（表1）、分子键变形Δxmol（表1）以及靶细胞变形Δxcell（表1）之和，如公式2所示：
（公式2） - 绘制力（F）与位移（Δxtot）的关系曲线，如图2B所示。
3. 微珠-细胞模型的弹簧常数分析
- 在力-位移曲线中，可识别出两个不同的斜率，分别代表压缩阶段和拉伸阶段。对每组数据拟合一条回归直线（图2B），其中较大的线性拟合斜率表示压缩阶段的总弹簧常数（图2B，红色），记为 k1 （表1）；较小的线性拟合斜率表示拉伸阶段的总弹簧常数（图2B，蓝色），记为 k2 （表1）。
- 对于按照步骤2.2描述串联连接的弹簧，将总弹簧常数 ktot 的倒数（表1）表示为红细胞（RBC）弹簧常数 kRBC（表1）、分子键弹簧常数 kmol（表1）以及靶细胞弹簧常数 kcell（表1）各自倒数之和。在微珠-细胞模式的压缩阶段，分子键未被拉伸，因此不考虑 kmol。此情况下总弹簧常数 ktot 的倒数（1/k1）表示为
（方程3）。
在示例数据中，kRBC 已预先确定（默认值为 0.25 pN/nm）。通过测得的 k1 和 kRBC，可由方程3推导出 kcell（图3B）。 - 在拉伸阶段，配体-受体对之间形成黏附。将此情况下的总弹簧常数 ktot 的倒数（1/k2）表示为
（方程4），
其中 k2（表1）表示拉伸阶段的总弹簧常数。 - 通过从 1/k2 中减去 1/k1 推导出 kmol（比较方程3与方程4）。
4. 珠-珠模式的弹簧常数分析
- 对压缩阶段数据拟合回归直线，以获得 k1（类似于图2B中的红色曲线）。需要注意的是，在珠-珠模式（Bead-Bead mode）中，靶细胞被涂有目标受体的玻璃微珠替代（图1C）。由于微珠的形变可忽略不计，因此可在方程3和方程4中相应地去除1/kcell项。压缩阶段的总刚度倒数ktot（即1/k1）可表示为：
（方程5） - 对拉伸阶段数据拟合回归直线，以获得 k2（类似于图2B中的蓝色曲线）。拉伸阶段的总刚度倒数ktot（即1/k2）可表示为：
（方程6） - 通过从1/k2中减去1/k1，推导出kmol（比较方程5与方程6）。
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结果
在本研究中，我们展示了BFP弹簧常数分析的实验方案。在珠-细胞分析模式中，我们分析了涂覆于探针珠表面的糖基化蛋白Thy-1与靶细胞K562细胞上表达的整合素α5β1之间分子键的kmol（Thy-1-整合素α5β1；图3A）10。kcell 同样来源于珠-细胞分析模式（K562细胞；图3B）。在珠-珠分析模式中，采用纤维蛋白原与整合素αIIbβ3之间形成的分子键（FGN-整合素αIIbβ3；图3C）11,12来演示珠-珠分析模式。
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讨论
综上所述，我们提供了一套详细的数据分析流程，用于预处理DFS原始数据，并在BFP的微珠-微珠（Bead-Bead）和微珠-细胞（Bead-Cell）分析模式下推导出分子弹簧常数。文中给出了测定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的是不同的整合素，但通过微珠-微珠模式和微珠-细胞模式测得的kmol存在显著的数值范围差异（图3A 与 图3C 对比）。值得注意的是，在微珠-微珠模式中，受体共价连接于玻璃微珠上；而在微珠-细胞模式中，表面受体与下方的质膜和细胞骨架相耦合，这很可能影响所测得的kmol值。
数据质量控制对于确保可重复性至关重要。为此，我们在力-时间图上实施了DFS数据预筛选和异常值排除标准。为说明这一点，我们选取了一个代表性数据集，并将DFS原始数据分为三个质量等级：良好（图 S2A），噪声可接受（图S2B
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披露
作者声明，他们对本研究的报告没有竞争利益需要披露。
致谢
感谢 Guillaume Troadec 提供的有益讨论，Zihao Wang 提供的硬件咨询，以及 Sydney 制造中心、Gregg Suaning 和 Simon Ringer 对我们实验室启动工作的支持。本研究得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 - L.A.J.）、新南威尔士州心血管能力建设计划（早期至中期职业研究人员资助 - L.A.J.）、悉尼研究加速器奖（SOAR - L.A.J.）、Ramaciotti 基金会健康投资资助（2020HIG76 - L.A.J.）、国家健康与医学研究理事会 Ideas 计划资助（APP2003904 - L.A.J.）以及悉尼大学工程学院启动基金和重大设备计划（L.A.J.）的支持。Lining Arnold Ju 是澳大利亚研究理事会 DECRA 研究员（DE190100609）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS） | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | 玻璃珠功能化 |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| BFP 数据采集 VI | LabVIEW | BFP对照与参数设置 | |
| BFP 数据分析 VI | LabVIEW | BFP 原始数据分析 | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | 红细胞生物素标记 |
| 硼硅酸盐玻璃珠 | Distrilab 粒子技术公司，荷兰 | 9002 | 玻璃珠功能化 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A0336 | 配体功能化 |
| 相机 VI | LabVIEW | BFP 监测 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’缓冲液制备 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’缓冲液制备 |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | 玻璃珠功能化 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’缓冲液制备 |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制；Tyrode’缓冲液制备 |
| 碳酸钠（Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’缓冲液制备 |
| 磷酸二氢钠一水合物（NaH₂PO₄·H₂O）2PO4•H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| 链霉亲和素-马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | S9415 | 玻璃珠功能化 |
参考文献
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