生物膜力探针（BFP）是一种 原位 动态力谱学（DFS）技术。BFP可用于测量活细胞上分子相互作用的弹簧常数。本方案介绍了通过BFP检测到的分子键的弹簧常数分析方法。
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摘要
摘要
一种生物膜力探针（BFP） recently emerged as a native-cell-surface or 原位 动态力谱学（DFS）纳米工具，可用于测量单分子结合动力学、评估配体-受体相互作用的力学特性、可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋的是可阐明受体介导的细胞力学感知机制。近年来，BFP 已被用于测量分子键的弹簧常数。本方案详细描述了进行分子弹簧常数 DFS 分析的逐步操作流程。具体讨论了 BFP 的两种操作模式，即微球-细胞模式和微球-微球模式。本方案重点是从 DFS 原始数据中推导出分子键和细胞的弹簧常数。
引言
作为一种活细胞动态力谱（DFS）技术，BFP将一个人类红细胞（RBC；图1）改造为具有0.1–3 pN/nm范围内的相容弹簧常数、超灵敏且可调的力传感器1,2,3。为了探测配体-受体相互作用，BFP可在力、空间和时间分辨率上分别达到约1 pN（10-12 N）、约3 nm（10-9 m）和约0.5 ms（10-3 s）的DFS测量能力4,5。其实验装置包含两个相对的微移液管，分别称为探针（Probe）和靶标（Target）。探针微移液管吸住一个红细胞，并通过生物素-链霉亲和素相互作用在其顶端固定一个微珠。该微珠表面包被有目标配体（图1A）。靶标微移液管则吸住一个表达目标受体的细胞或微珠，分别对应于微珠-细胞（图1B）和微珠-微珠（图1C）两种模式5。
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方案
1. 获取可分析的 DFS 事件
- 在软件（例如 LabVIEW VI）中启动实验，进行 BFP 控制和参数设置（图 S1A）。
- 在 BFP Monitor 软件中观察探针微球与靶微球/细胞重复接触的情况（图 S1B）。
- 通过调节碰撞力和接触时间，使前 50 次接触中的黏附频率 ≤ 20%，以确保 ≥ 89% 的 DFS 黏附事件由单个分子键介导12,13,14。
注意：对于每一对微球-细胞/微球，我们执行 200 次重复接触循环。为了获得可用于发表的数据质量，通常需完成 n ≥ 3 对微球-微球或微球-细胞的实验。- 在每对实验结束时，由 BFP 控制和参数设置软件提示，将力-时间数据保存至用户指定的文件夹中。
- 使用 BFP 数据采集平台（图 S1C）收集键合事件的力-时间原始数据，示例见图 2A。
- 打开 BFP 数据分析软件，点击黄色文件夹图标，通过双击选择相应的原始数据文件。
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结果
在本研究中，我们展示了BFP弹簧常数分析的实验方案。在珠-细胞分析模式中，我们分析了涂覆于探针珠表面的糖基化蛋白Thy-1与靶细胞K562细胞上表达的整合素α5β1之间分子键的kmol（Thy-1-整合素α5β1；图3A）10。kcell 同样来源于珠-细胞分析模式（K562细胞；图3B）。在珠-珠分析模式中，采用纤维蛋白原与整合素αIIbβ3之间形成的分子键（FGN-整合素αIIbβ3；图3C）11,12来演示珠-珠分析模式。
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讨论
综上所述，我们提供了一套详细的数据分析流程，用于预处理DFS原始数据，并在BFP的微珠-微珠（Bead-Bead）和微珠-细胞（Bead-Cell）分析模式下推导出分子弹簧常数。文中给出了测定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的是不同的整合素，但通过微珠-微珠模式和微珠-细胞模式测得的kmol存在显著的数值范围差异（图3A 与 图3C 对比）。值得注意的是，在微珠-微珠模式中，受体共价连接于玻璃微珠上；而在微珠-细胞模式中，表面受体与下方的质膜和细胞骨架相耦合，这很可能影响所测得的kmol值。
数据质量控制对于确保可重复性至关重要。为此，我们在力-时间图上实施了DFS数据预筛选和异常值排除标准。为说明这一点，我们选取了一个代表性数据集，并将DFS原始数据分为三个质量等级：良好（图 S2A），噪声可接受（图S2B
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披露
作者声明，他们对本研究的报告没有竞争利益需要披露。
致谢
感谢 Guillaume Troadec 提供的有益讨论，Zihao Wang 提供的硬件咨询，以及 Sydney 制造中心、Gregg Suaning 和 Simon Ringer 对我们实验室启动工作的支持。本研究得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 - L.A.J.）、新南威尔士州心血管能力建设计划（早期至中期职业研究人员资助 - L.A.J.）、悉尼研究加速器奖（SOAR - L.A.J.）、Ramaciotti 基金会健康投资资助（2020HIG76 - L.A.J.）、国家健康与医学研究理事会 Ideas 计划资助（APP2003904 - L.A.J.）以及悉尼大学工程学院启动基金和重大设备计划（L.A.J.）的支持。Lining Arnold Ju 是澳大利亚研究理事会 DECRA 研究员（DE190100609）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS） | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | 玻璃珠功能化 |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| BFP 数据采集 VI | LabVIEW | BFP对照与参数设置 | |
| BFP 数据分析 VI | LabVIEW | BFP 原始数据分析 | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | 红细胞生物素标记 |
| 硼硅酸盐玻璃珠 | Distrilab 粒子技术公司，荷兰 | 9002 | 玻璃珠功能化 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A0336 | 配体功能化 |
| 相机 VI | LabVIEW | BFP 监测 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’缓冲液制备 |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’缓冲液制备 |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | 玻璃珠功能化 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’缓冲液制备 |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制；Tyrode’缓冲液制备 |
| 碳酸钠（Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’缓冲液制备 |
| 磷酸二氢钠一水合物（NaH₂PO₄·H₂O）2PO4•H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | 磷酸盐缓冲液的制备 |
| 链霉亲和素-马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | S9415 | 玻璃珠功能化 |
参考文献
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
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