方法文章

分子弹簧常量分析由生物元原力探针光谱

DOI：

10.3791/62490

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2021年11月20日

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1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

本文内容

摘要

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生物元力探针 （BFP） 是一种 原位 动态力光谱 （DFS） 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物元原力探针（BFP）最近成为一种原生细胞表面或 原位 动态力光谱（DFS）纳米图，可以测量单分子结合动力学，评估配体受体相互作用的机械特性，可视化蛋白质动态构象变化，更令人振奋地阐明受体介导细胞机械增效机制。最近，BFP被用来测量分子键的弹簧常数。此协议描述了执行分子弹簧恒定 DFS 分析的分步过程。具体来说，讨论了两种 BFP 操作模式，即珠子单元和珠珠模式。此协议侧重于从 DFS 原始数据中提取分子键和细胞的弹簧常数。

引言

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作为活细胞DFS技术，BFP工程人类红血球（RBC:图1）进入一个超敏感和可调谐的力量传感器与兼容的弹簧恒定范围在0.1-3 pN/nm1，2，3。为了探测配体受体相互作用，BFP 使 DFS 测量在 +1 pN （10-12 N）， +3 nm （10-9米） 和 +0.5 ms （10-3 s） 生效， 空间和时间分辨率4，5.其实验配置由两个对立的微管，即探测器和目标组成。探针微管吸气RBC和珠子粘在其顶点通过生物素-链球菌素的相互作用。珠子上涂有感兴趣的配体（图1A）。目标微管吸气细胞或带有利益受体的珠子，分别对应珠细胞（图1B）和珠珠（图1C）模式。

BFP的建造，组装和DFS实验协议被详细描述之前1，6。简言之，BFP 触摸周期由 5 个阶段组成:方法、因平格、接触、缩回和分离（图 1D）。水平 RBC 顶点位置表示为+xRBC。在开始时，未应力（零力）RBC 变形=xRBC为 0（表 1）。然后，目标由压电翻译驱动，以冲压和缩回从探针珠（图1D）。RBC 探头首先由目标压缩，具有负 RBC 变形+xRBC < 0。在债券事件中，缩回阶段从压缩阶段过渡到拉伸阶段，正 RBC 变形=xRBC > 0 （图 2C和D）。根据胡克定律，BFP 承载力可以测量为F = k RBC ×xRBC，其中kRBC （表1）是 BFP 的 RBC 弹簧常数。当键破裂并完成一个触摸周期后，探针珠返回到零力位置与+xRBC = 0 （图1D）。

为了确定kRBC，我们测量并记录探针微管内孔（Rp）、RBC（R0）和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域（Rc）的半径（图1A）。然后kRBC根据埃文的模型（Eq.1）7，8使用实验室VIEW程序，作为一个虚拟仪器（VI）来操作BFP（图S1A）8，9。

流体动力学中 kRBC 的静态平衡方程，显示变量和对数项。 （Eq. 1）

通过建立 BFP 和获得 DFS 原始数据，我们介绍如何分析配体受体对或细胞的弹簧常数。DFS关于糖化蛋白Thy-1和K562细胞轴承集成蛋白相互作用的原始数据α 5 β 1（Thy-1-α 5 β 1: 数字3A和3B）10和纤维蛋白和珠涂层的集成物α IIb β 3（FGN-α IIb β 3: 图3C）11，12已分别用于演示珠细胞和珠珠分析模式。

BFP 实验准备
有关 BFP 实验制备和仪器的详细信息，请参阅先前发布的协议3。简言之，人类RBC在碳/碳酸氢盐缓冲中使用了生物素-PEG3500-NHS进行生物素化。感兴趣的蛋白质与磷酸盐缓冲器中使用MAL-PEG3500-NHS的玻硅酸盐玻璃珠共价耦合。为了附着在生物素化RBC上，探针珠还使用MAL-SA涂上链球菌素（SA）。请参阅材料表和表2。

为了组装BFP（图1，左），第三个称为"帮手"的微管将用于交付探针珠，并粘附到RBC的顶点1，3。SA 涂层探针珠和生物镀金 RBC 之间的共价相互作用比配体受体的利益纽带强得多。因此，分离阶段可以解释为配体受体键破裂，而不是探针珠从RBC分离。

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方案

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1. 获取可分析的 DFS 事件

  1. 在 BFP 控制和参数设置（图 S1A）的软件（例如 LabVIEW VI）中开始实验。
  2. 观察 BFP 监视器软件中的重复探针珠目标珠/细胞触摸（图 S1B）。
  3. 通过调整冲击力和接触时间，在前 50 次接触中测试并实现粘附频率≤ 20%，从而确保 DFS 粘附事件的 ≥ 89% 通过单键12、13、14进行介导。
    注:对于每个珠子单元格/珠子对，我们执行 200 个重复的触摸周期。为了获得可发布的数据质量，我们通常执行 n ≥ 3 个珠珠或珠子细胞对。
    1. 通过 BFP 控制和参数设置软件提示，以"强制与时间"的形式将数据保存到每个对末尾的用户定向文件夹。
  4. 使用 BFP 采集平台（图 S1C）收集债券事件的原力与时间原始数据，如图 2A中所举例。
    1. 打开 BFP 数据分析软件。单击黄色文件夹图标，通过双击它们来选择相应的原始数据文件。
  5. 运行程序，然后单击上下按钮在事件之间切换。使用离群值排除标准 （图 S2）筛选出无效事件。选择输出数据类型作为"强制与时间"格式，然后单击 "导出绘图"数据 按钮。

2. 将力与时间曲线转换为力与位移曲线

  1. 将与缩回阶段对应的数据段导出到电子表格（图2A，方形选框），这与弹簧常数分析相关。
  2. 使用电子表格软件绘制原力与时间曲线。要获得原力与置换曲线，请将时间值（图 2A、x轴）转换为总位移值（+xtot），将时间值与 Piezo 运动速度（即预设 4，000 nm/s）相乘。
  3. 从每个获得的位移值中减去最小的位移值，将第一个数据点为零。这种水平转换不会影响缩回阶段的上升坡度，也不会影响随后的弹簧常数计算。
  4. 值得注意的是，BFP 被认为是一个串行弹簧系统，其中+x托特 （表 1）RBC 的总和变形，+xRBC （表1），分子键，+x摩尔 （表 1），和目标细胞，+x细胞 （表 1），作为 Eq. 2:
    静态平衡方程 Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell，数学公式。 （Eq. 2）
  5. 绘制图 2B中显示的原力（F）与位移 （+xtot）曲线。

3. 珠子细胞模式的弹簧神经元分析

  1. 在力与位移曲线中，可以识别两个不同的斜面，每个斜点可以表示压缩相和拉伸相。将回归线拟合到每个数据组（图 2B），其中较大的线性拟合坡度表示压缩相下的总弹簧常数（图 2B，红色），表示为k1（表 1）:较小的线性拟合坡度表示十字形相（图 2B、蓝色）的总弹簧常数，表示为k2（表 1）。
  2. 对于每步2.2描述的串联弹簧，表示总弹簧常数的对等，ktot（表1），作为RBC、k RBC（表1）、分子键、k摩尔（表1）和目标细胞、k细胞（表1）的弹簧常数反向之和。在珠细胞模式的压缩阶段，分子键不拉伸，因此不考虑kmol。此方案中ktot的对等 （1/k1）表示为
    代表生物学中细胞动力学的方程;动力学常数图：k1、kRBC、kcell。 （Eq. 3） 。
    在示例数据中，kRBC是预先确定的（默认情况下为 0.25 pN/nm）。k细胞可从 Eq. 3 中提取，并具有获得的k1和kRBC（图3B）。
  3. 在拉伸阶段，配体受体对之间形成粘附。在此方案中表达 ktot 的对等 （1/k2） 作为
    串联电阻方程，显示 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell，用于动力学研究。 （Eq. 4）
    其中 k2 （表 1） 表示拉伸阶段的总弹簧常数。
  4. 从1/ k 2 中减去1/ k1 （比较 Eq. 3 与 Eq. 4） 。

4. 珠珠模式的春季恒定分析

  1. 将回归线安装到压缩相数据以获取k1（类似于图 2B，红色）。值得注意的是，在珠珠模式下，目标细胞被涂有兴趣受体的玻璃珠所取代（图1C）。由于珠子变形可以忽略不计，因此可以相应地从 Eq. 3 和 Eq. 4 中删除 1/k细胞术语。压缩相的对等k托特（1/k1）可以表示为:
    显示关系的方程：1/k1 = 1/kRBC;生化分析中动力学速率常数的关键。 （Eq. 5）
  2. 将回归线安装到拉伸相数据以获取 k 2（类似于图 2B，蓝色）。拉伸相（1/k2）的对等k托特可表示为:
    反应速率方程、逆速率常数图;k2、kRBC、kmol 动力学分析项。 （Eq. 6）
  3. 从1/ k 2 中减去1/ k1 （比较 Eq. 5 与 Eq. 6） 。

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结果

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在这项工作中，我们演示了 BFP 弹簧常数分析的协议。对于珠细胞分析模式，我们分析了涂在探针珠上的糖基化蛋白Thy-1与目标K562细胞（Thy-1-integrin 5 β 1）上表达的特格林α分子键的kmol（Thy-1-integrin α 5 β 1: 图3A）10. k细胞也来自珠细胞模式（K562细胞:图3B）。对于珠珠模式，纤维蛋白原和集成蛋白之间的分子键α IIb β 3（FGN-因特格林α IIb β 3:图3C）11、12用于...

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讨论

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总之，我们提供了详细的数据分析协议，用于在 BFP 珠子和珠子细胞分析模式下对 DFS 原始数据进行预处理并衍生分子弹簧常数。介绍了确定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的集成物不同，但珠珠模式和珠细胞模式测量的kmol具有显著的范围差异（图3A与图3C）。值得注意的是，与珠珠模式，受体是共同连接到玻璃珠。相比之下，与珠细胞模式相比，表面受体由底层等离子体膜和细胞骨架调节，最有可能影响测量到的kmol。

数据质量控制对于确保可重复性至关重要。为此，我们已对原力与时间图实施了 DFS 数据预筛选和离群值排除标准。为了证明这一点，我们选择了一个具有代表性的数据集，其中我们将DFS原始数据分为三个质量级别:良好（图S2A），噪声可接受（图S2B）和差（图S2C）。对于使用 ...

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披露

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作者宣称，他们没有相互竞争的利益来报告本研究。

致谢

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我们感谢纪劳姆·特罗亚德茨的有益讨论，王子豪的硬件咨询，悉尼制造中心，格雷格·苏宁和西蒙·林格支持我们的实验室启动。这项工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目（DP200101970 - 洛杉矶J.），新南威尔士州心血管能力建设计划（中早期职业研究员格兰特 - 洛杉矶J.），悉尼研究加速器奖（SOAR - 洛杉矶），拉马乔蒂的支持 基金会健康投资赠款（2020HIG76 - 洛杉矶J.）、国家健康和医学研究理事会创意赠款（APP2003904 - L.A.J.）和悉尼大学工程学院启动基金和主要设备计划（L.A.J.）。李宁·阿诺德·朱是澳大利亚研究理事会DECRA研究员（DE190100609）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-巯基丙基三甲氧基硅烷 （MPTMS）Uct， 特种产品， llc4420-74-0玻璃珠功能化
Anhy.磷酸氢二钠 （Na2HPO4）Sigma-AldrichS7907磷酸盐缓冲液制备
BFP 数据采集 VILabVIEWBFP 控制和参数设置
BFP 数据分析 VILabVIEWBFP 原始数据分析
生物素-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC 生物素化
硼硅酸盐玻璃珠Distrilab Particle Technology， Netherlands9002玻璃珠功能化
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA0336配体功能化
相机 VILabVIEWBFP 监测
D-葡萄糖Sigma-AldrichG7021Tyrode's 缓冲液制备
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode's 缓冲液制备
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1玻璃珠功能化
氯化钾 （KCl）Sigma-AldrichP9541Tyrode's 缓冲液制备
碳酸氢钠 （NaHCO3）Sigma-AldrichS5761碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液制备;泰罗德s 缓冲液制备
碳酸钠 （Na2CO3）Sigma-AldrichS2127碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液制备
氯化钠 （NaCl）Sigma-AldrichS7653Tyrode's 缓冲液制备
磷酸二氢钠一水合物 （NaH2PO4•H2O）Sigma-AldrichS9638磷酸盐缓冲液制备
链霉亲和素-马来酰亚胺Sigma-AldrichS9415玻璃珠功能化

参考文献

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