通过红外激光辅助微图形化技术控制细胞几何形态

摘要

本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。

摘要

微图形化技术是细胞生物学领域中一种成熟的方法，用于研究细胞区室形态与功能之间的关联，同时避免因天然细胞间差异所带来的复杂性。为了标准化细胞形态，可通过三维模具限制细胞，或利用黏附岛控制其黏附几何形状。然而，基于光刻和深紫外蚀刻的传统微图形化技术严重依赖洁净室或专用设备。本文介绍一种经 Doyle 等人改良的红外激光辅助微图形化技术（microphotopatterning），该技术可方便地使用市售成像系统搭建。在本实验方案中，我们采用尼康 A1R MP+ 成像系统，利用红外（IR）激光在聚乙烯醇包被的盖玻片上消融预设区域，从而生成微米级精度的微图形。我们使用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦功能的系统中实现高效、准确的自动化图形制备。结果表明，该红外激光辅助微图形化（microphotopatterning）方案可产生明确的图形，细胞仅附着于这些图形区域并呈现预期形状。此外，由于细胞形态实现了标准化，可对大量细胞的数据进行平均分析。结合高分辨率成像与定量分析，本方案生成的图形可用于相对高通量筛选，以鉴定介导形态与功能之间关联的分子因子。

引言

细胞形态是组织形态发生¹、细胞迁移²、细胞增殖³和基因表达⁴等基本生物学过程的关键决定因素。细胞形态的变化由细胞骨架动态重排所导致的质膜形变与外在因素之间复杂的平衡驱动，这些外在因素包括作用于细胞的外部力以及细胞-细胞和细胞-基质黏附的几何特征⁵。例如，迁移中的间充质细胞在前缘聚合致密的肌动蛋白网络，推动质膜向前延伸，形成宽阔的片状伪足⁶，同时肌动蛋白-肌球蛋白收缩性促使细胞狭窄的尾部回缩，使细胞脱离当前位置^7,8。干扰产生此类特化细胞骨架结构的信号事件会破坏细胞形态和极性，并减缓细胞迁移⁹。此外，原肠胚形成过程中上皮细胞层的弯曲需要基于肌动蛋白-肌球蛋白的顶端收缩，使细胞及其邻近细胞呈楔形¹⁰。尽管这些研究强调了细胞形态的重要性，但细胞形态固有的异质性阻碍了揭示形态与功能之间关联机制的研究进展。

为此，过去三十年中已开发出多种调控细胞形态的方法。这些方法通过以下两种途径实现目标：利....

方案

1. 盖玻片预处理

1. 按照 Waterman-Storer（1998）所述方法准备洁净的盖玻片²⁵。
2. 配制 1% (3-氨基丙基)三甲氧基硅烷（APTMS）溶液，将盖玻片放入该溶液中，在轻微振荡条件下孵育 10 分钟。确保盖玻片在溶液中可自由移动。
3. 用 dH₂O 洗涤盖玻片两次，每次 5 分钟。
4. 配制 0.5% 戊二醛（GA）溶液，将盖玻片放入该溶液中，在摇床中孵育 30 分钟。对于 25 片盖玻片，使用 50 mL 戊二醛溶液。确保盖玻片在溶液中可自由移动。
5. 用 dH₂O 洗涤盖玻片三次，每次 10 分钟。
6. 使用自制的盖玻片离心干燥器以 30 秒离心干燥盖玻片。该盖玻片离心干燥器的详细描述已有发表²⁶，并可在网络获取（https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/）。活化后的盖玻片可在含分隔装置的盒子中彼此分离存放，于 +4 °C 保存最长一个月。

2. PVA 涂层

1. 将PVA（98%水解PVA，分子量98000）与dH₂O混合，配制成5.6%的溶液。
2. 在90 ....

结果

通过微图形化技术获得的实验数据质量在很大程度上取决于图形的质量。为了评估上述方法生成图形的质量，我们首先使用反射显微镜检查盖玻片上光刻蚀区域的形状和尺寸。我们发现，每个单独的图形与刻蚀掩模非常相似，边界清晰，表面能够均匀反射光线（图2B）。可根据所需的细胞骨架结构打印多种不同形状和尺寸的图形，但我们采用了最适合本研究目的的十字弓形。原子力显微镜（AFM）显示，这些图形高度约为140 nm，表面光滑，整体拓扑变化极小（图2F）。次优的图形化参数设置（如激光功率过低或焦平面不正确）会导致聚乙烯醇（PVA）表面未能完全去除，表现为较暗、不完整的图形，并伴有不均匀的表面形貌（图2C）。若激光功率设置过高，则会导致PVA“起泡”，在极端情况下还会造成盖玻片表面损伤，这也是不可取的（图2D）。

在初步实验中，我们尝试通过在同一盖玻片上消减多个视野（FOV）来.......

讨论

上述结果表明，所描述的红外激光辅助微图案化（微光图案化）方案能够 reproducibly 生成各种形状的黏附图案，从而实现对细胞形态和细胞骨架结构的操控。尽管在微光图案化技术出现前后已开发出多种微图案化方法，该方法仍具有若干优势。首先，它无需通常仅在工程学部门才具备的专用设备和洁净室。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门日益普及，微光图案化技术拓展了多光子显微镜的应用范围，并扩大了潜在使用者群体。图案亦可根据需要随时更改 并立即打印，而无需制造需要 lengthy 光刻过程的新母版晶圆。

与现有的微光刻图案化方案相比，本方案的一项改进在于省去了盖玻片制备过程中多个耗时的固化步骤。我们证明，PVA-盖玻片的粘附质量未受影响，图案在制备后两周仍保持完整，并能有效结合细胞。更重要的是，我们通过取消预先设定每个视野（FOV）位置的步骤，提高了图案化过程的自动化程度²⁴。取而代之的是，我们采用了一个易于理解的宏程序，可在精确识别每个视野最佳焦平面的同时，实现大范围区域的图案化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷	Aldrich	281778
10 cm 细胞培养皿	VWR	10062-880	聚苯乙烯，TC 处理，带透气盖
25倍长工作距离水浸物镜	Nikon	MRD77225
3.5 cm 细胞培养皿	VWR	10861-586	聚苯乙烯，TC 处理，带透气盖
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo	62248	1 mg/mL 盐酸盐溶液
牛血清白蛋白	BioShop	ALB005
杜氏磷酸盐缓冲液	Wisent	311-425-CL
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E9508
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	FC010	1 mg/mL，pH 7.5 缓冲液
纤连蛋白抗体	BD	610077	小鼠来源
Fiji	ImageJ		版本 1.53c
荧光鬼笔环肽	Invitrogen	A12380	568 nm
玻璃盖玻片	VWR	16004-302	22 × 22 mm
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16220	25% 水溶液
盐酸	Caledon	6025-1-29	37% 水溶液
红外激光器	Coherent	Chameleon Vision
最低必需培养基 α	Gibco	12561-056
封片剂	Sigma	F4680
小鼠二抗	Cell Signaling Technology	4408S	山羊来源，488 nm
多光子显微镜	Nikon	A1R MP+
肌球蛋白轻链抗体	Cell Signaling Technology	3672S	兔来源
NIS Elements	Nikon		版本 5.21.03
硝酸	Caledon	7525-1-29	70% 水溶液
Photoshop	Adobe		版本 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	粉末
聚乙烯醇	Aldrich	341584	分子量 89000-98000，98% 水解
兔二抗	Cell Signaling Technology	4412S	山羊来源，488 nm
摇床	VWR	10127-876	又称模拟摇床
硼氢化钠	Aldrich	452882	粉末
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045
磷酸氢二钠	Sigma	S5136	粉末
磷酸二氢钠	Sigma	S5011	粉末
Spyder	Anaconda	4.1.4
胰蛋白酶	Wisent	325-042-CL	0.05% 水溶液，含 0.53 mM EDTA