本方案比较了两种不同诱导方案在将人牙髓干细胞（hDPSCs）向胰腺谱系分化中的应用 体外整合性方案与非整合性方案。整合性方案可生成更多的胰岛素生成细胞（IPCs）。
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本文内容
摘要
摘要
截至2000年，采用埃德蒙顿方案进行胰岛移植治疗1型糖尿病虽已取得一定成功，但仍面临一些障碍，包括尸体胰腺供体数量有限以及需长期使用免疫抑制剂。间充质干细胞（MSCs）被认为是一种潜在的替代来源，可用于生成类胰岛样细胞。我们此前的研究已成功建立了诱导人牙髓干细胞（hDPSCs）分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的方案。然而，诱导效率存在较大差异。本文展示了通过整合式（微环境与遗传操作结合）与非整合式（仅微环境操作）诱导方案对hDPSCs进行胰腺定向诱导效率的比较，以获得由hDPSCs衍生的胰岛素生成细胞（hDPSC-IPCs）。结果表明，两种诱导方法在三维集落结构、细胞产量、胰腺特异性mRNA标志物表达以及多剂量葡萄糖刺激下的功能特性方面均表现出显著不同的诱导效率。这些发现将有助于未来建立具有临床应用前景的胰岛素生成细胞及胰腺谱系细胞生产平台。
引言
糖尿病是一种持续存在的全球性健康问题。国际糖尿病联合会（IDF）的一份报告估计，全球糖尿病患病人数将从2000年的1.51亿增加到2015年的4.15亿1,2。最新的基于流行病学的研究预测，全球糖尿病患病人数将从2017年的4.51亿上升至2045年的6.93亿1。2000年，采用埃德蒙顿方案进行胰岛移植的成功首次得到证实，该方案可维持I型糖尿病患者的内源性胰岛素分泌，并稳定其正常血糖状态3。然而，埃德蒙顿方案的应用仍面临瓶颈问题。主要问题是尸体胰腺供体数量有限，因为每位I型糖尿病患者至少需要2至4名胰岛供体。此外，长期使用免疫抑制剂可能引发危及生命的副作用4,5。为解决这些问题，过去十年中糖尿病潜在疗法的研发主要集中在从多种来源的干细胞生成具有功能的胰岛素产生细胞（IPCs）6。
干细胞已成为多种疾病（包括因β细胞丢失导致的1型糖尿病）的一种替代治疗方法。移植胰岛样细胞簇（IPCs）是控制这些患者血糖水平的一种有前景的新方法7。本文介绍了生成IPCs的两种诱导方案：整合性与非整合性诱导方法。该诱导方案模拟了胰腺自然发育过程，以获得成熟且具有功能的IPCs8,9。
本研究中，通过流式细胞术对hDPSCs进行间充质干细胞表面标志物检测和多向分化潜能分析，并采用RT-qPCR检测其干性相关基因和增殖相关基因的表达水平（数据未显示）8,9,10。hDPSCs分别被诱导为定型内胚层、胰腺内胚层、胰腺内分泌细胞以及胰腺β细胞或胰岛样细胞（IPCs）（图1）7。细胞诱导采用三步诱导法作为基础方案，该方案称为非整合性方案。在整合性方案中，首先在hDPSCs中过表达关键的胰腺转录因子PDX1，随后对 过表达PDX1的hDPSCs应用三步分化方案进行诱导。整合性方案与非整合性方案的区别在于前者在hDPSCs中过表达PDX1，而后者不进行过表达。本研究比较了整合性与非整合性方案在胰腺分化过程中的效果。
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方案
本研究遵循赫尔辛基宣言的规定，并经朱拉隆功大学牙科学院人类研究伦理委员会批准（批准号：HREC-DCU 2018/054）。人牙髓干细胞（hDPSCs）分离自因智齿问题拔除的前磨牙和磨牙中的人牙髓组织。所有患者均在经批准的方案下签署了知情同意书。
1. 整合诱导方案
- 携带PDX1的慢病毒载体的制备
- 使用人胚胎肾（HEK）293FT细胞进行病毒包装。将这些细胞培养并维持在添加了10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
- 通过磷酸钙转染系统，将包装质粒和包膜质粒各10 µg以及靶基因质粒20 µg共转染至HEK293FT细胞中，以生成PDX1-慢病毒载体，例如psPAX2、pMD2.G和人源pWPT-PDX111。确保细胞在感染时融合度达到80%-90%。
- 在转染后48小时和72小时收集含有慢病毒颗粒的培养基。
- 使用0.45 µm滤器过滤收集的培养基；使用截留分子量为100 kDa的超滤离心浓缩器对病毒进行浓缩。
- PDX1过表达
- 使用传代3-5代、融合度为70-80%的人牙髓干细胞（hDPSC）。用胰蛋白酶消化并使用细胞计数器计数细胞。将1 × 106个hDPSC接种至60 mm组织培养处理过的培养皿中，过夜孵育。
- 24小时后，将步骤1.1.4中获得的新鲜病毒颗粒加入已预先用polybrene处理的细胞中（4 µg/mL polybrene，37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟），以达到所需的感染复数（MOI）。例如，本实验中使用的MOI为20。将细胞在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中继续培养24小时。
- 24小时感染期结束后，弃去含有病毒颗粒的培养基。加入新鲜培养基，继续培养细胞48小时。所有培养均在37 °C、5% CO2条件下维持。
- 在进入诱导步骤前，观察转染细胞的聚集形态。PDX1的转导通过基因表达分析进行验证（补充图1）。
注意：在进行下一步操作前，应在显微镜下检查细胞形态。 - 收集细胞，并进入三步诱导方案（步骤1.3），作为微环境诱导策略。
- 三步诱导方案
注意：该三步诱导方案利用无血清培养基（SFM）-A、SFM-B和SFM-C，依次将hDPSC诱导分化为定型内胚层、胰腺内胚层/内分泌前体以及胰腺β细胞/胰岛样细胞簇（IPCs）。- 弃去培养基，然后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤转导后的hDPSC。
- 向细胞中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育1分钟。
- 加入培养基以终止胰蛋白酶活性，并轻轻吹打使细胞脱落，获得单细胞悬液。计数细胞，并将1 × 106个细胞分装至每个收集管中。
- 将细胞悬液在468 × g（相对离心力：RCF）、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。
- 将沉淀重悬于3 mL第一阶段胰腺诱导培养基，即无血清培养基（SFM）-A中。将细胞接种至低吸附培养板（60 mm）中。在37 °C、5% CO2条件下培养3天。
注意：在进入下一步前，应在倒置显微镜下观察细胞形态。 - 移除SFM-A，加入3 mL第二阶段诱导培养基，即SFM-B。在37 °C、5% CO2条件下继续培养2天。
注意：在进入下一步前，应在倒置显微镜下观察细胞形态。 - 移除SFM-B，加入3 mL第三阶段诱导培养基，即SFM-C。在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中继续培养5天。每48小时更换一次培养基。5天后观察其形态。
注意：各阶段诱导培养基中添加的试剂如下：SFM-A：1%牛血清白蛋白（BSA）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、4 nM激活素A、1 nM丁酸钠和50 µM β-巯基乙醇；SFM-B：1% BSA、1× ITS和0.3 mM牛磺酸；SFM-C：1.5% BSA、1× ITS、3 mM牛磺酸、100 nM胰高血糖素样肽（GLP）-1、1 mM烟酰胺和1×非必需氨基酸（NEAAs）。 - 确保在每一步后均在倒置显微镜下检查细胞形态。细胞将逐渐形成更明显的聚集体，并以细胞团形式悬浮生长。
- 收集细胞团用于进一步分析。检查细胞团的形态和大小。进行胰腺相关基因标志物表达分析及功能分析（葡萄糖刺激的C肽分泌实验）。
2. 非整合诱导方案
注意：非整合方案是通过三步诱导过程以微环境诱导法递送诱导性多能干细胞（IPCs）的核心方案8,9。
- 使用第3-5代、融合度为70%-80%的人牙髓干细胞（hDPSCs）。
- 弃去培养基，用1×PBS洗涤hDPSCs。
- 加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C、5% CO2条件下孵育1分钟。
- 加入培养基以终止胰蛋白酶活性，轻轻吹打细胞获得单细胞悬液。计数细胞，并将1 × 106个细胞分装至每个收集管中。
- 将细胞悬液在468 × g（RCF）、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于SFM-A培养基中，接种至低吸附培养板（60 mm）中。于37 °C、5% CO2条件下培养3天，使用倒置显微镜观察细胞形态。
- 去除SFM-A，加入SFM-B（第3天），随后在37 °C、5% CO2条件下继续培养2天。
- 去除SFM-B，加入SFM-C（第5天），随后在37 °C、5% CO2条件下继续培养5天。SFM-C每48小时更换一次。
注意：每种诱导培养基均添加不同试剂，具体如下：SFM-A：1% BSA、1×ITS、4 nM activin A、1 nM丁酸钠和50 µM β-巯基乙醇；SFM-B：1% BSA、1×ITS和0.3 mM牛磺酸；SFM-C：1.5% BSA、1×ITS、3 mM牛磺酸、100 nM GLP-1、1 mM烟酰胺和1×NEAAs。 - 确保在每一步操作后以及第10天使用倒置显微镜检查细胞形态。
注意：细胞将逐渐形成更明显的聚集体，并以细胞团形式悬浮生长。 - 收集细胞团用于进一步分析。检查细胞团的形态和大小，进行胰腺基因标志物表达分析及功能分析（葡萄糖刺激的C肽分泌实验）。
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结果
本文比较了两种诱导方案的结果。图2A、C展示了两种诱导方案的示意图。在两种方案中，均在光学显微镜下进行观察，并使用ImageJ分析图像。人牙髓干细胞（hDPSCs）在两种诱导方案中均于诱导第一天开始形成类集落结构。集落形态呈圆形且致密，且在整个诱导期间所有集落均悬浮于培养容器中（图2B、D）。同时测定了两种方案的集落总数，结果显示，相较于非整合诱导方案，整合诱导方案的总集落数略高（图2E），但差异无统计学意义。此外，还评估了两种诱导方案中集落的大小分布（图2F）。根据我们的结果，整合诱导主要形成小至中等尺寸的集落，这对于减少集落内部的坏死核心具有重要意义。
根据我们近期发表的研究10，采用RT-qPCR方法进行胰腺基因标志物分析。本...
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讨论
从间充质干细胞（MSCs）中获得更高产量的胰岛样细胞团（IPCs）在糖尿病治疗中具有重要作用。整合型方案的关键步骤依赖于用于转导的细胞质量以及转导后细胞的质量。为确保转导成功，需检查若干细胞相关指标，包括细胞的健康状态、细胞库管理以及细胞是否处于有丝分裂活跃状态。此外，对转导后细胞的活力进行监测也至关重要。细胞刺激后活力较差是导致转导效率低下的主要原因12。对于非整合型方案，应观察到特定的形态学特征和漂浮的细胞集落，因为这些特征与胰腺分化成熟过程密切相关9。
关于整合性诱导方案的技术改进与问题排查，使用第3至第5代、融合度为70%–80%的细胞可获得健康且高质量的细胞；同时，在进入下一步操作前，应通过常规检测刺激后细胞的质量来监控转导细胞的质量。该发现与先前一项研究结果一致，该研究指出，影响转导效率的多个因素依赖于细胞状态、细胞融合度以及传代次数13。在本研究中，采用三步诱导过程的非整合性方案仍存在局限性，主要体现在克隆大小和克隆形成数量方...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
SK、WR 和 QDL 得到朱拉隆功大学拉差达披色颂蓬基金兽医干细胞与生物工程研究单元的支持。TO 和 PP 得到朱拉隆功大学学术提升计划的支持。nd 世纪项目。CS 受泰国朱拉隆功大学兽医学院研究支持基金资助，该基金用于推动朱拉隆功大学迈向卓越发展。nd 世纪项目、兽医干细胞与生物工程研究组、朱拉隆功大学拉差达披色颂波基金及政府研究基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）粉末，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | 每包用于配制 1 L PBS 溶液，使用无菌去离子水（DDI） |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| 携带 PDX1 的慢病毒载体的制备 | |||
| Amicon® Ultra-15 离心过滤器 | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| 人 pWPT-PDX1 质粒 | Addgene | 12256 | 由 Didier Trono 惠赠；http://n2t.net/addgene:12256；RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV 注射器滤器组件，0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G 质粒 | Addgene | 12259 | 由 Didier Trono 惠赠；http://n2t.net/addgene:12259；RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene 感染/转染试剂 | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 质粒 | Addgene | 12260 | 由 Didier Trono 惠赠；http://n2t.net/addgene:12260；RRID: Addgene_12260 |
| 三步诱导方案 | |||
| 重组人 Activin A 蛋白 | Merck Millipore | GF300 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| 牛血清白蛋白（BSA，Cohn V 组分，无脂肪酸） | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| 胰高血糖素样肽（GLP）-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS） | Invitrogen | 41400-045 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 非必需氨基酸（NEAAs） | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| 未经处理的细胞培养皿，60 mm | Eppendorf | 30701011 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T0625 |
参考文献
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48(2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175(2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040(2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
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