本方案详细描述了从白细胞滤器中获取CD34+造血祖细胞及其后续操作的全部步骤 体外 分化并成熟为能够释放血小板的产血小板巨核细胞，这些细胞可在培养基中释放血小板。该方法适用于深入分析调控巨核细胞生成的细胞与分子机制。
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摘要
摘要
这 体外 扩增和分化人类造血祖细胞为能够延伸前血小板并释放血小板的巨核细胞，可深入研究血小板生成的潜在机制。目前可用的培养方案主要依赖于骨髓或脐带血来源的造血祖细胞，这引发了一系列伦理、技术和经济方面的顾虑。尽管已有从外周血获取CD34+细胞的现有方案，本文提出了一种简便且优化的方案，用于从血站中广泛可得的白细胞去除滤器中获取CD34+细胞。这些细胞来源于制备输血制品过程中使用的白细胞去除滤器，相当于八份献血样本，而这些滤器原本将被丢弃。本文详细描述了从此类滤器中分离鉴定为CD34+细胞的造血祖细胞的具体操作流程。同时，详尽阐述了获得成熟巨核细胞并促使其延伸前血小板的过程，并讨论其表型演变。最后，本方案提供了一种经过校准的移液技术，以高效释放在形态和功能上均与天然血小板相似的血小板。该方案可作为评估作用于该过程各个阶段的药理化合物的基础，用于解析其潜在机制并推进相关研究。 体内 血小板产量。
引言
血小板来源于一种特殊的大型多倍体细胞，即巨核细胞（MK），这些细胞起源于一个持续且精密调控的生成过程，称为巨核细胞生成（MKP）。该过程的起始阶段为造血干细胞，在骨髓微环境（细胞因子、转录因子、造血微环境）的作用下，这些干细胞能够增殖并分化为造血祖细胞（HP），进而定向进入巨核细胞谱系，最终发育为未成熟的巨核细胞。1在多种细胞因子，尤其是巨核细胞主要细胞因子——血小板生成素（TPO）的作用下，巨核细胞（MK）将经历两个主要的成熟阶段：内有丝分裂和分界膜系统（DMS）的形成。完全成熟的巨核细胞随后出现在窦状血管附近，可伸出胞质突起即前血小板，后者在血流作用下释放，并进一步重塑为功能性的血小板21994年TPO的克隆3 为MKP的研究提供了推动，加快了其发展进程 体外 可实现造血祖细胞分化和巨核细胞成熟的培养技术。
血小板在数量（增多或减少）和功能方面均可能受到多种病理情况的影响4,5能够重现MKP 体外 来自人类HP的研究可能增进对这一过程背后分子与细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。
多种人类造血祖细胞（HP）来源均适用：脐带血、骨髓和外周血6,7,8。相较于从脐带血或骨髓中获取，从外周血中采集HP所涉及的后勤和伦理问题较少。HP可从白细胞单采术产物或血沉棕黄层中回收，但这些来源成本较高，且并非所有血库都能提供。其他一些成本较低且操作更简便的方法可直接从人外周血单个核细胞（PBMCs）中获取HP，无需预先进行CD34介导的分离4,8。然而，该方法获得的巨核细胞纯度不理想，因此建议从PBMCs中富集CD34+细胞，以实现向巨核细胞（MK）的最优分化。基于此，我们采用白细胞滤除滤器（LRF）作为HP的纯化来源，该滤器在血库中常规用于去除白细胞，从而避免不良免疫反应9。事实上，自1998年起，法国已对血小板浓缩物实施自动白细胞去除。该过程结束后，LRF通常被丢弃，其中截留的所有细胞也被销毁。因此，LRF中的细胞资源丰富且无需额外成本。LRF的细胞组成与白细胞单采术或血沉棕黄层相近，尤其在CD34+ HP的含量方面，使其成为极具吸引力的细胞来源10。已有研究证实，来源于LRF的人HP具有完整的功能活性11。该来源的优势在于资源丰富且成本低廉，适用于实验室研究。在此背景下，本文依次描述了以下内容：i）从LRF中提取并富集CD34+ HP；ii）一种两阶段优化培养体系，可模拟HP向巨核细胞系的定向分化以及能够释放前血小板的成熟MK的发育过程；iii）一种高效释放这些MK中血小板的方法；以及iv）对MK及体外培养所得血小板进行表型分析的技术流程。
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方案
对照组人源样本来自法国大东部地区血液中心（Etablissement Français du Sang-Grand Est）招募的志愿献血者，献血者均签署了书面知情同意书。所有实验程序已注册并获得法国高等教育与研究部批准，注册编号为 AC_2015_2371。献血者在 CODHECO 编号为 AC-2008-562 的知情同意书中同意其样本用于科研用途。涉及人类的研究均遵循赫尔辛基宣言进行。
1. 从LRF中提取和筛选CD34+细胞（HP）
- 试剂准备（每个 LRF）
- 准备 25 mL 过滤后的洗脱缓冲液：21.25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）、2.5 mL 酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）和 1.25 mL 去补体胎牛血清（FBS）。用 0.22 µm 滤器过滤，并置于 37 °C 预温。
- 配制含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 500 mL PBS 溶液。
- 将 25 mL 密度梯度介质（DGM）（1.077 g/mL）分装至两个 50 mL 离心管中。
- LRF 反向冲洗操作方法（图 1）
注意：此步骤需要使用无菌管路焊接仪，以实现热塑性管路的无菌连接。- 首先，将 LRF 连接到一个空的 600 mL 转移袋，并将 LRF 与管路组件连接（图 1A）。在生物安全柜内，向空袋中注入与所处理 LRF 数量相对应的全部过滤并预温的洗脱缓冲液体积（xLRF × 25 mL）。然后，使用 30 mL 注射器通过 LRF 轻柔抽吸袋内全部内容物，反向冲洗并将细胞转移至一个新的 50 mL 离心管中（图 1B）。
- 为促进红细胞沉降，用 2% 右旋糖酐溶液将细胞悬液稀释一倍，并充分混匀以促进红细胞聚集。室温（RT）静置 30 分钟。
图 1：LRF反向冲洗模式。 （A）（i）转移袋与LRF无菌连接，以及（ii）管路组件与LRF连接的代表性示意图。（B）细胞收集用注射器连接的代表性示意图。请点击此处查看此图的放大版本。
- PBMC 分离
- 红细胞沉降完成后，移除并转移上清液至一个 50 mL 离心管中，并用 PBS-EDTA 2 mM 定容。将上清液轻轻叠加至上述已制备好的密度梯度介质（DGM）上，注意倾注时避免破坏密度梯度的液面平面。在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，刹车关闭模式。
- 使用一次性移液管收集 PBMC 层。将每根 DGM 管中的细胞转移至新的无菌 50 mL 管中。每管加入 PBS-EDTA 2 mM 定容，并在室温下以 200 × g 离心 10 分钟（刹车开启模式），用 PBS-EDTA 2 mM 洗涤两次。
- 用移液器吸除上清并用 50 mL PBS-EDTA 2 mM 重悬细胞沉淀，合并细胞悬液。
注意：可在夜间将收集的细胞置于 4 °C 搅拌保存，暂停操作。随后用 40 µm 细胞滤器过滤悬液，以去除形成的细胞团块。
- CD34+ 细胞分选
- 计数细胞后，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟（刹车开启模式）。
- 彻底吸除上清液，并根据 CD34 分选试剂盒制造商说明，用适当体积的 PBS-EDTA 2 mM 重悬细胞（每 108 个细胞使用 300 µL PBS-EDTA）。加入 FcR 阻断试剂和适当浓度的 CD34 微珠（每 108 个细胞加 50 µL）。
- 4 °C 孵育 30 分钟后，洗涤细胞悬液，并根据 CD34 分选试剂盒制造商说明，用适当体积的 PBS-EDTA 2 mM 重悬（每 108 个细胞使用 500 µL）。
注意：分选在磁性分选柱上进行，每根柱子最多通过 2 × 109 个细胞。 - 将样品过湿化的磁性分选柱。用 3 mL PBS-EDTA 2 mM 洗涤两次，再用 5 mL PBS-EDTA 2 mM 洗脱细胞。为提高样品纯度，需使用新分选柱重复相同操作一次。
注意：预期每升流体样本（LRF）可获得 6.1 × 105 个细胞（图 2A）。若 LRF 数量更高，需相应放大试剂和方法。
- CD34+ 细胞纯度评估
- 取 CD34+ 分选后所得悬液 100 µL，加入 2 µL 人 CD34-PE 抗体或 2 µL IgG-PE（对照）。充分混匀，4 °C 孵育 15 分钟。
- 加入 2 mL PBS 洗涤细胞，400 × g 离心 5 分钟。彻底吸除上清液，用 200 µL PBS 重悬细胞。
- 通过流式细胞术分析纯度，如 图 2A 及 讨论 部分所示。
注意：预期 CD34+ 细胞纯度高于 90%（图 2Bii）。 - 可直接使用 CD34+ 细胞，或冻存以备后续使用。
- CD34+ 细胞冻存
注意：CD34+ 细胞冻存密度为每毫升 106 个细胞。- 在确定 CD34+ 细胞数量后，配制以下冻存液：（1）60% Stemspan + 40% FBS，（2）40% Stemspan + 40% FBS + 20% 二甲基亚砜（DMSO），并置于 4 °C 预冷。
- 将 CD34+ 细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，将细胞沉淀用预冷的溶液 1 重悬，然后立即按体积比加入预冷的溶液 2（v/v）。
- 立即将冻存管放入 -80 °C 超低温冰箱中保存 24 小时，随后转移至液氮罐中长期保存。
2. 培养 CD34+ 细胞并诱导其分化为成熟产板状伪足的巨核细胞
注意：本节详细说明细胞培养方案（图3A），为细胞培养流程的代表性示意图。
- CD34+ 细胞解冻（如需要）
- 准备解冻液：将 13 mL PBS-20% FBS 置于 37 °C 水浴中预热 15 分钟。迅速将冻存管转移至 37 °C 水浴中，直至仅剩一个微小冰晶。在生物安全柜内，用移液器吸取全部内容物，并缓慢加入 13 mL 预热的解冻液中。
- 测定细胞数量和细胞活力。
- 培养方案，步骤 1：从第 0 天到第 7 天
注意：通常在 24 孔板中进行培养，每孔加入 1 mL 培养基，细胞密度为 40,000 个活细胞/mL，相当于 20,000 个活细胞/cm2。若计划扩大培养规模，必须严格遵守此密度。- 生长培养基配制：在已预热至 37 °C 的无血清造血细胞扩增培养基中，加入 1× 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）、20 µg/mL 人低密度脂蛋白（hLDL）、1× 巨核细胞扩增细胞因子混合物以及 1 µM Stemregenin 1（SR1）。
- 细胞接种：将解冻后的 CD34+ 细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。彻底去除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 培养基中，并进行细胞计数和活力检测，以确定合适的接种体积。
- 将细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于适量预热的生长培养基中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天。
- 培养方案，步骤 2：从第 7 天到第 13 天（图 3B，第 13 天代表性图像）
注意：通常在 24 孔板中进行培养，每孔加入 1 mL 培养基，细胞密度为 50,000 个活细胞/mL，相当于 25,000 个活细胞/cm²。若计划扩大培养规模，必须严格遵守此密度。- 成熟培养基配制：在已预热至 37 °C 的无血清造血细胞扩增培养基中，加入 1× PSG、20 µg/mL hLDL、50 ng/mL TPO 和 1 µM SR1。
- 在显微镜下观察细胞。第 7 天时，细胞呈圆形且形态均一，充满孔板或培养瓶，但未过度融合。
- 在生物安全柜内，轻柔地将细胞转移至 15 mL 离心管中。用 PBS 清洗孔板。随后测定细胞数量和活力，以计算合适的接种体积。
- 将细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于上一步计算出的适量温热培养基中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 6 天。
- 第 13 天培养血小板释放
- 向培养体系中加入 0.5 µM 前列腺素 I2（PGI2）和 0.02 U/mL 腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase），并用 1 mL 移液器连续吹打 5 次。
注意：血小板现已释放至培养基中。
- 向培养体系中加入 0.5 µM 前列腺素 I2（PGI2）和 0.02 U/mL 腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase），并用 1 mL 移液器连续吹打 5 次。
3. 流式细胞术分析（巨核细胞表型分析和培养血小板计数）
注意：本方案可用于所选培养天数的细胞表型分析，也可用于测定培养中血小板释放的数量（图 4A、B）。
- MK 分析的准备工作
- 标记四组微量离心管，如下所示：未标记细胞作为对照，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞 + 5 µL CD34 - PECy7，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 µL CD34 - PECy7。每管使用不少于 1.105 个细胞，不超过 1.106 个细胞。向每根流式管中加入 100 µL 细胞悬液及相应的不同抗体。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- 然后每管加入 2 mL PBS-EDTA 2 mM，于室温下以 400 × g 离心 5 分钟。离心期间，配制 PBS-EDTA 2 mM + 7-氨基放线菌素 D（7AAD）（1/100）溶液，每管准备 300 µL。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于 300 µL 含 7AAD 的 PBS-EDTA 2 mM 溶液中。在 30 分钟内上机进行流式细胞术检测。
注：流式细胞术分析策略见 图 3C 及 讨论 部分。
- 培养血小板分析的试管准备
- 标记四组微量离心管，如下所示：未标记细胞作为对照，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞 + 20 µL CD42a - PE，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 µL CD42a - PE。在培养孔中连续吹打五次后，转移 300 µL 悬液至含有已校准数量荧光微球的流式管中。
- 加入抗体，在室温避光孵育 30 分钟。
- 在 30 分钟内上机进行流式细胞术检测，并设定采集参数使通过的微球数量为 5,000 个。
注：流式细胞术分析策略见 图 4B 及 讨论 部分。
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结果
从LRFs中提取和筛选CD34+细胞
此处的方法源自 Peytour 等人9，描述了CD34的提取与筛选方法+ 血库中白细胞去除后废弃的白细胞滤器（LRF）中可获取的细胞。经过反冲程序后，通常可获得 1.03 x 109 ± 2.45 × 108 细胞/LRF（均值±标准误；n = 155）的回收率为94.88 ± 0.10%（图2A i）。CD34阳性选择后，平均获得615.54 x 103 ±12.28 个细胞/LRF（n = 155）图2A ii）。如果细胞数量少于300,000，则必须判断该操作未正确执行，并终止实验。为评估CD34阳性细胞分选的效果，需通过流式细胞术检测CD34+细胞的纯度（图2B）。通常预期...
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讨论
本方案描述了一种利用血液来源的造血祖细胞（HP）生成巨核细胞（MK）的方法，该巨核细胞能够释放前血小板并从培养基中释放血小板。造血祖细胞来源于白细胞滤除残余物（LRF），后者是血库在去除细胞类血液制品中污染性白细胞以避免不良反应时产生的副产品。尽管该方法相对简单，但有几个关键点需要特别注意。
将细胞悬液铺加到密度梯度介质上（步骤1.3.1）时必须轻柔操作，以避免混合（出现红色内容）。如果此步骤操作不当，应立即停止实验。同样，在步骤1.3.1中，离心机刹车必须处于关闭状态，以防止各组分混合。若未按此操作，则必须暂停HP筛选。如方案第1.4节所述，在PBMC收集完成后可中断实验流程。在此情况下，细胞可在4 °C条件下轻轻振荡保存过夜。随后使用40 µm细胞筛网去除形成的细胞团块，以免影响后续的CD34筛选。需要注意的是，中断操作不会影响CD34+细胞的得率和纯度。在完成CD34筛选后，细胞纯度必须高于75%方可用于接种，因为在先前的研究中发现，当纯度低于此值时，巨核细胞（MK）的分化与成熟效果较差12（
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了资助 由法国国家研究署（ANR，Agence Nationale de la Recherche）资助项目 ANR-17-CE14-0001-1 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount 试管 | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead 试剂盒 UltraPure，人源 | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| 离心机 | Heraeus | Megafuge 1.OR | 或同等材料 |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | 或同等材料 |
| 冻存管 | Dutscher | 55002 | 或同等材料 |
| 来自 Leuconostoc spp 的葡聚糖 | Sigma | 31392-50g | 或同等材料 |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1.5 mL | Dutscher | 616201 | 或同等材料 |
| 过滤装置 Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| 流式细胞仪 | BD Bioscience | Fortessa | |
| 人源 LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0.1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| 插入件 | Fenwal | R4R1401 | 或同等材料 |
| 超净工作台 | Holten | NA | 已归档产品 |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓缩液） | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | 或同等材料 |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| 600 mL 转移袋 | Macopharma | VSE4001XA | |
| 预分离滤器（30µm） | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan 扩增添加剂（100 倍浓缩液） | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0.22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| 30 mL 注射器 | Terumo | SS*30ESE1 | 或同等材料 |
| 注射器滤器 Millex 0.22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| 50 mL 离心管 | Sarstedt | 62.548.004 PP | 或同等材料 |
| 15 mL 离心管 | Sarstedt | 62.554.001 PP | 或同等材料 |
| 管路 | B Braun | 4055137 | 或同等材料 |
参考文献
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重印与许可
