去白细胞滤器来源的CD34+细胞作为研究巨核细胞分化与血小板形成的细胞来源

摘要

本方案详细描述了从白细胞滤器中获取CD34+造血祖细胞及其后续操作的全部步骤 体外 分化并成熟为能够释放血小板的产血小板巨核细胞，这些细胞可在培养基中释放血小板。该方法适用于深入分析调控巨核细胞生成的细胞与分子机制。

摘要

这 体外 扩增和分化人类造血祖细胞为能够延伸前血小板并释放血小板的巨核细胞，可深入研究血小板生成的潜在机制。目前可用的培养方案主要依赖于骨髓或脐带血来源的造血祖细胞，这引发了一系列伦理、技术和经济方面的顾虑。尽管已有从外周血获取CD34+细胞的现有方案，本文提出了一种简便且优化的方案，用于从血站中广泛可得的白细胞去除滤器中获取CD34+细胞。这些细胞来源于制备输血制品过程中使用的白细胞去除滤器，相当于八份献血样本，而这些滤器原本将被丢弃。本文详细描述了从此类滤器中分离鉴定为CD34+细胞的造血祖细胞的具体操作流程。同时，详尽阐述了获得成熟巨核细胞并促使其延伸前血小板的过程，并讨论其表型演变。最后，本方案提供了一种经过校准的移液技术，以高效释放在形态和功能上均与天然血小板相似的血小板。该方案可作为评估作用于该过程各个阶段的药理化合物的基础，用于解析其潜在机制并推进相关研究。 体内 血小板产量。

引言

血小板来源于一种特殊的大型多倍体细胞，即巨核细胞（MK），这些细胞起源于一个持续且精密调控的生成过程，称为巨核细胞生成（MKP）。该过程的起始阶段为造血干细胞，在骨髓微环境（细胞因子、转录因子、造血微环境）的作用下，这些干细胞能够增殖并分化为造血祖细胞（HP），进而定向进入巨核细胞谱系，最终发育为未成熟的巨核细胞。¹在多种细胞因子，尤其是巨核细胞主要细胞因子——血小板生成素（TPO）的作用下，巨核细胞（MK）将经历两个主要的成熟阶段：内有丝分裂和分界膜系统（DMS）的形成。完全成熟的巨核细胞随后出现在窦状血管附近，可伸出胞质突起即前血小板，后者在血流作用下释放，并进一步重塑为功能性的血小板²1994年TPO的克隆³ 为MKP的研究提供了推动，加快了其发展进程 体外 可实现造血祖细胞分化和巨核细胞成熟的培养技术。

血小板在数量（增多或减少）和功能方面均可能受到多种病理情况的影响^4,5能够重现MKP 体外 来自人类HP的研究可能增进对这一过程背后分子与细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。

多种人类造血祖细胞（HP）来源均适用：脐带血、骨髓和外周血^6,7,8。相较于从脐带血或骨髓中获取，从外周血中采集HP所涉及的后勤和伦理问题较少。HP可从白细胞单采术产物或血沉棕黄层中回收，但这些来源成本较高，且并非所有血库都能提供。其他一些成本较低且操作更简便的方法可直接从人外周血单个核细胞（PBMCs）中获取HP，无需预先进行CD34介导的分离^4,8。然而，该方法获得的巨核细胞纯度不理想，因此建议从PBMCs中富集CD34+细胞，以实现向巨核细胞（MK）的最优分化。基于此，我们采用白细胞滤除滤器（LRF）作为HP的纯化来源，该滤器在血库中常规用于去除白细胞，从而避免不良免疫反应⁹。事实上，自1998年起，法国已对血小板浓缩物实施自动白细胞去除。该过程结束后，LRF通常被丢弃，其中截留的所有细胞也被销毁。因此，LRF中的细胞资源丰富且无需额外成本。LRF的细胞组成与白细胞单采术或血沉棕黄层相近，尤其在CD34+ HP的含量方面，使其成为极具吸引力的细胞来源¹⁰。已有研究证实，来源于LRF的人HP具有完整的功能活性¹¹。该来源的优势在于资源丰富且成本低廉，适用于实验室研究。在此背景下，本文依次描述了以下内容：i）从LRF中提取并富集CD34⁺ HP；ii）一种两阶段优化培养体系，可模拟HP向巨核细胞系的定向分化以及能够释放前血小板的成熟MK的发育过程；iii）一种高效释放这些MK中血小板的方法；以及iv）对MK及体外培养所得血小板进行表型分析的技术流程。

方案

对照组人源样本来自法国东部血液中心（Etablissement Français du Sang-Grand Est）招募的志愿献血者，献血者均签署了书面知情同意书。所有实验程序均已注册，并获得法国高等教育与研究部批准，注册编号为 AC_2015_2371。献血者在 CODHECO 编号为 AC-2008-562 的同意书中明确同意其样本可用于科研用途。涉及人类的研究均遵循赫尔辛基宣言进行。

1. 从LRF中提取和筛选CD34+细胞（HP）

1. 试剂的准备（每个LRF）
   1. 准备25 mL过滤后的洗脱缓冲液：21.25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）、2.5 mL酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）和1.25 mL去补体胎牛血清（FBS）。用0.22 µm滤器过滤后置于37 °C备用。
   2. 配制500 mL含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液。
   3. 将密度梯度介质（DGM）（1.077 g/mL）各25 mL分装至两个50 mL离心管中。
2. LRF反向冲洗操作方法（图1）
   注意：此步骤需要使用无菌管路焊接机，以实现热塑性管路的无菌连接。
   1. 首先，将LRF连接至一个空的600 mL转移袋，并将LRF与管路装置相连（图1A）。在生物安全柜内，向空袋中注入与所处理LRF数量相对应的全部过滤并配制好的洗脱缓冲液体积（xLRF × 25 mL）。然后使用30 mL注射器通过LRF缓慢抽吸袋内全部内容物，反向冲洗并将细胞转移至一个新的50 mL离心管中（图1B）。
   2. 为促进红细胞沉降，用2%右旋糖酐溶液将细胞悬液稀释一倍，并充分混匀以促使红细胞聚集。室温（RT）静置30分钟。

图1：LRF反向冲洗模式。（A）（i）转移袋与LRF无菌连接，以及（ii）管路系统与LRF连接的代表性示意图。（B）用于细胞收集的注射器连接的代表性示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

3. PBMC 的分离
   1. 红细胞沉降完成后，移除上清液并转移至 50 mL 离心管中，用含 2 mM EDTA 的 PBS（PBS-EDTA）补满。将上清液轻柔地铺加到上述已制备好的密度梯度介质（DGM）上，注意避免破坏密度梯度的液面。在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，离心机刹车设为关闭状态。
   2. 使用一次性移液管收集 PBMC 层。将每根 DGM 管中的细胞转移至新的无菌 50 mL 离心管中。每管加入 PBS-EDTA 2 mM 至满，随后在室温下以 200 × g 离心 10 分钟（刹车开启），用 PBS-EDTA 2 mM 洗涤两次。
   3. 弃去上清液，用 50 mL PBS-EDTA 2 mM 重悬细胞沉淀，并合并细胞悬液。
      注：可在夜间将收集的细胞在 4 °C 下持续轻柔振荡保存，暂停实验流程。之后使用 40 µm 细胞滤网过滤细胞悬液，以去除形成的细胞团块。
4. CD34+ 细胞的分选
   1. 计数细胞后，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟（刹车开启）。
   2. 彻底吸弃上清液，根据 CD34 分选试剂盒说明书推荐的体积，用 PBS-EDTA 2 mM 重悬细胞（每 10⁸ 个细胞使用 300 µL PBS-EDTA）。加入 FcR 阻断试剂和 CD34 微珠，按推荐浓度添加（每 10⁸ 个细胞加入 50 µL）。
   3. 4 °C 孵育 30 分钟后，洗涤细胞悬液，并根据 CD34 分选试剂盒说明书推荐的体积用 PBS-EDTA 2 mM 重悬（每 10⁸ 个细胞使用 500 µL）。
      ​注：分选过程使用磁性分选柱，每根分选柱最多可处理 2 × 10⁹ 个细胞。
   4. 将样品加载至置于磁铁上的预湿分选柱中。用 3 mL PBS-EDTA 2 mM 洗涤两次，然后用 5 mL PBS-EDTA 2 mM 洗脱细胞。为提高样品纯度，需使用新分选柱重复上述操作一次。
      注：预期每升 LRF 可获得约 6.1 × 10⁵ 个细胞（图 2A）。若 LRF 数量更高，应相应放大试剂用量和操作规模。
5. CD34+ 细胞纯度的评估
   1. 取 CD34⁺ 分选后获得的细胞悬液 100 µL，加入 2 µL 人 CD34-PE 抗体或 2 µL IgG-PE（对照）。充分混匀后，在 4 °C 孵育 15 分钟。
   2. 加入 2 mL PBS 洗涤细胞，以 400 × g 离心 5 分钟。彻底吸弃上清液，用 200 µL PBS 重悬细胞。
   3. 通过流式细胞术分析细胞纯度，方法如 图 2A 及 讨论 部分所示。
      ​注：预期 CD34+ 细胞纯度高于 90%（图 2Bii）。
   4. 可直接使用 CD34+ 细胞，或冻存以备后续使用。
6. CD34+ 细胞的冻存
   注：CD34+ 细胞冻存密度为每毫升 10⁶ 个细胞。
   1. 在完成 CD34+ 细胞计数后，配制以下冻存液：(1) 60% Stemspan + 40% FBS，(2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% 二甲基亚砜（DMSO），并将两种溶液置于 4 °C 预冷。
   2. 将 CD34+ 细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清后用预冷的溶液 1 重悬细胞沉淀，然后立即按体积比加入等量预冷的溶液 2（v/v）。
   3. 立即将冻存管放入 -80 °C 超低温冰箱中保存 24 小时，随后转移至液氮罐中长期保存。

2. 培养 CD34+ 细胞并诱导其分化为成熟且带有血小板前体的巨核细胞

注：本节详细说明细胞培养方案（图3A），为细胞培养流程的代表性示意图。

1. CD34+ 细胞解冻（如需要）
   1. 准备解冻液：13 mL PBS-20% FBS，置于 37 °C 水浴中预热 15 分钟。迅速将冻存管转移至 37 °C 水浴中，直至仅剩一个微小冰晶。在生物安全柜内，用移液器吸取全部内容物，并缓慢转移至 13 mL 预热的解冻液中。
   2. 测定细胞数量和细胞活力。
2. 培养方案，步骤 1：从第 0 天到第 7 天
   注：通常在 24 孔板中进行培养，每孔加入 1 mL 培养基，细胞密度为 40,000 个活细胞/mL，相当于 20,000 个活细胞/cm²。若计划扩大培养规模，必须严格遵守此密度。
   1. 生长培养基配制：在已预热至 37 °C 的无血清造血细胞扩增培养基中，加入 1× 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）、20 µg/mL 人低密度脂蛋白（hLDL）、1× 巨核细胞扩增细胞因子混合物以及 1 µM Stemregenin 1（SR1）。
   2. 细胞接种：将解冻后的 CD34+ 细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。彻底去除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 培养基中，并进行细胞计数和活力检测，以确定合适的接种体积。
   3. 将细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于适量预热的生长培养基中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 7 天。
3. 培养方案，步骤 2：从第 7 天到第 13 天（图 3B，第 13 天代表性图像）
   注：通常在 24 孔板中进行培养，每孔加入 1 mL 培养基，细胞密度为 50,000 个活细胞/mL，相当于 25,000 个活细胞/cm²。若计划扩大培养规模，必须严格遵守此密度。
   1. 成熟培养基配制：在已预热至 37 °C 的无血清造血细胞扩增培养基中，加入 1× PSG、20 µg/mL hLDL、50 ng/mL TPO 和 1 µM SR1。
   2. 在显微镜下观察细胞。第 7 天时，细胞呈圆形且形态均一，充满孔板或培养瓶但未过度融合。
   3. 在生物安全柜内，轻柔地将细胞转移至 15 mL 离心管中。用 PBS 清洗孔板。随后测定细胞数量和活力，以计算合适的接种体积。
   4. 将细胞在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于上一步计算所得的适量温热培养基中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 6 天。
4. 第 13 天培养血小板释放
   1. 向培养体系中加入 0.5 µM 前列腺素 I₂（PGI₂）和 0.02 U/mL 腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase），并用 1 mL 移液器反复吹打 5 次。
      ​注：血小板现已释放至培养基中。

3. 流式细胞术分析（巨核细胞表型分析和培养血小板计数）

注意：本方案可用于所选培养天数的细胞表型分析，也可用于测定培养中血小板释放的数量（图4A、B）。

1. MK 分析的准备工作
   1. 标记四组微量离心管，如下所示：未标记细胞作为对照，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞 + 5 µL CD34 - PECy7，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 µL CD34 - PECy7。每管使用不少于 1.10⁵ 个细胞，不超过 1.10⁶ 个细胞。向每根流式管中加入 100 µL 细胞悬液及相应的不同抗体。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   2. 然后每管加入 2 mL PBS-EDTA 2 mM，于室温下以 400 × g 离心 5 分钟。离心期间，配制 PBS-EDTA 2 mM + 7-氨基放线菌素 D（7AAD）（1/100）溶液，每管准备 300 µL。
   3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 300 µL 含 7AAD 的 PBS-EDTA 2 mM 溶液中。在 30 分钟内上机进行流式细胞术检测。
      注：流式细胞术分析策略见 图 3C 及 讨论 部分。
2. 培养血小板分析的试管准备
   1. 标记四组微量离心管，如下所示：未标记细胞作为对照，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488，细胞 + 20 µL CD42a - PE，细胞 + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 µL CD42a - PE。在培养孔中连续吹打五次后，转移 300 µL 悬液至含有已校准数量荧光微球的流式管中。
   2. 加入抗体，在室温避光孵育 30 分钟。
   3. 在 30 分钟内上机进行流式细胞术检测，并设定采集参数以记录 5,000 个微球的信号。
      注：流式细胞术分析策略见 图 4B 及 讨论 部分。

结果

从白细胞滤除残余物（LRF）中提取和筛选CD34+细胞
本方法源自Peytour等人的研究⁹，用于从血库中白细胞去除后废弃的LRF中提取并筛选CD34⁺细胞。在反向冲洗操作后，通常每单位LRF可回收1.03 × 10⁹ ± 2.45 × 10⁸个细胞（均值±标准误；n = 155），细胞活力为94.88 ± 0.10%（图2A i）。经CD34阳性筛选后，平均每单位LRF可获得615.54 × 10³ ± 12.28个细胞（n = 155）（图2A ii）。若细胞数量少于300,000个，则表明操作过程存在错误，应终止实验。为评估CD34细胞筛选的成功程度，需通过流式细胞术检测CD34+细胞的纯度（图2B）。常规情况下...

讨论

本方案描述了一种利用血液来源的造血祖细胞（HP）生成巨核细胞（MK）的方法，该巨核细胞能够释放前血小板并从培养基中释放血小板。造血祖细胞来源于白细胞滤除残余物（LRF），后者是血库在去除细胞类血液制品中污染性白细胞以避免不良反应时产生的副产品。尽管该方法相对简单，但有几个关键点需要特别注意。

将细胞悬液铺加到密度梯度介质上（步骤1.3.1）时必须轻柔操作，以避免混合（出现红色内容）。如果此步骤操作不当，应立即停止实验。同样，在步骤1.3.1中，离心机刹车必须处于关闭状态，以防止各组分混合。若未按此操作，则必须暂停HP筛选。如方案第1.4节所述，在PBMC收集完成后可中断实验流程。在此情况下，细胞可在4 °C条件下轻轻振荡保存过夜。随后使用40 µm细胞筛网去除形成的细胞团块，以免影响后续的CD34筛选。需要注意的是，中断操作不会影响CD34⁺细胞的得率和纯度。在完成CD34筛选后，细胞纯度必须高于75%方可用于接种，因为在先前的研究中发现，当纯度低于此值时，巨核细胞（MK）的分化与成熟效果较差¹²（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount 试管	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead 试剂盒 UltraPure，人源	Miltenyi biotec	130-100-453
离心机	Heraeus	Megafuge 1.OR	或同等材料
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	或同等材料
冻存管	Dutscher	55002	或同等材料
来自 Leuconostoc spp 的葡聚糖	Sigma	31392-50g	或同等材料
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1.5 mL	Dutscher	616201	或同等材料
过滤装置 Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
流式细胞仪	BD Bioscience	Fortessa
人源 LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0.1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
插入件	Fenwal	R4R1401	或同等材料
超净工作台	Holten	NA	已归档产品
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓缩液）	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	或同等材料
PGi2	Sigma	P6188
600 mL 转移袋	Macopharma	VSE4001XA
预分离滤器（30µm）	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan 扩增添加剂（100 倍浓缩液）	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0.22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
30 mL 注射器	Terumo	SS*30ESE1	或同等材料
注射器滤器 Millex 0.22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
50 mL 离心管	Sarstedt	62.548.004 PP	或同等材料
15 mL 离心管	Sarstedt	62.554.001 PP	或同等材料
管路	B Braun	4055137	或同等材料