去白细胞滤器来源的CD34+细胞作为研究巨核细胞分化与血小板形成的细胞来源

摘要

本方案详细描述了从白细胞滤器中获取CD34+造血祖细胞及其后续操作的全部步骤 体外 分化并成熟为能够释放血小板的产血小板巨核细胞，这些细胞可在培养基中释放血小板。该方法适用于深入分析调控巨核细胞生成的细胞与分子机制。

摘要

这 体外 扩增和分化人类造血祖细胞为能够延伸前血小板并释放血小板的巨核细胞，可深入研究血小板生成的潜在机制。目前可用的培养方案主要依赖于骨髓或脐带血来源的造血祖细胞，这引发了一系列伦理、技术和经济方面的顾虑。尽管已有从外周血获取CD34+细胞的现有方案，本文提出了一种简便且优化的方案，用于从血站中广泛可得的白细胞去除滤器中获取CD34+细胞。这些细胞来源于制备输血制品过程中使用的白细胞去除滤器，相当于八份献血样本，而这些滤器原本将被丢弃。本文详细描述了从此类滤器中分离鉴定为CD34+细胞的造血祖细胞的具体操作流程。同时，详尽阐述了获得成熟巨核细胞并促使其延伸前血小板的过程，并讨论其表型演变。最后，本方案提供了一种经过校准的移液技术，以高效释放在形态和功能上均与天然血小板相似的血小板。该方案可作为评估作用于该过程各个阶段的药理化合物的基础，用于解析其潜在机制并推进相关研究。 体内 血小板产量。

引言

血小板来源于一种特殊的大型多倍体细胞，即巨核细胞（MK），这些细胞起源于一个持续且精密调控的生成过程，称为巨核细胞生成（MKP）。该过程的起始阶段为造血干细胞，在骨髓微环境（细胞因子、转录因子、造血微环境）的作用下，这些干细胞能够增殖并分化为造血祖细胞（HP），进而定向进入巨核细胞谱系，最终发育为未成熟的巨核细胞。¹在多种细胞因子，尤其是巨核细胞主要细胞因子——血小板生成素（TPO）的作用下，巨核细胞（MK）将经历两个主要的成熟阶段：内有丝分裂和分界膜系统（DMS）的形成。完全成熟的巨核细胞随后出现在窦状血管附近，可伸出胞质突起即前血小板，后者在血流作用下释放，并进一步重塑为功能性的血小板²1994年TPO的克隆³ 为MKP的研究提供了推动，加快了其发展进程 体外 可实现造血祖细胞分化和巨核细胞成熟的培养技术。

血小板在数量（增多或减少）和功能方面均可能受到多种病理情况的影响^4,5能够重现MKP 体外 来自人类HP的研究可能增进对这一过程背后分子与细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。

多种人类造血祖细胞（HP）来源均适用：....

方案

对照组人源样本来自法国大东部地区血液中心（Etablissement Français du Sang-Grand Est）招募的志愿献血者，献血者均签署了书面知情同意书。所有实验程序已注册并获得法国高等教育与研究部批准，注册编号为 AC_2015_2371。献血者在 CODHECO 编号为 AC-2008-562 的知情同意书中同意其样本用于科研用途。涉及人类的研究均遵循赫尔辛基宣言进行。

1. 从LRF中提取和筛选CD34+细胞（HP）

1. 试剂准备（每个 LRF）
   1. 准备 25 mL 过滤后的洗脱缓冲液：21.25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）、2.5 mL 酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）和 1.25 mL 去补体胎牛血清（FBS）。用 0.22 µm 滤器过滤，并置于 37 °C 预温。
   2. 配制含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 500 mL PBS 溶液。
   3. 将 25 mL 密度梯度介质（DGM）（1.077 g/mL）分装至两个 50 mL 离心管中。
2. LRF 反向冲洗操作方法（图 1）
   注意：此步骤需要使用无菌管路焊接仪，以实现热塑性管路的无菌连接。
   1. 首先，将 LRF ....

结果

从LRFs中提取和筛选CD34+细胞
此处的方法源自 Peytour 等人⁹，描述了CD34的提取与筛选方法⁺ 血库中白细胞去除后废弃的白细胞滤器（LRF）中可获取的细胞。经过反冲程序后，通常可获得 1.03 x 10⁹ ± 2.45 × 10⁸ 细胞/LRF（均值±标准误；n = 155）的回收率为94.88 ± 0.10%（图2A i）。CD34阳性选择后，平均获得615.54 x 10³ ±12.28 个细胞/LRF（n = 155）图2A ii）。如果细胞数量少于300,000，则必须判断该操作未正确执行，并终止实验。为评估CD34阳性细胞分选的效果，需通过流式细胞术检测CD34+细胞的纯度（图2B）。通常预期.......

讨论

本方案描述了一种利用血液来源的造血祖细胞（HP）生成巨核细胞（MK）的方法，该巨核细胞能够释放前血小板并从培养基中释放血小板。造血祖细胞来源于白细胞滤除残余物（LRF），后者是血库在去除细胞类血液制品中污染性白细胞以避免不良反应时产生的副产品。尽管该方法相对简单，但有几个关键点需要特别注意。

将细胞悬液铺加到密度梯度介质上（步骤1.3.1）时必须轻柔操作，以避免混合（出现红色内容）。如果此步骤操作不当，应立即停止实验。同样，在步骤1.3.1中，离心机刹车必须处于关闭状态，以防止各组分混合。若未按此操作，则必须暂停HP筛选。如方案第1.4节所述，在PBMC收集完成后可中断实验流程。在此情况下，细胞可在4 °C条件下轻轻振荡保存过夜。随后使用40 µm细胞筛网去除形成的细胞团块，以免影响后续的CD34筛选。需要注意的是，中断操作不会影响CD34⁺细胞的得率和纯度。在完成CD34筛选后，细胞纯度必须高于75%方可用于接种，因为在先前的研究中发现，当纯度低于此值时，巨核细胞（MK）的分化与成熟效果较差¹²（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anti-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anti-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anti-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anti-CD42a-PE	BD Bioscience	559919
Apyrase	EFS-Alsace	NA
BD Trucount 试管	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead 试剂盒 UltraPure，人源	Miltenyi biotec	130-100-453
离心机	Heraeus	Megafuge 1.OR	或同等材料
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	或同等材料
冻存管	Dutscher	55002	或同等材料
来自 Leuconostoc spp 的葡聚糖	Sigma	31392-50g	或同等材料
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0.5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1.5 mL	Dutscher	616201	或同等材料
过滤装置 Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
流式细胞仪	BD Bioscience	Fortessa
人源 LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDINE 0.1 mg/1 mL	Bayer	MA038EX
插入件	Fenwal	R4R1401	或同等材料
超净工作台	Holten	NA	已归档产品
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100 倍浓缩液）	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	或同等材料
PGi2	Sigma	P6188
600 mL 转移袋	Macopharma	VSE4001XA
预分离滤器（30µm）	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Stemcell technologies	#72344
StemSpan 扩增添加剂（100 倍浓缩液）	Stemcell technologies	#02696
StemSpan-SFEM	Stemcell technologies	#09650
Stericup Durapore 0.22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclone	Thermos scientific	SH3007103
30 mL 注射器	Terumo	SS*30ESE1	或同等材料
注射器滤器 Millex 0.22µm PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Stemcell technologies	#02822
50 mL 离心管	Sarstedt	62.548.004 PP	或同等材料
15 mL 离心管	Sarstedt	62.554.001 PP	或同等材料
管路	B Braun	4055137	或同等材料