白细胞消除过滤器衍生的CD34 +细胞作为研究巨核细胞分化和血小板形成的细胞来源

血小板来自专门的大多倍体细胞，即巨核细胞（MK），其起源于称为巨核细胞（MKP）的恒定和微调的生产过程。该过程的顶点是造血干细胞，它们与骨髓环境（细胞因子，转录因子，造血龛）接触，将能够增殖并分化成能够致力于巨核细胞通路的造血祖细胞（HP），从而产生未成熟的MKs^1。在各种细胞因子的影响下，特别是血小板生成素（TPO），这是MKP的主要细胞因子;然后，MK将经历两个主要的成熟阶段:内膜分裂和分界膜（DMS）的发展。然后，这种完全成熟的MK出现在正弦血管附近，在该血管中它可以发射细胞质延伸，即丙酸盐，其将在血流下释放并随后重塑为功能性血小板²。1994年TPO的克隆³ 通过加速体 外 培养技术的发展，促进了HP分化和MK成熟的MKP研究。

有许多影响血小板的病理，无论是在血小板数量（增加或减少）和功能^方面4，5。能够从人类HP体外概括MKP可以提高对这一过程背后的分子和细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。

各种来源的人HP是合适的:脐带血，骨髓和外周血^6，7，8。与从脐带血或骨髓中恢复相比，从外周血中采集HP引起的后勤和伦理问题更少。HP可以从白细胞分离术或黄褐色外套中恢复，但这些来源很昂贵，并且在血液中心并不总是可用的。其他方案，更便宜，更容易执行，允许直接回收人外周血单核细胞（PBMC），而无需事先CD34驱动的分离^4，8。然而，这种方法对巨核细胞的纯度并不令人满意，建议从PBMC中选择CD34 +细胞以最佳分化为MK。这导致我们从白细胞还原过滤器（LRF）中实施了HP纯化，该过滤器通常用于血库中以去除白细胞，从而避免不良免疫反应⁹。事实上，自1998年以来，法国的血小板浓缩物已被自动白细胞化。在此过程结束时，LRF被丢弃，所有保留在LRF中的细胞都被破坏。因此，LRF中的细胞很容易获得，无需额外费用。LRF具有接近白细胞分离术或黄褐色外套获得的细胞含量，特别是其CD34 + HP的组成使它们成为非常有吸引力的来源¹⁰。LRF作为人类HP来源已被证明可以为细胞提供完整的功能容量¹¹。这种来源的优点是丰富且价格合理，可用于实验室研究。在此背景下，本文依次描述了:i）从LRF中提取和选择CD34⁺ HP;ii）两阶段优化培养，其概括了HP对巨核细胞途径的承诺以及能够释放丙酸盐的MK的成熟;iii）从这些MK中有效释放血小板的方法;和iv）表型MK和培养血小板的程序。

对照组的人体样本是从自愿献血者那里获得的，他们给予了由进行研究的输血中心（Etablissement Français du Sang-Grand Est）招募的书面知情同意书。所有程序均由法国高等教育和研究部注册和批准，并以AC_2015_2371号注册，捐赠者在CODHECO编号AC-2008 - 562同意书中给予批准，以便将样品用于研究目的。根据赫尔辛基宣言进行了人体研究。

1. 从LRF中提取和选择CD34 +细胞（HP）

1. 试剂的制备 （用于一个LRF）
   1. 准备25 mL过滤洗脱缓冲液:21.25 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），2.5 mL酸性柠檬酸盐葡萄糖（ACD）和1.25 mL分解胎牛血清（FBS）。过滤0.22μm，置于37°C。
   2. 准备500毫升PBS和2毫升乙二胺四乙酸（EDTA）。
   3. 将 25 mL 密度梯度培养基 （DGM） （1.077 g/mL） 放入两个 50 mL 管中。
2. LRF反冲洗模式（图1）
   注意:此步骤需要无菌管焊接机，允许无菌连接热塑性管道。
   1. 首先，将LRF连接到空的600 mL转运袋，将LRF连接到管路组（图1A）。在生物安全柜下，将与处理的LRF数量相对应的过滤和制备的洗脱缓冲液的总体积（xLRF x 25 mL）注入空袋中。然后，使用30 mL注射器通过LRF轻轻抽吸袋的全部内容物，反冲洗并将细胞转移到新的50 mL管中（图1B）。
   2. 对红细胞沉降，用葡聚糖2%稀释细胞悬浮液一半，充分混合以聚集红细胞。在室温（RT）下等待30分钟。

图1:LRF反冲洗方式（A）代表方案（i）将转运袋与LRF无菌连接，以及（ii）将管道设置到LRF。（B）用于细胞收集的注射器连接的代表性方案。请点击此处查看此图的放大版本。

3. PBMC 收集
   1. 红细胞沉降后，取出上清液并将其转移到50 mL管中，并用PBS-EDTA 2 mM填充。将上清液轻轻覆盖到上述制备的DGM上。让上清液轻轻流动，而不会破坏密度梯度的表面平面。在关闭制动模式下，在室温下以400 x g 离心30分钟。
   2. 使用一次性转印移液器收集PBMC层。将细胞从每个DGM管转移到新的无菌50 mL管中。用PBS-EDTA 2 mM填充每个管，并在50 mL PBS-EDTA 2 mM中以200 x g 在室温下在制动模式下洗涤两次10分钟。
   3. 移液并用50 mL PBS-EDTA 2 mM移液细胞沉淀。
      注意:可以通过在夜间将收集的细胞保持在4°C的搅拌下来停止该过程。然后，用40μm细胞过滤器过滤悬浮液以除去形成的聚集体。
4. CD34+细胞选择
   1. 确定细胞数，并在室温下以400×g离心10分钟，然后打开。
   2. 完全吸出上清液，并重悬于CD34选择试剂盒制造商详细介绍的适当体积的PBS-EDTA 2 mM中（300μLPBS-EDTA用于10^个8 个细胞）。加入FcR封闭试剂和CD34微珠，浓度适当（50μL，10⁸ 个细胞）。
   3. 在4°C下30分钟后，洗涤细胞悬浮液并重悬于CD34选择试剂盒制造商详细描述的适当体积的PBS-EDTA 2mM（每10^个8 个细胞500μL）。
      注意:选择是在排序列上进行的，每列最多通过2 x 10⁹ 个单元格。
   4. 将样品传递到磁铁的湿柱上。用3 mL PBS-EDTA 2 mM洗涤两次，并用5 mL PBS-EDTA 2 mM洗脱细胞。为了提高样品的纯度，有必要按照相同的程序在新色谱柱上进行第二次运行。
      注:预期数量为6.1 x 10⁵ 个电池/LRF（图2A）。对于较高的 LRF 值，请相应地放大试剂和方法。
5. 评估CD34+细胞纯度
   1. 加入CD34⁺ 选择后获得的100μL悬浮液等分试样，2μL人CD34-PE抗体或2μLIgG - PE（对照）。充分混合并在4°C下孵育15分钟。
   2. 通过加入2mL PBS洗涤细胞，并以400×g离心5分钟。 完全吸出上清液并重悬于200μLPBS中。
   3. 通过流式细胞术分析纯度， 如图2A 所示，并在 讨论中。
      注:预计CD34+细胞的纯度高于90%（图2Bii）。
   4. 直接使用CD34 +细胞或冷冻以进一步使用。
6. CD34+细胞冷冻
   注意:CD34 +细胞冷冻以每毫升10⁶ 个细胞的密度进行。

从LRF中提取和选择CD34 +细胞
在这里，该方法源自Peytour等人9，描述了从白细胞去除后血库中可用的废弃LRF中提取和选择CD34+细胞。在反冲洗程序之后，通常恢复1.03 x 10 9±2.45 x10 8个细胞/ LRF（平均值±SEM; n = 155），存活率为94.88±0.10%（图2A i）。在CD34阳性选择后，获得平均615.54×10 3±12.28个细胞/LRF（n = 155）（图2A ii）。如果细胞数量少于300，000，则必须得出结论，该过程未正确执行，必须停止。为了评估CD34选择的成功，通过流式细胞术评估CD34 +细胞的纯度（图2B）。通常，纯度高于90%（91.88±0.79%）（图2B）。纯度低于75%可能意味着在进行协议时存在问题，特别是色谱柱的洗脱。低于75%的纯度，细胞不被保存用于培养实验。

图2:CD34 +细胞数/ LRF和CD34纯度分析（ A）（i）通过细胞计数器分析在包括PBMC收集和CD34选择在内的程序后获得的细胞数量及其活力（（1.03.109 ±2.45.108个细胞/ LRF（平均±SEM;n = 155），活力为94.88±0.10%（n = 155））。（ii） 在CD34选择（615.54 x 10 3 ±12.28个细胞/ LRF （n = 155））之后，也通过细胞计数器进行分析。（B） CD34纯度通过流式细胞术分析。（i）用CD34-PE抗体染色细胞，并在其FSC / SSC参数上鉴定。（ii）基于散射信号和CD34表达分析，确定纯度。基于CD34标志物的阴性对照，使用CD34阳性的预门。（iii） 从条形图上可以看出，CD34+细胞的纯度预计高于90%（91.88±0.79%（n = 17））。请点击此处查看此图的放大版本。

含MK的丙烯的差异和成熟
所描述的细胞培养过程分为两个步骤。第一个，从第（D）天0到D7，致力于HP增殖和承诺进入巨核细胞途径，以响应细胞因子的组合和化合物SR1的添加。第二个，从D7到D13，重点是添加TPO和SR1之后的MK成熟和丙酸盐延伸（图3A）。作为培养物的质量控制，细胞计数，细胞活力的测定和细胞的表型，在D7和D10处进行。之所以选择这些阶段，是因为它们分别对 HP 承诺、D7 和 MK 成熟度 D10（个人数据）至关重要。在D7和10处，增殖通常分别为x4.16±0.25（n = 34）和x2.30±0.16（n = 5），细胞活力在86.38±0.73%（n = 34）之间;和84.80±2.67%（n = 5）（图3B）。关于细胞表型，如图3C所示，在D0处，超过90%的细胞CD34呈阳性。然后，CD34 +细胞致力于巨核细胞谱系，正如CD41的幻影所见证的那样，CD41是MKP的特异性和早期标志物。事实上，在D7，50.20±2.90%的细胞对CD34和CD41均呈阳性（图3Bii）。然后，MK改善了它们的成熟度。在D10，大多数MK是成熟的，不到15.60±4.70%的细胞CD41阴性，47.90±8.90%是CD34+CD41 +，36.40±12.40%是CD34-CD41+（图3Biii）。

图3:含MK的丙烯酸盐的差异和成熟。（A）细胞培养程序的代表方案。使用两步法:从D0到D7的增殖步骤（SR1和细胞因子混合物）和从D7到D13的成熟步骤（SR1和TPO）。在D13，培养的血小板可以在连续五次移液后释放。（B） （i） D7 时的增殖速率 （x4.16 ± 0.25 （n = 34）） 和细胞活力 （86.38 ± 0.73% （n = 34））。（ii）D10时的增殖速率（x2.30±0.16（n = 5））和细胞活力（84.80±2.67%（n = 5））。（C） 流式细胞术分析培养物中MK表型演化的现状。在D0时，95.80±0.80%的细胞为CD34阳性（n = 3）。在D7时，50.20±2.90%的细胞CD34和CD41呈阳性。在D10时，小于15.60±4.70%的细胞CD41阴性。请点击此处查看此图的放大版本。

培养的血小板释放，第13天
对D13井的检查显示圆形MK和含丙酸盐MK（图4A）。平均35%的培养MK延伸丙酸盐12。值得注意的是，D13是丙酸盐扩张和血小板释放的最佳日期。如果未达到能够发射丙酸盐的MK水平，则在培养过程中一定出了问题，不应考虑结果。

虽然促进成熟MK释放血小板的确切机制仍然知之甚少，但众所周知，血流动力学力是必不可少的。为了 在体外模拟这些力，含有含有丙酸盐的MK的悬浮液被吸气并用P1000锥体排斥五次，然后通过流式细胞术进行分析。为此，使用含有校准数量的荧光珠的管子。首先，进入管中的珠子被门控在CD41-Alexa-fluor 488 / PErcP-Cy5窗口上（图4Bi，红色）。然后，在预门（血小板样元件）中可视化培养的血小板，在天然血小板的前向散射（FSC）和侧散射（SSC）参数上测定（图4Bii）。然后将血小板的数量确定在其CD41 / CD42a阳性上（图4Biii）。在此方案中，细胞计数在5，000个磁珠时停止，但根据供应商的建议，可以使用另一个固定数字。从获得的数据中，每5，000颗磁珠计数的血小板数量通常平均为24.01±92（n = 15）（图4C）。知道流式细胞仪吸入的体积以计数5，000个微球（将为每个细胞计数器计算）和培养物的总体积，可以获得释放的培养血小板总数的近似值。

图4:培养的血小板在第13天释放。（A）MK在D13处发射丙酸盐的代表性光学显微镜图像。（B） 定量培养血小板释放的策略。（i） 磁珠位于 CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 窗口（红色）上。（ii）血小板样元素在天然血小板（灰点）的FSC / SSC参数确定的门中可视化。（iii） 培养的血小板根据其CD41 / CD42阳性（紫色）确定。（C）可以获得每5，000个微球计数的血小板数量，通常平均为24，011±919（n = 15）。请点击此处查看此图的放大版本。

程序一览
为了更好地总结方法并理解每个步骤， 图5中提供了一个逐步总结协议的海报。此摘要表可以显示在文化室中，并用作备忘录。值得注意的是，实验的成功只有在提供的表格中指示的产品参考才能得到保证。

图5:CD34+的分离。 海报逐步总结协议。 请点击此处查看此图的放大版本。

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