使用巴库洛病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

摘要

巴库洛病毒表达载体系统 （BEVS） 是用于生化、生物物理和结构研究的蛋白质精氨酸甲基转移酶 （PRMT） 表达筛查和生产的强大平台。可用于大多数PRMT和其他需要真核表达平台的兴趣蛋白质，可生产毫克量的材料。

摘要

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）甲基酸精氨酸残留在多种蛋白质上，在许多细胞过程中发挥作用。PRMT 可以对称或不对称地对称地使用单或二甲基酸精氨酸瓜尼迪诺组。这些蛋白质的酶学是一个复杂而经过严格研究的领域，需要毫克量的高质量重组蛋白。 采用多 核病毒（AcMNPV）和 斯波多普泰拉节俭 9（Sf9）昆虫细胞的巴库洛病毒表达载体系统（BEVS）已用于表达筛查和生产许多PRMT，包括PRMT 1、2和4至9。为了同时筛选这些蛋白质的多个构造的表达，包括域和截断片段以及全长蛋白质，我们应用了可调节和可编程多通道移液器的可扩展方法，以及 24 和 96 井板和方块。总的来说，这些方法的调整使得大规模生成巴氏DNA、重组病毒和蛋白质表达筛查成为可能。使用填充量大的Sf9细胞悬架培养容器有助于克服单批大规模蛋白质生产生产管道中的空间限制。在这里，我们描述了用于生化、生物物理和结构研究的高效和具有成本效益的实用PRMT表达的详细协议。

引言

蛋白质精氨酸甲基转移酶 （PRMTs） 甲基酸酯精氨酸残留物以单甲基或对称/不对称的二甲基方式。重复的RG/RGG/GRG序列是大多数PRMT非常青睐的，存在于各种各样的蛋白质^1，2中。精氨酸甲基化蛋白，如组蛋白或转录因子和拼接因子调节转录，拼接，和染色质结构^3，4。对PRMT基材和共因子利用、周转和动力学的多样化调节以及选择性抑制剂的产生日益了解，为这些酶及其复合物^5、6揭示了机械学的光芒。然而，并非所有的PRMT家庭成员都受到同等程度的研究:例如，PRMT9最近才被发现是PRMT家族¹的成员。这些蛋白质的结构和酶功能研究需要充足的，通常是毫克，大量的重组蛋白可用。

大肠杆菌（大肠杆菌）益角质表达系统通常是表达筛查的首选，它利用给定蛋白质^7、8、9的多种结构进行表达筛查。然而，基于大肠杆菌的表达并不总是导致足够的PRMT蛋白质在其活性形式，正如我们特别注意到的PRMT5和PRMT7（见下文）。因此，未能用大肠杆菌表达或需要由真核表达机制生产的PRMT被分包成适合替代巴库洛病毒表达载体系统（BEVS）表达筛查的载体。虽然大肠杆菌表示PRMT1、PRMT3和PRMT8的样本已广泛用于体外测定和晶体造像，但其他PRMT，如PRMT5，需要其双甲基转移酶领域的MEP50结合伙伴，而PRMT7和9等PRMT则需要昆虫细胞表达才能获得足够数量的活性蛋白质。总体而言，PRMT4、5、6、7和9的标准化中通量甲基转移酶检测已在^{昆虫细胞6}中利用了 BEVS。巴库洛病毒表达载体系统 （BEVS） 是一个多功能平台，用于生产需要真核表达机制的重组蛋白，这种机制能够进行对生化、生物物理和结构研究^10、11、12所必需的转化后修饰。自1983年首次报告使用巴库洛病毒进行蛋白质表达¹³以来，已有数种 BEVS 上市。这些协议大多采用不同的策略，将表达质粒转移到昆虫细胞中。其中包括巴卡到巴克， 闪光巴， 巴库洛戈尔德明亮， 巴克维克托 - 3000， 巴奇马吉奇， 巴帕克等。我们的协议是基于在BVS中最常用的系统，Bac-to-Bac系统^14，这是旨在通过现场特定的转位¹⁵将感兴趣的蛋白质（POI，这里为PRMTs）编码到大肠杆菌的特异性菌株中保存的巴库洛病毒基因组。

简言之，含有感兴趣基因的质粒转移载体被转化为DH10Bac 大肠杆菌 能力细胞，以产生重组病毒巴氏DNA。粘附的Sf9细胞随后被巴米德DNA转染。转染后四到五天，初步重组的巴库洛病毒被回收并标记为P1病毒。然后，P1巴库洛病毒库存用于病毒放大（即P2巴库洛病毒库存的生成）和蛋白质表达筛查。根据表达筛选结果，确定了P2病毒，以最佳表达结构的蛋白质，并用于产生巴库洛病毒感染昆虫细胞（SCBIIS）的悬浮培养物，用于大规模蛋白质生产。在这里，我们描述我们的详细协议，并描述我们的试剂和文化容器选择背后的理由，以支持我们的战略，开发一个更省时，经济高效，可扩展的方法，以获得足够的期望的重组蛋白。

方案

注:BEVS 协议步骤的概述在 图 1中概述。

1. 重组巴米德DNA的生成

1. 为DH10Bac转换准备LB阿加选择性板
   1. 准备含有:50微克/毫升卡那霉素、7微克/毫升根塔霉素、10微克/毫升四环素、200微克/毫升蓝光加仑和40微克/毫升IPTG的LB agar板，以选择DH10Bac变压器。
   2. 重量 25 克预混合 Lb 汤和 13 克巴托阿加， 放入 2 升烧瓶。将体积达到 1 升，蒸馏水和高压灭菌器在 121 °C 下使用 15-30 分钟。
   3. 将水浴设置在 50 °C，在水浴中冷却自碎的 agar 溶液 40-60 分钟，直到冷却至 50-55 °C。
   4. 在冷却溶液中，将根酰胺加入最终浓度为 7 μg/mL，将卡那霉素添加到最终浓度为 50 μg/mL，四环素最终浓度为 10 μg/mL，Bluo-gal 最终浓度为 200μg/mL，IPTG 最终浓度为 40 μg/mL。
   5. 使用 50 mL 移液器将中等 7-10 mL 的 agar 解决方案与每个 60 mm 板混合。让盘子在室温下（2小时）变硬。倒置、包装和存储在 4 °C。 含有抗生素的板稳定长达4周。
2. 将质粒转化为DH10Bac大肠杆菌称职细胞
   1. 计算所需的合格细胞体积。
   2. 在冰上解冻称职的细胞，轻轻旋转，轻轻敲击后恢复。
   3. 使用 12 个通道移液器将 4 μL 的细胞分配到 96 井 PCR 板的每口井中。
   4. 将 ~0.3-0.5μg 重组质粒DNA添加到称职的细胞中，然后通过敲击轻轻混合。在冰上孵化混合物10-15分钟。
   5. 在 42 °C 的 45s 下，在 PCR 机器中加热冲击混合物。在冰上冷却2分钟。
   6. 向 96 井块（96 深井 2.4 mL）的每口井分配 0.5 mL 的 SOC 中等升。
   7. 使用 12 通道移液器将转化的细菌悬架转移到块的相应井中，并用气孔板盖住它。
   8. 将方块置于摇晃的孵化器中，温度为 37 °C，中等搅拌（205 rpm），时速为 4-5 小时。
   9. 使用无菌玻璃珠在LB agar板表面均匀地传播30-50 μL的培养物。将其余文化存储在 4 °C。
   10. 在 37 °C 孵化板，直到蓝/白菌落的颜色清晰可辨 （40-48 h）。当盘子里有足够的白色、大殖民地时，丢弃文化。
   11. 为了确保白色殖民地只含有重组的巴氏DNA，将一个孤立的白色菌落重新涂在含有抗生素、蓝加仑和IPTG的新鲜LB agar板上，以验证表型。
   12. 在37°C下孵化48小时。
   13. 从重新条纹的盘子中挑选一个经过验证的白色菌落，用于提取重组的巴基德DNA。
3. 分离重组巴米德DNA
   1. 将单个孤立的白色菌落接种到 3 毫升的 LB 介质中，辅以 50 微克/毫升卡那霉素、7 微克/mL 根塔霉素和 10μg/mL 四环素，在 24 井块（24 井块圆底）中盖上气孔片。
   2. 在 37 °C 的夜间生长，在 250 rpm 时摇晃。
   3. 以 2，100 x g 的速度将 24 井块离心 10 分钟。去除超自然，倒置方块，轻轻敲击吸水纸巾。在每个井中加入 250 μL 的解决方案 1（细胞悬念解决方案）。
   4. 用胶带垫或任何其他密封膜密封这些方块，并在 75 rpm 时将其放置在摇晃平台上 5-10 分钟。检查每口井，以确保适当的细胞裂解，并在必要时使用1mL提示进行补给。
   5. 在每个井中加入 250 μL 的溶液 2（细胞裂解溶液），密封方块，并在 75 rpm 的摇晃平台上放置 30 秒（以避免样品交叉污染，不要倒置 24 井块），在室温下孵育 4 分钟。
   6. 添加 250 μL 的解决方案 3（中和解决方案），密封方块，并在 75 rpm 时将块放置在摇晃平台上 30s。将形成厚厚的蛋白质和 大肠杆菌 基因组DNA的白色沉淀物。将样品放在冰上10-15分钟。
   7. 离心机在 2，100 x g 在 4 °C 下 60 分钟，以紧密颗粒白色沉淀材料。在离心过程中，标记新的微中燃料管，并添加 0.8 mL 的绝对异丙醇。
   8. 轻轻地将超自然物质转移到含有异丙酚的管子上，避免任何白色沉淀物。轻轻倒置管子几次，然后放在冰上5至10分钟。在此阶段，样品可在 -20 °C 过夜存储。
   9. 在 4 °C 下，在 14，000 x g 时将样品离心 15 分钟。 去除超自然，并在每个管中加入 0.5 mL 的 70% 乙醇。倒置管子几次来清洗颗粒。在室温下，在14，000 x g 下，离心机5分钟。（可选:重复洗涤）
   10. 将样品带入层压流罩中，以确保质粒制备的无菌性，并尽可能多地去除超自然。
       注意:颗粒可能会从管子底部脱落，因此在丢弃超自然体时要小心观察颗粒。
   11. 将层压流罩内的颗粒空气干燥 15 - 20 分钟，并将 DNA 溶解在 50 μL 的过滤洗脱缓冲器中，10 mM Tris-Cl，pH 8.5（确保颗粒不会过干）。
   12. 由于重组的巴基德DNA大于135 kb的大小，为了避免DNA的剪切，通过轻轻敲击溶解颗粒。
   13. 为了验证对巴氏DNA感兴趣的基因的存在，在96井PCR板中设置PCR反应组合。
   14. 准备 PCR 混合如下: 1μL 缓冲器， 0.2 μL （每个 10 mM） dNTP， 0.1 μL 的塔克 DNA 聚合酶， 0.1 μL （25 μM） 的前进和反向引物 （BACV2FWD: 塔特加特卡塔克;BACV2REV:ctctacaatgtgc），1μL的巴基德DNA和8微l的水。
   15. 在 95 °C 时对初始变性目标基因进行放大 2 分钟，然后在 30 秒内进行 25 个周期的 94 °C，在 30s 时进行 55 °C 的放大，在 1 分钟/kb 下进行 72 °C 的 72 °C。
   16. 在 72 °C 的最后扩展后终止反应 7 分钟。
   17. 通过电泳分析含有核酸染色溶液的 1% （w/v） agarose 凝胶上的放大产品的 10 μL。
   18. 将经过验证的巴氏杆菌 DNAs 存储在 4 °C。

2. 重组杆菌股票的生成

注意:使用指数增长的Sf9细胞，其生存能力为95%或更高，用于巴库洛病毒表达协议的任何步骤，包括巴库洛病毒生成的细胞转染、巴库洛病毒体积放大、蛋白质表达筛查和蛋白质生产。

1. Sf9细胞与巴米德DNA和转染试剂（T.R.）的传输，如喷气骄傲或X-特雷梅根9。
   注:Trypan 蓝色染色和血细胞计可用于确定可行的细胞计数和% 细胞生存能力。不可行的细胞占据污渍，在显微镜下呈蓝色，而可行细胞则保持未染色。为了计算百分比细胞的生存能力，获得总细胞计数（未染色和染色），可行的细胞计数除以总细胞计数，乘以 100。
   1. 将成倍增长的Sf9细胞稀释到血清无昆虫介质中^{4×10 5} 细胞/mL的最终细胞密度，并倒入无菌试剂储液库。
   2. 使用可编程多通道移液器将稀释的 Sf9 细胞的 0.5 mL 播种到 24 井板的每口井中。
   3. 将板的一口井标记为控制（未传输），并将其用作控制，以比较被感染和未传播的细胞，以评估潜在的感染迹象。
   4. 将细胞播种到板中后，轻轻来回摇动板数次，以确保细胞的单层均匀。不要旋转板块，因为细胞会聚集在井的中心。
   5. 在 27 °C 下孵化板至少 1 小时，以便细胞附着在培养板上。
   6. 很好地混合变电试剂小瓶。对于每次传输，将转染试剂的 2 μL 添加到转染缓冲器的 100 μL 中。任何其他未补充的昆虫介质也可以使用。将稀释后的输血试剂存放在无菌试剂储液中，轻轻混合10s。
   7. 使用 12 通道移液器，将稀释的输血试剂的 102 μL 传输到无菌的 96 微孔板中。
   8. 将重组的巴密德DNA的0.2微克/μL溶液中的10μL转移到96井微井板的相应井中，然后从两侧轻轻摇动（敲击）板混合。
   9. 将转染混合物孵育15-20分钟，以实现复杂的形成。
   10. 使用可调节的 6 通道移液器，设计用于在 96-和 24 井板之间传输，将转染混合物加入细胞，顺流到相应的转染板井中，在 27 °C 时孵育 4-5 h。
   11. 在孵化期间，轻轻来回摇动板数次，以确保转染混合物在细胞单层上的均匀分布。
   12. 4-5小时后，加入1.5 mL的无虫血清介质补充10%（v/v）最终热灭活胎儿牛血清和抗生素抗菌剂到1%（v/v）最终体积（100单位/mL青霉素， 100微克/mL链霉素和0.25微克/mL的安培霉素B）。
   13. 将细胞孵化在 27 °C 孵化器中，以 72-96 小时的速度进行孵化。尽可能每天轻轻摇动一次变形板。
   14. 寻找感染迹象（SOI），在转染后72-96小时的转染细胞中明显（图2）。请记住，受感染的细胞将开始产生病毒并进一步感染培养:因此，寻找感染的迹象。
       注意:感染的迹象是昆虫细胞的结构变化，如细胞直径增加25-50%，细胞核扩大，形状均匀圆润，增殖损失和粘附于培养皿表面，以及细胞生存能力下降（图2）。巴库洛病毒感染和未受感染的Sf9细胞）。

3. 小规模蛋白质表达筛查和病毒放大

1. 感染Sf9细胞与P1巴库洛病毒股票。
   注:与倒置显微镜下的控制（未传输）细胞相比，在转染细胞中应显示感染迹象。最初分泌到细胞培养介质中的重组杆菌病毒应准备好收集。
   1. 种子 2 x 10⁵ 指数级生长 Sf9 细胞在无血清昆虫介质到 24 井板的每口井，总体积为 2 mL，用于感染 P1 病毒以放大病毒体积（导致 P2 病毒的生成）。
   2. 将细胞输送到板中后，轻轻摇动板，使用来回运动，以确保单层均匀。不要旋转板块，因为细胞会聚集在井的中心。
   3. 在 27 °C 下孵化板至少 1 小时，以便细胞粘性到板。
   4. 将密度为3.5-4 x 10⁶ 的Sf9细胞以无昆虫血清介质分配到24井块的每口井中，感染P1病毒进行蛋白质表达筛查。
      注:在寻找 SOI 时，将 24 井板和 24 井块中的一口井标记为控制并用作未受感染的控制，用于比较受感染和未受感染的细胞。
   5. 使用可编程电子多通道，允许同时收集 P1 病毒（步骤 2.1.13）、新种子 Sf9 细胞感染（步骤 3.1.1）以及使用 150 μL 的 P1 病毒在 24 井块（步骤 3.1.4） 中的悬浮细胞的感染。
   6. 以 17，970 x g的速度将收集的 P1 病毒库存的其余部分旋转 15 分钟，将其转移到微中微管中，并在 4 °C 的黑暗中储存。
   7. 轻轻地将 24 井板（步骤 3.1.1）摇到返回式摇床上，以确保添加的 P1 病毒均匀地分布在细胞单层上;在孵化过程中重复几次。
   8. 用受感染的 Sf9 细胞的悬浮培养（第 3.1.4 步）用气孔板覆盖 24 井块。
   9. 在 27 °C 时孵化 24 井块，在 245 rpm 时摇晃 72-96 小时。
   10. 在含有 P2 病毒的 24 井板（步骤 3.1.1）和带有受感染细胞的 24 井块（步骤 3.1.4）的 24 井板中，在 72-96 h 后寻找 SOI，以便进行表达筛查。
       注:在Sf9细胞感染P1病毒4-5天后，与倒置显微镜下未受感染的控制细胞相比，SOI应在受感染细胞中明显可见。
   11. 从 24 井板收集 P2 病毒，离心机在 17，970 x g下 15 分钟，将其转移到微中微富管中，并在 4 °C 的黑暗中储存。
   12. 在感染后72-96小时，用70%乙醇喷洒在24井块上，进入层压流罩，并通过Trypan Blue染色检查几口井中的细胞密度和生存能力。
   13. 继续蛋白质纯化，如果细胞有感染的迹象和生存能力接近70-75%，由Trypan蓝色染色评估。
   14. 在 4 °C 下以 525 x g 的离心距离离心 24 井块对细胞进行 15 分钟的颗粒。丢弃超自然物，彻底重新悬浮裂解缓冲器 1 mL 中的颗粒，包括 25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl， 0.6% NP-40， 2 mM imidazole， 5% 甘油 （v/v） 和 1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （100x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒包括阿普罗汀 0.25 毫克/mL， 麻黄素 0.25 毫克/mL， 肽 A 0.25 毫克/mL;E-64 0.25毫克/升）。
   15. 将细胞悬架存储在 -80 °C 以进行后续测试净化（参见 3.2.2）。
2. 在24井测试表达块中从冷冻细胞悬浮中提纯蛋白质。
   1. 装订块的组装（图3）。
      1. 将 3 层重叠的护膜放在 96 深井块（96 深井 2.4 mL）的顶部。
      2. 在 96 深井块顶部放置一个 96 井滤芯板（滤微板、96 井聚丙烯和 25μm 超高分子量聚乙烯膜）。
      3. 向下推滤板，将尖端固定到底片中，以密封 96 井深块的滤芯板。
      4. 将 50 μL 的预平衡 50% Ni-NTA 树脂泥浆输送到过滤板的每口井中。
   2. 测试表达程序
      1. 将冷冻细胞悬架（第 3.1.15 步）放在 RT 水浴的 24 井块中 5-10 分钟，然后在 450 rpm 处摇动 20 分钟。
      2. 以 3，275 x g 的速度将 24 井块离心 15 分钟。
      3. 使用多通道移液器，将清除的 lysates 转移到含有 50 μL 预平衡 50% Ni-NTA 树脂泥浆（步骤 3.2.1.4）的滤光板中，并用 96 井帽垫（96 井帽垫，用于平方井，2 mL）密封过滤板。
         注意:在孵化和离心过程中，使用一些橡皮筋将绑定块保持在一起。
      4. 将固定的绑定块放入冷室的旋转器中 45-60 分钟，用 Ni-NTA 树脂孵育清除的赖苏。
      5. 孵化后，小心地抬起滤板，从96深的井块表面（第3.2.1.1步）取出底膜层。
      6. 将滤盘放回 96 深井块顶部，在 235 x g处向下旋转固定绑定块 2 分钟。
      7. 洗涤键 Ni-NTA 树脂 2 倍，洗涤缓冲器为 2mL，包括 25 mM Tris pH 8.0、300 mM 纳Cl、5% 甘油和 15 m m imidazole。
      8. 每次在 235 x g 下用洗涤缓冲器旋转块 5 分钟，以确保完全去除残留液体。
      9. 将过滤板转移到 96 井 PCR 板的顶部，其中含有 10 μL 的 4 倍加载染料。
      10. 在滤盘的每口井中加入 40μL 的洗脱缓冲液（25 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、5% 甘油、500 mM 伊米达佐尔），孵育 5 分钟。
      11. 在 235 x g 下旋转块，将蛋白质排入 96 井 PCR 板中，10 分钟。
      12. 用耐高温水龙头密封 96 井 PCR 板，在 98 °C 处加热 3 分钟。
      13. 在标准 Laemmli 缓冲区中加载 15 μL 的 eldol 蛋白样品，在蛋白质梯子旁边的 4-20% SDS-PAGE 凝胶上，使用含有 SDS 的标准运行缓冲器运行凝胶。
      14. 用库马西蓝色染色凝胶，用水去污渍。分析测试表达的结果，确定大规模生产的最佳表达结构。

4. 为蛋白质生产准备受巴库洛病毒感染的昆虫细胞（SCBIIC）

1. 比预定生产时间早4天， 将成倍增长的 Sf9 细胞拆分为 125 mL / 250 mL / 500 mL Erlenmeyer 玻璃摇动烧瓶，在 50 mL / 100 mL / 200 mL 的无昆虫血清介质中含有 1% （v/v） 最终抗生素抗菌剂。
2. 加入 0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL 适当的 P2 病毒，在轨道摇床上以 165 rpm 孵育受感染细胞，中风 1 英寸，温度较低，温度为 25 °C，以减缓细胞分裂。
3. 感染后4天，在显微镜下检查SAI的细胞，如果用Trypan蓝色污渍验证的细胞存活率接近70-75%，则继续生产。

5. Sf9细胞制剂，用于大规模蛋白质生产

1. 在预定生产时间前4天，计算大规模蛋白质生产所需的Sf9细胞体积。
2. 种子 2 L 的指数增长 Sf9 细胞在昆虫血清无中等到细胞密度 1 x 10⁶ 细胞 /mL 在 2.8 L Fernbach 摇动烧瓶.
3. 在 27 °C 孵化烧瓶，摇晃设置在 150 rpm。
   注意:为防止 Sf9 细胞培养中的细菌污染，使用根酰胺素的最终浓度分别为 10 微克/mL 或青霉素/链霉素至 50 U/mL 和 50μg/mL。

6. 使用 SCBIIS 感染 Sf9 细胞，用于大规模蛋白质生产

1. 将昆虫血清无中等中度中成倍增长的 Sf9 细胞的 2 升或 4 升拆分到 2.5 L Tunair 摇动烧瓶或 5 升试剂瓶中的最终细胞密度为 4 x 10⁶ 细胞/mL。
2. 添加10-12毫升/升的巴库洛病毒感染昆虫细胞（SCBIIC）悬浮培养。
3. 在 72-96 小时的低温下，在 145 rpm 的摇床上孵育 Sf9 细胞的受感染培养。
4. 感染后72小时，在显微镜下检查细胞是否为 SOI，并评估细胞的生存能力。
5. 通常，感染后约72小时后，Sf9细胞的存活率下降到70%-75%（使用Trypan蓝色污渍测量）。在 4 °C 下，在离心 900 x g 的离心处理中，在 1 L 聚丙烯瓶中收获受感染的 Sf9 细胞 15 分钟。
6. 通过轻轻旋转并转移到 50 mL 圆锥管，用 20-25 mL 的 1x PBS 将从生产细胞培养物的 1 升中收集的细胞颗粒重新注入。
7. 在 900 x g 下旋转细胞悬架 15 分钟，然后丢弃 PBS 解决方案。
8. 用20-25 mL的悬浮缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，5%甘油，1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒）和液氮闪光冻结，重新注入洗涤细胞颗粒:储存在−80°C，直到净化。
   注:SGC发表的第⁶号文件详细描述了PRMT的净化程序。

结果

BEVS 协议的概览在图 1中概述。结构基因组学联合会（SGC，多伦多）根据内部策略生成了PRMT的多个表达结构，包括全长、域和截断片段，试图提高识别表达水平为^7、9的可溶性和稳定蛋白质的成功率。我们鼓励有兴趣的读者回顾SGC的定义和方法，即设计一个"片段"作为基因序列的片段并入到表达克隆中，"域"作为PFAM注释的结构域，以及"构造"为在表达载体中克隆的片段，所有这些都在早期出版物⁷中详细描述了。本协议中提出的PRMT的表达结构用于生产克隆到pFBOH-MHL载体中的多希丁标记蛋白质，这是pFastBac1载体的衍生物。在图 4中，我们介绍了 SDS-PAGE 分析 PRMT1 的标记可溶性构造，2、4-9 从 Sf9 细胞 4 mL 生产后收集的颗粒中纯化（步骤 3.1.4）。全长 （FL） PRMT1 和 PRMT9 不在此凝胶中呈现，因为 FL PRMT1 由大肠杆菌生产，而由 BEVS 生产的 FL PRMT9 已通过旗标记⁶进行净化。PRMT1、FL PRMT4 和所有 PRMT8 构造的截断结构都显示出相对较高的产量，但蛋白质升高含有部分共纯污染物。这些构造需要进一步优化净化协议。因此，需要采取其他方法，提高这些蛋白质的纯度，从扩大生产，如减少镍珠的数量在孵化阶段与澄清的利萨特:洗涤缓冲区中二甘二甲酰浓度的增加;的他的标签与 TEV 蛋白酶，其次是应用在尼亲和力树脂:以及额外的净化步骤，如大小排除和离子交换色谱。与其他蛋白质相比，PRMT2的构造显示出显著的低产量，全长PRMT2蛋白伴随着强烈的污染物带。扩大生产和两步净化，如 IMAC 和大小排除，证实了此构造的表达水平较低，同时 FL 蛋白的共净化污染物持续存在。已获得纯蛋白质的PRMT5复合物生产和纯化与它的义务结合伙伴，MEP50。与其他PRMT相比，PRMT9的截断结构具有近两到三倍的低表达水平，接近1.5毫克/升。然而，这种结构的重组病毒种群已用于扩大生产，获得了衍射晶体，并解决了这种蛋白质与PRMT4，6和7（图5）的结构。

在扩大生产中，相应的P2病毒被用来感染Sf9昆虫细胞的悬浮培养。此步骤生成 50/100/200 mL 的巴库洛病毒感染细胞，其中含有受感染的细胞和超自然体中的 P3 病毒。在大规模蛋白质生产中，Sf9细胞的2升在2.8升芬巴赫摇瓶中分别以150转/米、27°C（图6）培养。在生产当天，Sf9细胞的2升（细胞生存能力>97%）在2.5 L Tunair摇瓶或4L在5L试剂瓶被稀释为细胞密度4 x 10^6/mL。这些细胞直接感染了受巴库洛病毒感染的昆虫细胞的10-12毫升/升的悬浮培养，并在25°C的较低温度下，在145转/时孵育。直接感染生产批次的巴库洛病毒感染昆虫细胞的悬浮培养，大大减少了病毒体积放大的费力和耗时步骤，不包括对受感染细胞的额外处理，并避免了滴定和病毒退化的减少。SF9细胞培养维护和规模化生产已在高填充量培养容器中完成，在一批（图6）中采用大规模蛋白质生产。

全长PRMT 4，5（与MEP50复杂），6，7和9蛋白质从巴库洛病毒介导生产平台生产已用于动能特征和抑制剂化合物筛选在SGC^6。水晶结构被解决并存入蛋白质数据库（PDB），用于使用各种化学探针和抑制剂的蛋白质PRMT 4、6、7和9的全长或截断形式。这些PRMT的表达质粒被存放在Addgene质粒储存库（Addgene是SGC的分销伙伴，https://www.addgene.org/），可供研究界使用（图5）。

图1:巴库洛病毒表达过程步骤的原理图概述请单击此处查看此图的较大版本。

图2:巴库洛病毒感染和未受感染的Sf9细胞。 感染的迹象是昆虫细胞的结构变化，如细胞直径增加25-50%，细胞核扩大，形状均匀圆润，增殖损失，粘性培养皿表面，以及细胞生存能力下降。白色比例杆 200 μm。这里显示的感染迹象与使用转染试剂 JetPrime 和 X-tremeGene 9 的转染细胞相同。显示的特定示例用于喷气王子变种试剂。（A） 未受感染的 Sf9 细胞作为控制。（B） 巴库洛病毒感染的Sf9细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:绑定板组装，用于快速纯化测试表达蛋白。 请参阅文本了解详细信息，步骤 3.2.1-2 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:蛋白质表达筛查结果。 在Sf9悬浮培养物的4mL中，巴库洛病毒的蛋白质表达筛查结果中介于不同PRMT和PRMT5-MEP50复合物的相应P1重组病毒的4mL中。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:用于多伦多结构基因组学联合会（SGC）用于晶体结构研究的PRMT4、6、7和9的表达结构摘要。 晶体结构被解决并沉积到蛋白质数据库（PDB）中，用于使用各种化学探针和抑制剂的PRMT 4、6、7和9的蛋白质的全长或截断形式。这些PRMT的表达质粒被存放在Addgene质粒储存库中，可供研究界使用（Addgene是SGC的分销合作伙伴，https://www.addgene.org/）。请单击此处查看此图的较大版本。

图6:Sf9 昆虫细胞维护和蛋白质生产在不同的培养容器: （A） 2.8 L 芬巴赫烧瓶细胞维护和蛋白质生产.使用 72% 的填充量可使一个摇动平台的吞吐量增加 2.5 倍。（B） Tunair 摇动烧瓶（此图片中 10 个烧瓶中只有 9 个）和充满 80% 填充量的试剂瓶大幅提高了摇动平台的生产能力。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

BEVS在昆虫细胞中的优势之一是转化后修饰机械能够进行更复杂的改性，如磷酸化、肌疏松和糖化。结合哺乳动物蛋白的高效折叠，这些修饰促进大量的改性和折叠蛋白，适合生理相关的下游实验^16。

在此，我们描述了 BEVS 的详细协议，强调在巴库洛病毒表达平台中成功筛选多种PRMT蛋白质和大规模PRMT蛋白生产的关键元素:1） 使用常规、可调和可编程多通道移液器在 24-96 之间传输生物材料 - 在巴氏 DNA 和病毒生成阶段的井细胞培养板和方块:重组病毒的集合，重组病毒病毒体积的放大和蛋白质表达筛选块的制备。2） 用于生成重组病毒的高性能和经济高效的转染试剂。3） 用于大规模蛋白质生产的巴库洛病毒感染昆虫细胞 （SCBIIC） 的悬浮培养。4） 利用高填充体积 2.8 L Fernbach 摇瓶来保持 Sf9 悬浮培养物和 2.5 L Tunair 摇动瓶和 5 L 试剂瓶用于大规模蛋白质生产。

转型和转化步骤的特殊考虑和理由。
虽然商业协议建议使用100μL的称职细胞进行一次转化^14，但商用DH10Bac E. 大肠杆菌 能力细胞的转化效率高达1×10⁸ cfu/μg DNA，所以我们只使用4μL。这足以让每个变种人获得孤立的白色重组菌落，用于巴米德DNA分离。24井转染板中的粘附Sf9细胞在无血清昆虫介质0.5 mL的细胞密度为^2×10 5/mL时播种。这个体积足以确保井面的均匀覆盖。同时，它不稀释过多的转染混合物，提高转染效率。转染试剂对Sf9细胞无毒，无需介质交换。与介质变化相反，在传输后 4-5 小时，在传输板中添加包含 10% （v/v） FBS 的额外 1.5 mL 介质，以促进细胞生长。两种转染试剂的转染效率都很高。不过，使用 X-tremeGene 9 时，转染细胞（图 2）中的感染迹象比 JetPrime 试剂早 10-12 小时，因此我们根据协议中下一步的工作时间表在这些试剂之间进行选择，这在整个过程中提供了一定的灵活性。

如果从转染板收集并标记为P1的初始重组病毒量是用于蛋白质表达筛查的一个限制因素，则可以使用P2病毒进行蛋白质测试表达筛查。

从小到大文化卷的考虑。
从历史上看，人们认为，在Sf9细胞维护和扩展生产的悬浮培养中，细胞的最佳生长需要高空域。然而，在2014年，据报道，文化船的高空空间比先前认为的^17。使用适当调整的摇晃速度设置的培养容器到摇晃平台的轨道抛掷，即使高填充体积悬浮培养物中，通过长时间创建和维护小气泡，也能提供足够的氧气传输。通过这种方法，在不牺牲高细胞生存能力的情况下，在细胞的倍增时间的正常范围内，以更高的摇晃速度培养市售昆虫细胞。

因此，6年前，我们开始增加细胞维护过程中摇动烧瓶中的悬浮培养体积，并在调整和监测摇晃条件时引入了不同类型的蛋白质生产培养容器（图6）。为了在这些培养容器中建立最佳条件，我们监测了Sf9细胞培养参数，如细胞倍增时间以及细胞的生存能力、大小和形状、聚合状态和细胞的可感染性。

例如，对于 Sf9 细胞维护，在 2.8 L Fernbach 摇动烧瓶中，我们培养 2 L 而不是 0.8 L 的 Sf9 悬浮细胞在 27 °C 的 150 rpm 下摇晃，大多数时间细胞的生存能力接近 99%，具有均匀形状的健康分裂细胞。为了扩大生产，我们在25°C的较低温度下，以145 rpm的速度在5升试剂瓶中感染4升细胞。 内置摇动平台的最常用的孵化器可容纳 6 x 2.8 L 摇动烧瓶或 6 x 5 L 试剂瓶，或 10 x 2.5 L Tunair 摇动烧瓶。因此，一个摇动平台的容量，如果我们填补Fernbach摇瓶和试剂瓶到1/3与船舶的高填充量是4.8 L对12L使用2.8L芬巴赫摇瓶和10L对24L使用5L试剂瓶（图6）。高填充量养殖船的悬浮细胞培养维护和规模化生产，有助于我们克服产量限制，采用大型平台。因此，这对无法获得生物反应器和/或生产管道中空间有限的实验室非常有用。

该协议可以很容易地适应生产和纯化蛋白质结构与不同的亲和力标签，利用适当的脂质和修改纯化缓冲器，如SGC发表的论文⁶ 描述的PRMT4，7，9，和他的标签PRMT5-MEP50复合物和PRMT6的旗标记全长蛋白质。虽然我们描述了PRMT蛋白质家族的 BEVS 协议，但同样的方法可以应用于任何其他蛋白质家族。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.8L Nalgene Fernbach 培养瓶，聚碳酸酯，	Nalgene	29171-854	用于 Sf9 细胞悬浮培养的大规模维持
24 孔板 RB	Qiagen	19583	用于培养  4ml 悬浮液 Sf9 细胞 用于蛋白质 表达筛选
4-20 Criterion TGX 凝胶 26W 15 ul	Biorad	5671095	用于纯化蛋白质的 SDS-PAGe 分析
50ml 试剂储液器	Celltreat Scientific Products	229290	用于稀释转染试剂的储液槽 和 Sf9 细胞悬液
96 孔盖垫，用于方孔，2 mL	Greiner Bio-One	381080	用于覆盖 96 孔块
96 孔 PCR 板	Eppendorf	30129300
Bacto 琼脂	BD	214010	用于 LB 琼脂选择平台
气孔带片	Qiagen	19571	覆盖 24 个孔块，用于蛋白质表达筛选
Allega X-15R 离心机	Beckman Coulter	392932
抗生素抗真菌剂 （100x）	Gibco	15240112
杆状体 DNA	内部	非目录项目	用于杆状病毒生产的杆粒 DNA
Bluo-Gal，1 g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
细胞培养板，24 孔，带盖子， 平底， 无菌	Eppendorf	30722116	Tissue  培养板
细胞重悬液 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCRS500	用于杆粒 DNA 提取
的细胞 裂解液 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCLS500	用于杆粒 DNA 提取
CELLSTAR 组织培养板，96 孔	Greiner Bio-One	655180	用于转染混合物
ClipTip 1250，过滤器重新加载，无菌	ThermoFisher Scientific	94420818	吸头  可编程和可调节多通道移液器
dNTP 混合物（每个 25 mM）	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip 电子可调吸头间距多通道均衡移液器，15 至 1250 μ;L	ThermoFisher Scientific	4672090BT	可编程和可调多通道移液器
E4 XLS 间距可调 6 通道移液器，20-300 μL	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin 可调多通道移液器
过滤微孔板，96 孔，聚丙烯，带 25 个微量;m 超高分子量聚乙烯膜	Agilent	201005-100	用于表达筛选中的蛋白质纯化
全挡板培养瓶套件 Tunair，2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	用于 SF9 细胞悬浮培养中的大规模蛋白质生产
庆大霉素 10x10ml	BioShop	15750078
热灭活胎牛血清	Wisent Biocenter	080-450
I-Max 昆虫培养基，含 L-谷氨酰胺，1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	无血清昆虫细胞生长培养基
InstantBlue，超快蛋白质染色	Expedeon 蛋白质解决方案	ISB1L-1L	用于蛋白质凝胶 （SDS-PAGE） 染色
Iptg，超纯，不含二恶烷，最低 99.5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIME 转染试剂 随附jetPRIME 缓冲液	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	用于 Sf9 细胞转染生成杆状病毒
卡那霉素单硫酸	BioShop	KAN201.100
磅肉汤 （Lennox），粉末 微生物 Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 深孔 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	用于转化和表达筛选程序
最高效率 DH10Bac 感受态细胞，0.5ml	Thermo Fisher	10361012	用于杆粒 DNA 生成的感受态细胞
mLINE 12 通道移液器，可调 30 - 300 μL	Sartorius	Sartorius 725240	12 通道移液
中和液， 0.5 L	Millipore Sigma	LSKNS0500	用于杆粒 DNA 提取
New Brunswick Innova 44R， 120V， 轨道 2.5 cm （1 in）	Eppendorf	M1282-0004	摇床培养箱，用于 Sf9 细胞悬液的孵育
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30250	用于蛋白质纯化
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Gibco	LS15140122
PYREX Delong 带挡板的 Erlenmeyer 摇瓶，Corning 500ml	Pyrex	4444-500	用于Sf9细胞的悬浮培养
PYREX Delong摇床锥形瓶带挡板，康宁  125ml	Pyrex	4444-125	用于Sf9细胞的悬浮培养
PYREX Delong摇床锥形瓶带挡板，康宁  250ml	Pyrex	4444-250	用于Sf9细胞
的悬浮培养RedSafe 核酸 酸 染色 解决方案	Froggabio	21141
RNase A， 0.9 mL	Millipore Sigma	LSKPMRN30	用于杆粒 DNA 提取的悬浮缓冲液
Roll &生长球形玻璃电镀珠	MP Biomedicals 115000550		用于在琼脂板表面扩散细菌细胞。
RT-LTS-A-300&亩;L-768/8 （吸头）	Ranin	30389253	用于 Ranin 多通道移液器的吸头
S.O.C. 培养基	Thermo Fisher Scientific	15544034
血清、细胞培养、胎牛血清 （Fbs）、Hyclone、表征	加拿大细胞生命科学	SH3039602	转染细胞
Sf9 细胞	Thermo Fisher	12659017	昆虫细胞
Sfx-Insect 细胞培养基	Cytiva（前身为 GE Healthcare Life Sciences）	SH3027802	无血清昆虫细胞生长培养基
Tape Pad	Qiagen	19570	Tape Pad
Taq DNA 聚合酶与 ThermoPol 缓冲液 - 2,000 单位	New England Biolabs	M0267L
盐酸四环素	BioShop	TET701.10
台盼蓝 0.4%解决方案	Gibco	15250061	用于  细胞活力评估
VITLAB 试剂瓶， PP带螺帽， PP， BrandTech， 5L	VITLAB	V100889	用于Sf9细胞悬浮培养中的大规模蛋白质生产
VWR 数字迷你培养箱	VWR	10055-006	适用于粘附Sf9细胞的培养箱
VWR 孵育微孔板摇床	VWR	97043-606	用于在 24 孔块中悬浮培养 Sf9 细胞的培养
VWR		CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA 转染试剂 1.0 M	Roche	6365787001	用于 Sf9 细胞转染以生成重组杆状病毒