本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。
本文内容
摘要
摘要
单个心肌细胞作为心脏生物学和疾病在细胞及亚细胞水平研究的基本收缩和电活动单位，是一种至关重要的工具。因此，从心脏中分离出具有活性且高质量的心肌细胞是实验最初且最关键的步骤。在比较多种成年小鼠心肌细胞分离方案时，文献报道中最为成功且可重复的方法是Langendorff逆行灌流法，尤其适用于心室肌细胞的分离。然而，从灌流心脏中分离高质量的心房肌细胞仍然具有挑战性，目前成功分离的报道较少。解决这一复杂问题极为重要，因为除了心室疾病外，心房疾病也构成了心脏疾病的重要部分。因此，有必要在细胞水平进行进一步研究，以揭示其潜在机制。本文介绍了一种基于Langendorff逆行灌流法的实验方案，并同时对主动脉插管深度以及可能影响消化过程的步骤进行了优化，以实现心房和心室肌细胞的同步分离。此外，所分离的心肌细胞经证实适用于膜片钳技术研究。
引言
心脏疾病是全球主要的死亡原因之一1。为了应对医疗系统面临的这一负担，深入理解心脏的生理学和病理学机制至关重要。除了整体动物和完整心脏制备外，细胞水平的制备也是功能与疾病研究不可或缺的工具2。通过应用膜片钳技术、钙成像、分子生物学及其他先进技术，研究人员可以在单个心肌细胞（CM）中获取更多关于电生理特性、钙稳态、信号通路、代谢状态以及基因转录的信息。这对于揭示心脏疾病过程中的生理与病理机制极为重要3,4,5,6,7。在动物研究中，可选用从小型（如小鼠、大鼠和豚鼠）到大型（如兔和犬）等多种动物。通常更倾向于使用小型动物，尤其是小鼠，因为它们易于进行基因操作和疾病模型构建8,9,10。
急性分离心肌细胞（CMs）的技术经历了长期的发展，目前仍在不断改进中11。其中，Langendorff逆行灌流法是应用于大鼠和小鼠最为成功且可重复性最高的心肌细胞分离方法，尤其适用于分离心室肌细胞（VMs）12,13,14,15。然而，成功分离心房肌细胞（AMs）的报道仍较为少见16,17,18。由于心房颤动（AF）作为最常见的心律失常类型，其全球发病率正持续上升，而目前无论是药物治疗还是心脏消融疗法，对约40%–50%的AF患者仍疗效不佳19，因此有必要在器官/系统整体水平以及细胞/亚细胞水平上进一步研究其机制并探索新的治疗策略。成功分离成年小鼠心肌细胞是开展细胞水平研究的第一步。主要有两种分离方法可供选择：组织块法和Langendorff法。在Langendorff灌流法中，组织消化依赖于通过冠状动脉及其分支输送至毛细血管床的酶溶液。合适的主动脉插管深度是实现该灌流模式的前提，既要避免刺穿主动脉瓣，又要防止堵塞冠状动脉开口，这也是实现高效消化和获得理想VM产量的关键步骤。因此可以合理推测，主动脉插管深度可能同样会影响心房血管的灌流效果，最终影响AM的产量。为验证这一假设，本研究进行了不同插管深度的主动脉插管操作，并比较了相应的AM产量。结果显示，主动脉插管深度与AM产量直接相关。本文介绍了一种同时分离AM和VM的实验方案。
方案
成年雄性C57BL/6小鼠，体重20–30 g，年龄8–10周，购自中国北京首都医科大学实验动物中心。所有实验程序均经首都医科大学动物护理与使用委员会批准，并遵循国家卫生研究院下属动物资源研究所提出的《实验动物护理与使用指南》执行。数据采集与分析采用Excel和Origin 8.5软件。数据以均值±标准差表示；统计学评估采用Student t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
1. 溶液和灌流装置的准备
- 组装一个恒流Langendorff装置（可购买商用产品或自行制作）。图1提供了一个简单的示意图。
- 根据表1和表2中列出的试剂配制溶液。
- 打开循环水浴并调节合适的输入温度（本实验室为42.7 °C），以确保灌流液经插管流出时达到37 °C。
- 用去离子水循环清洗灌流系统。如需无菌条件，先用75%乙醇在灌流系统中运行15分钟，随后用去离子水冲洗（至少10个循环，以避免乙醇对心脏产生毒性作用）。
- 测量灌流液循环系统一个循环所需的时间和体积，以确定下一步灌流时应加入多少毫升的氧合Tyrode溶液。
- 采用适当方法对所有手术器械进行灭菌处理。
- 将灌流液系统的流速设定为4 mL/min。
- 准备两个洁净的35 mm培养皿——一个盛有Tyrode溶液（培养皿1），另一个盛有溶液1（培养皿2）。
- 准备一支装有溶液1的1 mL注射器，以及一根带有切口的20 G钝头不锈钢插管针，切口距针尖1 mm。在插管杆上用3-0缝线打一个松结。调节体视显微镜的观察视野，确保插管针尖位于培养皿2液面以下。
2. 动物准备
- 向小鼠腹腔注射肝素（浓度为 1,000 IU/mL；每只 0.2 mL），以防止血液凝固。10 分钟后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并确认小鼠对尾部或足趾夹捏无反应。在给予肝素 20 分钟后实施颈椎脱位。
- 将小鼠转移至手术平台，仰卧位固定，用 75% 乙醇对胸部进行消毒，并用纱布或纸巾擦干。
3. 心脏切除与主动脉插管
- 用组织镊提起剑突处的皮肤，用组织剪在皮肤上做一个小的侧向切口。在皮肤与筋膜之间进行钝性分离，并将皮肤切口向两侧腋窝方向呈V形延伸。
- 沿同一解剖路径切开肋骨笼，然后用组织镊夹住胸骨并将肋骨笼向上翻折，以充分暴露心脏和肺。
- 用弯头镊子剥离心包膜。如果胸腺覆盖了大血管，用两把弯头镊子将胸腺向两侧撕开。用弯头镊子轻轻牵拉心脏基部朝向尾侧，直至出现 "Y"呈弓形的血管（主动脉及其分支动脉）可见。
- 为保留不同长度的主动脉以备插管和比较，于左侧颈总动脉处横断主动脉（图中绿色线条所示） 图2）并在某些小鼠中同时切断头臂动脉。在其他小鼠中于升主动脉处横断（图中黑色线条所示） 图2).
注意：对于初次进行此操作的人员，也可在体视显微镜下完成此步骤。 - 切除心脏后，立即浸入1号培养皿中，以冲洗并排出残留血液。
- 将心脏转移至2号培养皿中，必要时使用精细虹膜剪修剪多余的组织。对于初次进行该操作的人员，建议在体视显微镜下完成此步骤，以避免误剪主动脉或其他心脏结构。
- 在主动脉插管前推动注射器以排出气泡。在体视显微镜下，借助两把直齿持针钳（光滑钳口）进行逆向主动脉插管。确保整个插管过程均在液面下进行。
- 避免穿刺主动脉瓣，并分别调整深度至升主动脉（主动脉在左颈总动脉处被横断的小鼠）和主动脉根部（主动脉在升主动脉处被横断的小鼠）。
注意：主动脉插管的深度（以下简称 深度此处定义为套管尖端位于主动脉内或主动脉被结扎的位置。 - 用预打结的3-0缝线将主动脉结扎固定至插管切迹处。轻柔推动注射器内容物，以冲洗残留血液。
注意：如果插管深度位置适当，血液将离开冠状动脉并从背侧静脉渗出。心脏及心耳将扩张并变得苍白。 - 移除并连接套管至兰格多夫装置。再次注意避免气泡进入心脏。
注意：从开胸到初始灌注的时间不应超过5分钟。
4. 心脏灌注
- 首先，如果心房内有残留血液，先灌注含氧的台氏液约 10 秒（本方案所用系统中 10 秒内流过的液体体积约为 0.7 mL），然后切换至溶液 1；若心房内无残留血液，则直接使用溶液 1 进行灌注。心脏灌注时间约为 2 分钟。
- 切换至溶液 3。用一次性无菌聚乙烯移液管吸取约 2.5 mL 溶液 3，放入水浴中预热以备后续使用，其余溶液用于灌注约 11–12 分钟。将最初灌注 2 分钟内的溶液 3 弃去，之后的灌流液通过蠕动泵回收至灌流液储液瓶中重复使用，直至消化完成。
- 当心脏肿胀、颜色变浅、质地松软（呈海绵状），或用有齿镊子轻捏心肌时留下压痕，即终止消化。
5. 细胞分离与钙重添加
- 用镊子去除心室和心房，并将其分别放入不同的培养皿中。向培养皿中加入预热的溶液3。
- 用钝头镊子将组织 triturate 至浑浊状态，并轻轻吹打组织以实现均匀消化。避免引入气泡。
- 用移液器将浑浊的消化组织转移至溶液4中，以终止残留的酶活性，然后在192×g 条件下离心20秒。弃去上清液，向细胞沉淀中加入溶液5，并用移液器轻轻吹打使细胞均匀分散。
- 逐步重新引入钙离子，以避免钙反常和钙超载。向细胞悬液中逐步加入总共50 µL的100 mM/L CaCl2（每5分钟依次加入5 µL、10 µL、15 µL和20 µL），实现钙离子的梯度添加。
6. 细胞储存
- 进行膜片钳研究时，将细胞保存在台氏液中。进行其他细胞研究时，将细胞保存在溶液6中。
- 为确保急性功能研究（如Ca2+火花、Ca2+波、Ca2+释放、Ca2+泄漏及膜片钳记录）结果的准确性，应在接下来的6小时内完成此类功能实验。
结果
本文中，导管尖端位于主动脉内，该位置定义为主动脉插管深度（简称为深度），同时也是主动脉结扎的位置。从在升主动脉处进行插管和结扎的心脏中分离得到的心房肌（AM）和心室肌（VM）分别表示为AMAA和VMAA。此外，从在主动脉根部进行插管和结扎的心脏中分离得到的AM和VM分别表示为AMAR和VMAR。图2展示了主动脉的整体结构及横切位置。图3展示了与主动脉横切位置相对应的插管深度和结扎部位。插管深度与心房及心耳的灌注情况相关。当导管尖端位于升主动脉时，双侧心耳均膨胀，表明心房灌注充分；而当导管位于主动脉根部时，心房灌注不足，双侧心耳萎缩（图4）。在不同插管深度下，经钙离子再灌注后所分离的心肌细胞（CM）的形态学特征和存活率如图5所示。AMAA、AMAR、VMAA和VMAR在钙离子再灌注前后于共聚焦显微镜下的细胞形态可见：AM呈纺锤形，VM呈杆状且末端呈矩形。此外，AM和VM均具有完整的细胞膜、清晰的轮廓、明显的横纹化肌节以及光滑的表面（图6）。细胞活力通过台盼蓝染色法评估。细胞膜完整的正常细胞可排除台盼蓝而不被染色，而失去活性的细胞则会迅速在胞内积聚台盼蓝（图7）。将AM和VM分别置于不同的载玻片上进行细胞计数。通过将10 µL细胞悬液转移至载玻片，并在倒置相差显微镜下以4 × 10倍视野进行观察，确定AM的总产量以及存活的纺锤形心肌细胞百分比（存活率）。采用相同方法测定VM（杆状）的总产量及存活VM的百分比。该方法优于使用血细胞计数板，因为心肌细胞由于其大小和形状难以均匀分布于血细胞计数板的计数区域。柱状图（Figure 8）显示了AMAA、AMAR、VMAA和VMAR在钙离子再灌注前后的存活率。每个数值代表来自10只小鼠的平均值±标准差。在钙离子再灌注前，AMAA的存活率显著高于AMAR（分别为70.9% ± 2.8% 和 41.0% ± 5.2%；p < 0.01）。在钙离子再灌注后，AMAA的存活率仍显著高于AMAR（分别为69.4% ± 3.0% 和 37.7% ± 4.9%；p < 0.01）。
在钙离子重新引入前，VMAA的存活率与VMAR相比无显著差异（分别为89.5% ± 2.7% vs 88.1% ± 2.6%；p > 0.05）。同样，在钙离子重新引入后，VMAA的存活率与VMAR相比亦无显著差异（分别为82.2% ± 1.9% vs 82.9% ± 1.6%；p > 0.05）。
按照本方案推荐的深度（在升主动脉处）进行心脏插管后，重新引入钙离子后可分别获得约410万个有活力的心室肌细胞（VMs）和约18万个有活力的心房肌细胞（AMs）。分离得到的AM和VM细胞的全细胞膜片钳记录显示钠电流（图9A、B）及电流密度（图9C），证实细胞质量已满足电生理实验的要求。表3 显示了在升主动脉和主动脉根部插管并结扎的心脏中，导管尖端至冠状动脉（CA）开口的距离。主动脉的解剖结构（图10）表明，心房血管的开口位于主动脉根部附近，并与冠状动脉（CA）开口相邻。
图1．组装好的改良型朗根多夫系统的示意图。 该系统对用户而言经济且便携。系统包含两段塑料管路——一段用于水浴（内径8 mm），另一段用于灌流液（内径1.5 mm）——其远端连接至带有鲁尔锁的PE医用三通旋塞。一个装有水并配有橡胶塞的玻璃瓶作为热交换器。灌流液由蠕动泵泵入热交换器中的塑料管路，然后从连接套管的三通旋塞流出。请点击此处查看此图的放大版本。
图2．主动脉及其周围组织。 呈“Y”形的血管结构为主动脉及其分支：头臂干动脉（箭头1）和左颈总动脉（箭头2）。在部分小鼠中，于左颈总动脉处横断主动脉（绿线），同时切断头臂干动脉；在其他小鼠中，则于升主动脉处横断（黑线）（体视显微镜10 × 2倍放大）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。带插管心脏的正面观。 黑色弧线表示在左颈总动脉之间被横断的主动脉切缘。红色弧线表示在升主动脉处被横断的主动脉切缘。直线表示主动脉结扎位置：黑色位于升主动脉，红色位于主动脉根部（体视显微镜 10 × 2 放大倍数）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．插管心脏的灌注状态。 在升主动脉处插管并结扎的心脏（A）中，心房灌注充分，两个心耳均膨胀；而在主动脉根部插管并结扎的心脏（B）中，两个心耳均萎缩，表明心房灌注不良。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5．钙离子重新引入后细胞形态及活力评估。从升主动脉插管并结扎的心脏中分离得到的AM（A）和VM（B）分别表示为AMAAs和VMAAs。从主动脉根部插管并结扎的心脏中分离得到的AM（C）和VM（D）分别表示为AMARs和VMARs。高质量的心肌细胞处于静息状态，细胞膜完整，轮廓清晰，横纹状肌节明显，细胞表面光滑。心房肌细胞呈纺锤形，而心室肌细胞呈杆状或砖形，末端呈矩形。自发性收缩或细胞膜上出现泡状突起的细胞质量较差，收缩成球形的细胞为死亡细胞。随机视野（荧光显微镜，10 × 10 放大倍数；比例尺，100 µm）。AM = 心房肌细胞，VM = 心室肌细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6．钙离子重新引入前后共聚焦显微镜下的细胞形态学。 在钙离子重新引入之前，AMAA（A）和 AMAR（C）呈纺锤形，轮廓清晰，具有横纹肌节和平滑的膜表面。钙离子重新引入后，AMAA（B）和 AMAR（D）仍呈纺锤形，轮廓清晰，具有横纹肌节和平滑的膜表面。在钙离子重新引入之前，VMAA（E）和 VMAR（G）呈杆状或砖状，轮廓清晰，具有横纹肌节，膜表面平滑且末端呈矩形。钙离子重新引入后，VMAA（F）和 VMAR（H）也呈杆状或砖状，轮廓清晰，具有横纹肌节，膜表面平滑且末端呈矩形（共聚焦显微镜油镜，63 × 10 放大倍数；比例尺，50 µm）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7．细胞活力评估。 失去活性的受损细胞会被台盼蓝染色，而有活力的活细胞则不能被台盼蓝染色（荧光显微镜，4 × 10 倍放大；比例尺，100 µm）。请点击此处查看此图的放大版本。
图8. 柱状图显示AMAA、AMAR、VMAA和VMAR在钙再引入前后的存活率。CR = 钙再引入。每个数值代表10只小鼠的平均值±标准差。***p < 0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 溶液 | 成分（终浓度，单位为 mmol/L，除非另有说明） | 已记录 |
| 灌注液（溶液1） | 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4，0.6 Na2HPO4，1.2 MgSO₄4，12 NaHCO₃3，10 KHCO₃3，10 HEPES，15 牛磺酸，5 葡萄糖，10 2,3-丁二酮单肟（BDM） | 可于3天内储存于 4 °C葡萄糖、牛磺酸和BDM在实验当天加入。每颗心脏准备200 mL灌流液。 |
| Tyrode 溶液（溶液 2） | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2，10 HEPES，1 CaCl2，5 葡萄糖 | 可于3天内储存于 4 °C. CaCl2 和葡萄糖在实验当天加入，用饱和 NaOH 在室温（28-30°C) 使用 pH 计测量。 |
表1. 成年小鼠心肌细胞分离用溶液。
| 溶液 | 成分 | 备注 |
| 消化液（溶液3） | 25 mL 溶液1，6μL 100 mM/L CaCl2，25mg 胶原酶II，50μL (2.5 % 10×) 胰蛋白酶 | 每颗心脏使用 |
| 终止液1（溶液4） | 9 mL 溶液1，1 mL FBS (胎牛血清)，4μL 100 mM/L CaCl2 | 每颗心脏使用 |
| 终止液2（溶液5） | 9.5 mL 溶液1，0.5 mL FBS (胎牛血清)，4μL 100 mM/L CaCl2 | 每颗心脏使用 |
| 细胞重悬液（溶液6） | 13 mL 溶液1，7μL 1M/L CaCl2，BSA (牛血清白蛋白)，用量以能形成覆盖液面的薄层为宜 | 每颗心脏使用 |
表2. 成年小鼠心肌细胞分离与保存用溶液。
图9．钠通道的电流-电压曲线。 采用全细胞膜片钳技术，在电压钳模式下记录分离的心肌细胞中的钠电流。插图中显示了电压钳协议。记录自心房肌（AM）（A）和心室肌（VM）（B）的钠电流如图所示。在−45 mV、−40 mV和−35 mV电位下的电流密度在AM中显著高于VM（AM分别为−32.71 ± 1.597 pA/pF、−31.49 ± 1.820 pA/pF和−29.34 ± 1.939 pA/pF，n = 10；VM分别为−17.66 ± 1.976 pA/pF、−21.09 ± 1.560 pA/pF和−21.86 ± 1.381 pA/pF，n = 8；P < 0.05）。（C）I-V曲线显示了归一化至细胞电容的钠电流密度。请点击此处查看该图的放大版本。
图10．心房血管的起始与分布。 图A显示心房血管（箭头1）和冠状动脉（CA，箭头2）。图B为心房血管的放大图（箭头3）。(C) 存在两个不同大小的开口；其中一个（箭头4）对应供应心耳的心房血管，另一个（箭头5）对应冠状动脉（体视显微镜10 × 5倍放大）。CA = coronary artery。 请点击此处查看该图的高清版本。
| 小鼠编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| 主动脉插管深度位于升主动脉 | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| 主动脉插管深度位于主动脉根部 | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
表3. 导管尖端至冠状动脉开口的距离。 采用C57BL/6小鼠心脏（n = 20）进行主动脉插管和结扎，插管深度分别位于升主动脉和主动脉根部。解剖主动脉后，测量导管尖端至冠状动脉（CA）开口的距离。距离以毫米为单位，正值和负值分别表示导管尖端位于冠状动脉开口上方和下方。
讨论
单个心肌细胞（CM）是研究心脏功能和疾病细胞水平的宝贵且不可或缺的工具20。因此，从心脏中分离出有活力的心肌细胞是初始且最关键的步骤。细胞质量是决定实验能否成功的重要因素之一，尤其是在光学和电生理实验中。与其他动物的心肌细胞相比，啮齿类动物的心肌细胞由于细胞内钠离子浓度较高，更易受到缺血和缺氧的损伤，这有利于通过Na+/Ca2+交换体介导钙离子内流21。此外，心房肌细胞（AM）的数量远少于心室肌细胞（VM）；因此，成功分离极为困难。Langendorff法适用于分离小鼠心室肌细胞22，但分离心房肌细胞的成功率较低，相关报道也较少。除缓冲液配制所用的温度、酶活性、pH值和水质外，主动脉插管的适当深度也是获得理想心室肌细胞的重要因素。Langendorff法的原理依赖于心脏的逆行灌流。灌流时，主动脉瓣关闭，灌流液被迫进入冠状动脉，通过血管分支输送酶溶液，使心肌组织得到均匀消化。为了实现这种循环模式，主动脉必须保留足够的长度以进行插管和结扎，同时插管尖端不得穿透主动脉瓣或堵塞冠状动脉开口。因此，可以合理推测主动脉插管的深度也与心房的灌流有关，类似地影响心房的消化效率和心房肌细胞的得率。本文所介绍的方案验证了这一假设，并在下文列出了优化细胞得率的关键步骤及相关建议。
在步骤1.9中，为了更好地固定主动脉，建议使用带有切口（或环形凹槽）的钝头20 G导管，该切口距离导管尖端1 mm。根据我们的经验，选择直径略大于主动脉直径的导管可防止插管过程中导管尖端刺破主动脉瓣，因为主动脉依靠其固有的弹性可紧密贴合导管并产生摩擦力，这种摩擦力在前后调整插管深度时起到保护作用。关于切口位置，若切口过于靠近导管尖端，由于重力作用，心脏在插管过程中容易滑脱；反之，若切口位置过远，则可用于调整插管深度和结扎位置的空间将非常有限。鉴于上述情况，在步骤3.3中，建议在左侧颈总动脉之间横断主动脉（如图2中的绿线所示），以确保主动脉长度足够，并可在升主动脉部位进行插管和结扎。而在升主动脉处横断时，预留的插管长度至少可保证导管尖端靠近主动脉根部，并在结扎后不会穿透主动脉瓣。主动脉的解剖结构以及从导管尖端到冠状动脉开口距离的测量结果表明，在左侧颈总动脉之间横断主动脉是实现合适主动脉插管深度的理想位置。
发现灌注深度与心房的灌注情况相关，后者反过来可作为深度的指示指标。图4显示，当插管深度位于升主动脉时，心房灌注良好，双侧心耳均膨胀；而当插管深度位于（或接近）主动脉根部时，心房灌注不足，双侧心耳萎缩。从膨胀的心耳中获得的AM总细胞数和活细胞数更高（图8）。这些结果表明，主动脉插管深度可在一定程度上影响心房及心耳的灌注与消化过程，最终影响AM的产量和质量。推测AM的产量和质量与供应心房的血管分布有关。Fernández等人的研究23已证明小鼠冠状动脉（CA）起源和走行存在多种变异。他们发现CA开口位置高度可变，并非全部位于主动脉窦内。部分CA可异常起源于主动脉窦上方，称为高位开口；部分CA可起源于同一主动脉窦，且心房供血血管的开口紧邻CA开口。本研究中主动脉的解剖结构（图10）也与Fernández的研究结果一致。这可能是导致采用Langendorff法分离AM时，若插管深度不当则大多难以成功的原因。因此，若导管尖端与CA开口之间空间不足，则导管尖端更有可能阻塞紧邻CA开口的心房供血血管开口。相比之下，只要导管尖端未穿透主动脉瓣，心室的灌注和细胞得率几乎不受影响。这可能是因为供应心室的冠状动脉具有更大的开口和更多的起源。即使一个开口被导管阻塞，心室灌注仍可通过其他冠状动脉或侧支循环得到代偿；而供应心房的血管较细小，且无替代通路。因此，主动脉插管深度的影响至关重要。
在消化和细胞保存过程中其他值得注意的因素和故障排除事项如下。首先，如果在结扎主动脉后心房中的血液尚未完全排出，可考虑在步骤4.1中灌注含氧台氏液，以促使心肌收缩并泵出残留血液。这有助于避免血液残留所带来的不利影响。2+ 以及红细胞受损后释放的其他物质。其次，灌注 ca2+提前使用无钙溶液处理以解离细胞间的连接并扩大细胞间隙，可提高酶消化的效率，因为心肌细胞间的闰盘是依赖钙离子的细胞间连接结构。然而，处理时间应限制在3-5分钟内，以避免细胞损伤。 钙反常 现象24建议使用混合酶溶液。II型胶原酶可破坏细胞外基质网络，而胰蛋白酶有助于清除胶原酶II消化不完全时残留在细胞表面的颗粒物质，从而确保细胞表面光滑，这对于膜片钳记录中形成吉欧姆（GΩ）封接至关重要。然而，胰蛋白酶浓度应控制在适当范围内，以避免过度消化和细胞损伤，因其可能降解膜蛋白。单独使用II型胶原酶虽可提高细胞得率，但常导致组织过度消化，且分离的心肌细胞在长时间暴露于胶原酶后将出现钙不耐受现象。25使用2,3-丁二酮单肟（BDM）——一种通过抑制肌球蛋白ATP酶活性并阻止横桥形成来防止自发性收缩的物质——目前仍存在争议。26,27,28,29根据以往经验，本方案中必须添加BDM。酶溶液使用溶液1配制，尽管溶液1不含钙，但需额外添加钙以激活酶。在灌流液中添加BDM的优点包括：（1）抑制心肌细胞收缩，降低酶解灌流过程中的耗氧量；（2）防止心肌细胞缺氧，提高分离心肌细胞的质量。一些研究报道BDM可能对细胞电生理特性产生潜在不利影响，但全细胞膜片钳记录钠电流的结果并未显示不良效应。在细胞保存步骤（步骤6）中，许多研究选择使用KB缓冲液——一种无钙但高钾浓度的溶液，细胞在此溶液中因处于极化状态且代谢水平较低，可维持较佳状态。然而，若长时间缺乏外源性钙，细胞膜糖萼会从脂质双分子层分离，导致膜通透性增加，从而影响后续功能分析。30,31,32.
目前，所有心肌细胞分离技术基本上可分为两种：一种是将组织小块（chunk）在酶溶液中进行消化，另一种是通过酶溶液进行冠状动脉（CA）逆行灌注（即Langendorff灌注）22。与Langendorff法相比，chunk消化法操作更为简便，目前在许多实验室中被常规用于分离心肌细胞（CMs）。然而，该方法通常从成年组织中获得的心肌细胞产量较低且质量较差22。此外，通过该方法分离的细胞可能不适合用于开展比较性实验。例如，在检测心房心肌细胞（AM）与心室心肌细胞（VM）之间药物作用的细胞类型特异性时，不同分离条件所带来的影响不可忽视或排除。这是因为心室心肌组织的厚度和密度远高于心房，导致两者在消化时间和酶浓度需求上存在差异。此外，在消化过程中对组织进行过度震荡和移液操作会损伤细胞，显著影响后续功能研究。同时，许多先前的研究表明，AM对钙离子更为敏感。然而，采用本方案所分离的AM可能能够耐受梯度钙的重新引入，这可能是因为在消化过程末期组织较易破裂，从而减少了机械损伤；而chunk法需要反复进行组织破裂和离心操作，细胞所遭受的机械损伤更大。最近，Ackers等人33报道了一种无需Langendorff装置的简化方法，可用于分离存活的心肌细胞和非心肌细胞。该方法可有效分离VM和成纤维细胞，但未提及AM的分离数量。然而，该方案仍存在若干局限性。首先，由于个体差异及小鼠品系不同，心脏血管分布可能存在变异，推荐的插管深度无法保证每次均能成功分离AM。其次，对于初次操作者而言，主动脉横断和逆行主动脉插管需要一定时间的学习和练习。最后，该方法仅在健康和老年小鼠中进行过测试，尚未在其他心脏疾病模型中验证。因此，在存在心肌纤维化程度不同的情况下，可能需要调整酶浓度和消化时间。相比之下，在Langendorff法中，酶溶液可通过血管床均匀分布至心肌组织，从而避免了chunk法中因消化条件不一致所带来的问题。
综上所述，本文所述的同时分离单个心房肌细胞（AM）和心室肌细胞（VM）的方案表明，适当的主动脉插管深度可有效改善心房灌注并提高AM的得率。采用该方法分离得到的心肌细胞（CMs）质量高，具有良好的钙耐受性，并已成功应用于膜片钳记录以及钙处理研究（通过IonOptix系统进行Ca2+释放和Ca2+波形测量）34。预计该细胞分离方案可用于一系列细胞及亚细胞水平的研究中的细胞制备，有助于深入理解心脏生理学与病理学机制。尤为重要的是，该方法将有助于发现更多具有临床相关性的心脏疾病机制及干预手段。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（编号 81770322、81870244、81500254、81870243、81470465）和北京市自然科学基金（编号 7192051）资助。作者贡献：Bai 和 Liu 设计并提出了本研究项目。Wen 和 Ruan 为实验提供了宝贵的建议。Wu 和 Linling Li 完成了实验工作，并在数据获取、分析与解释中发挥了关键作用。Li 参与了兰格多夫装置的组装。Peng、Zhang、Wang 和 Yang 参与了实验前试剂与溶液的配制。Wu 撰写了文章。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3-丁二酮单肟（BDM） | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| II型胶原酶 | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | 数据采集与分析 | ||
| 胎牛血清（FBS） | 浙江天航生物科技 | 150207 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA, US | 数据采集与分析 | |
| 蠕动泵 | Longerpump | BT100-2J | |
| 戊巴比妥钠 | 上海试剂厂 | 810923 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| 台盼蓝 | Solarbio | C0040 | |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen | 15090046 | |
| 水浴锅 | JULABO | ED (v.2) |
参考文献
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