本文描述了利用双光子显微镜对活体小鼠颅骨骨髓中的巨核细胞及其血小板前体（proplatelets）进行成像的方法。
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摘要
摘要
血小板由位于骨髓中的特殊细胞——巨核细胞产生。十多年前，已有研究描述了在实时和天然环境中对巨核细胞进行成像的可能性，这为血小板形成过程提供了新的见解。巨核细胞会通过窦状血管的内皮层延伸出细长的突起，称为前血小板。本文介绍了一种同时实时成像颅骨骨髓中荧光标记的巨核细胞和窦状血管的实验方案。该技术依赖于一种保留颅骨完整性的微创手术，以限制炎症反应。通过将一个环形装置粘附在颅骨上，固定小鼠头部，从而防止呼吸引起的移动。
利用双光子显微镜，可对巨核细胞进行长达数小时的可视化观察，从而能够监测其在窦状血管内形成细胞突起和前血小板的延伸过程。该技术可量化与突起形态相关的多个参数（如宽度、长度、是否存在缩窄区域）及其延伸行为（如速度、规律性，或是否存在暂停或回缩阶段）。此外，该方法还可同步记录窦状血管中循环血小板的运动，以测定血小板移动速度和血流方向。该技术特别适用于利用基因修饰小鼠研究特定基因在血小板生成中的作用，同时也可用于药理学检测（研究相关机制，评估治疗血小板生成障碍的药物）。该方法已成为不可或缺的研究工具，尤其可用于补充 体外 研究已证实 体内 和 体外 血小板形成依赖于不同的机制。例如，已有研究表明 体外 微管本身对于血小板前体的延伸是必需的。然而， 体内它们主要作为支架，其伸长主要由血流力量促进。
引言
血小板由骨髓中的一类特化细胞——巨核细胞产生。由于技术上的挑战，长期以来人们难以通过骨组织实时观察巨核细胞释放血小板的具体过程。双光子显微镜技术的出现克服了这一难题，极大地推动了人们对血小板形成过程的理解。2007年，von Andrian 及其同事首次实现了在活体（in vivo）条件下对巨核细胞的观察，他们通过小鼠颅骨实现了对荧光标记巨核细胞的可视化1。这一方法之所以可行，是因为年轻成年小鼠额顶颅骨的骨层厚度仅有几十微米，具有足够的通透性，足以使下方骨髓中的荧光细胞得以被观察到2。
后续研究应用该方法在不同条件下评估血小板前体的形成，并解析其潜在机制3,4,5,6这些研究提供了确凿证据，表明巨核细胞会动态地伸出突起，称为前血小板，穿过窦状血管内皮屏障图1）。这些前血小板随后以长片段形式释放，其体积相当于数百个血小板。前血小板在下游器官（尤其是肺部）的微循环中经过重塑后，最终形成血小板。7然而，迄今为止，该过程的精确机制及其分子机制仍存在争议。例如，关于细胞骨架蛋白在血小板前体延伸过程中的作用，不同研究提出的观点存在差异 体外 和 体内 条件3，并且在炎症条件下已观察到血小板前体形成存在差异6此外，最近一项研究对血小板生成假说提出了质疑，并提出 体内血小板主要通过巨核细胞水平的膜出芽机制形成8.
本文介绍了一种通过微创方法在活体小鼠颅骨骨髓中观察巨核细胞和前血小板结构的实验方案。此前已有类似方法用于可视化其他骨髓细胞，特别是造血干细胞和祖细胞9。本研究的重点是观察巨核细胞和血小板，详细描述可测量的若干参数，特别是前血小板的形态特征和血小板运动速度。该方案展示了如何将导管插入颈静脉以注射荧光示踪剂和药物，并通过颅骨进行观察。通过微小手术暴露颅骨，将一个环形装置粘附于骨面。该环用于固定头部，防止呼吸运动带来的干扰，并形成一个可盛放生理盐水的腔体，作为物镜浸润介质。该技术特别适用于：i）实时观察窦状血管的几何结构以及巨核细胞与血管壁的相互作用；ii）追踪巨核细胞形成、延伸及释放前血小板的全过程；iii）测量血小板运动，以监测复杂的窦状血管血流动力学。采用本方案获得的数据已近期发表3。
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方案
所有动物实验均按照欧洲标准 2010/63/EU 以及斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，动物设施许可编号 N°：G67-482-10，项目协议 N°: 2018061211274514).
1. 小鼠准备及颈静脉插管
注意：此处使用雄性或雌性、5至7周龄的mTmG报告基因小鼠（B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10），与Pf4-cre小鼠杂交，可在巨核细胞和血小板中实现强烈的绿色荧光标记1112。实验开始前，需提前数小时预热显微镜的加热腔室。
- 将小鼠转运至成像室并进行麻醉。
- 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮溶液（氯胺酮（100 µ克/克）和赛拉嗪（10 µ克/克）（5 µL/g)
注意：此处使用并重复注射氯胺酮/赛拉嗪，效果良好，但需要在定期追加注射时中断成像记录。或者，若有麻醉机可用，可先使用氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉诱导，随后通过吸入气体（异氟烷、空气和氧气的混合物）维持麻醉。 - 将动物放回笼中直至达到深度麻醉。将小鼠置于预热至37℃的加热板上 °C，用于后续所有操作。
注意：在动物达到深度麻醉的同时，开启显微镜及所有设备（参见第4.1节），并设置实验所需的各项参数（参见第4.2节），以便手术完成后立即开始实验。 此处，该操作流程 仅持续 3 h 且为终末性操作。实验结束后，小鼠在未苏醒的情况下被实施安乐死。因此，对皮肤和器械使用乙醇消毒已足够。然而，根据各机构的规定，或若手术操作时间较长，则应采用更彻底的消毒方法，例如使用聚维酮碘/碘伏和乙醇交替擦拭三次。
- 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮溶液（氯胺酮（100 µ克/克）和赛拉嗪（10 µ克/克）（5 µL/g)
- 在颈静脉中插入导管。
注意：手术过程中应尽可能避免微生物污染。手术前需使用70%乙醇（EtOH）仔细消毒皮肤。始终使用灭菌的剪刀和镊子，并定期用70%乙醇冲洗。在洁净环境中操作，并佩戴口罩。22 G "套管针式" 导管由塑料管内的针头组成，用于静脉注射（参见 材料表).- 将小鼠仰卧放置，并用手术胶带固定其前肢以拉伸喉部图 2A用70%乙醇对喉部进行消毒。
注意： 为方便起见，可在手术前剃除咽喉部位的毛发。若手术持续时间较长，须仔细剃除毛发，以确保无菌操作的规范性。 - 使用无菌剪刀在右侧或左侧颈外静脉上方做一道0.7–1 cm的切口。牵拉邻近的结缔组织以暴露颈外静脉及胸肌上部。图 2A).
- 用温热的无菌生理盐水填充导管。在穿透胸肌后，将导管插入静脉中图2B).
注意：务必避免导管内产生气泡。将导管穿过肌肉插入至关重要，因为肌肉可形成压迫点，从而防止出血。即使是具有止血功能缺陷的小鼠，例如 Itgb3-/- 采用此方法插入导管时，小鼠不会出血。 - 轻轻取出针头，如有需要，小心地将导管进一步插入静脉。连接注射器，并通过添加一滴外科胶水来固定导管材料表).
注意：虽然可以在尾静脉内插入导管，但该操作需要一定经验，因为该静脉管径较细。使用毛色较深的小鼠时尤其困难，因其尾静脉几乎不可见。 由于其管径较大，将导管置入颈静脉可能更可靠地实现较大体积或重复给药。 请注意，注射器首次需用温热的生理盐水填充，并在注射药物溶液前切勿忘记先注入死体积。 - 小心地将小鼠恢复至俯卧位 (图2C）。涂抹凝胶（材料清单) 以防止眼睛干涩。
- 将小鼠仰卧放置，并用手术胶带固定其前肢以拉伸喉部图 2A用70%乙醇对喉部进行消毒。
2. 手术与颅骨环的安装
注意：小鼠固定装置的完整组件包括4个部分，即一个底座和一块平板、一个用于固定小鼠头部的环形件，以及一个用于将环形件固定到底座上的螺钉（图3A）。该装置的所有部件均通过 i.materialise.com 进行3D打印获得。平板由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）聚合物制成，底座和螺钉由不锈钢制成，环形件由高等级不锈钢（高精度不锈钢）制成（尺寸详见补充图S1，3D打印文件见补充材料）。底座永久固定在支撑结构上，可通过螺钉或胶水固定。一旦将环形件固定在小鼠颅骨上后，应将其用螺钉旋紧至底座固定器上（图3A）。
- 用浸有70%乙醇的纸巾擦拭头皮毛发进行消毒。用湿润的纸巾清除所有松散的毛发。
注意：为方便起见，可在手术前剃除头皮毛发。 - 使用无菌精细剪刀和镊子，在颅顶中线处做T形切口，切口向上延伸约1 cm，并延伸至双耳之间，以暴露颅骨。
注意：将固定环放置在额骨与顶骨交界区域（图3B）。 - 使用无菌镊子暴露颅骨。用剪刀和镊子小心去除骨膜。使用浸有生理盐水的无菌棉签彻底清除所有骨膜残留物以及碎屑或毛发，以免影响成像效果。
注意：为减少炎症反应，操作时应特别注意避免损伤骨骼。 - 用生理盐水冲洗以去除任何血迹，并用干燥棉签迅速擦干骨骼表面。将胶水凝胶涂抹于固定环上，将其置于暴露的颅骨区域，并保持数秒，使固定环牢固粘附于颅骨。
注意：切勿使胶水进入观察区域，以免引起不必要的自发荧光。 - 用浸有生理盐水的棉签轻轻润湿颅骨表面。
- 仔细按1:1比例混合蓝色和黄色组分，制备硅胶牙科材料。将牙科材料均匀涂抹于固定环周围，以密封防止成像过程中液体泄漏。仔细清除可能进入环内的牙科材料或胶水。
- 用生理盐水填充固定环，并检查是否存在泄漏。
注意：生理盐水作为显微镜物镜的浸没介质。在使用具有止血相关缺陷的小鼠时，出血问题可能更为严重。必须防止血液进入固定环，以免影响后续成像质量。 - 将小鼠置于支撑装置上，并将固定环旋紧在支架固定块上（图3C）。在动物头部下方垫入折叠的纱布，以抬高头部，防止固定环从颅骨脱落。
注意：头部被直接固定，可有效避免因呼吸运动导致的图像位移。 - 将支撑装置与小鼠整体置于加热的显微镜腔室中（图3D）。
注意：操作过程中务必小心，切勿移动已插入的导管。
3. 实验结束前对麻醉小鼠的随访观察
注意：每35分钟交替皮下注射一次氯胺酮（25 µg/g，给药体积为5 µL/g体重）和氯胺酮（50 µg/g）与赛拉嗪（5 µg/g）的混合液（1.2 µL/g），以重新诱导麻醉。 由于在采集过程中无法打开加热的显微镜腔室，因此通过脚趾夹捏法在每次追加麻醉给药前后以及每次开始新的视频记录前进行麻醉深度监测。
- 如有需要，停止采集，并通过皮下注射重新诱导麻醉。
- 操作时注意不要移动小鼠头部，用左手拇指和食指捏住背部皮肤形成皮褶，右手持注射器在皮褶处进行皮下注射麻醉剂（或 反之亦然 适用于左撇子。
- 检查环内是否存在生理盐水，如有必要，补充新鲜生理盐水。继续记录接下来的35分钟，并在记录持续时间内以相同方式操作。
- 实验结束时，在小鼠苏醒前通过颈椎脱位法处死。
注意：小鼠的麻醉时间最长为3小时，符合当地伦理与动物福利委员会的规定。
4. 双光子成像
注意：有关显微镜及相关设备的详细信息，请参见材料表。图像使用共振扫描器（12 或 8 kHz）进行采集。设置双向扫描模式以提高采集速度，因为像素在两个方向上均被记录；因此，必须通过控制面板中的“相位校正”功能校正任何相位不匹配。最后，根据采集速度与信噪比之间的权衡，设置了适当的平均扫描次数。
- 打开双光子显微镜，包括激光器和共振扫描仪（激光输出功率通常约为1.8–2.5 W，具体取决于所用激光器）。
- 为所选荧光染料设置适当的激光波长。设置适当的发射光收集波长。
注意：此处采用913 nm的波长，并使用混合探测器（500–550 nm和575–625 nm）分别同时激发并检测AlexaFluor-488和Qtracker-655。 - 通过颈静脉导管注射荧光示踪剂以标记血管系统（Qtracker-655； 材料表）。注射50 µ0.2 L/只小鼠的溶液 µM，每小时更换一次，最多更换150次 µL/实验
注：可使用其他示踪剂，如高分子量葡聚糖1在此情况下，需考虑右旋糖酐可能改变血液黏度，从而影响某些血液流变学参数。 - 将显微镜载物台连同支撑装置和小鼠置于物镜下方。检查环内是否始终充满生理盐水，并将物镜浸入其中。使用落射荧光定位骨髓血管（红色）以及沿窦状血管排列的巨核细胞（绿色）。
注意：颅骨的厚度低于 100 µm2骨髓位于骨组织下方，可通过荧光绿色的巨核细胞以及被Qtracker-655标记的密集红色吻合窦状血管清晰识别。 - 长时间采集（巨核细胞、前血小板）
- 寻找目标区域。按照上述要求设置图像采集参数。
- 对于长时间采集（例如，观察前血小板形成或延伸过程），以优化的时间间隔（通常为 0.85 至 1.34）采集 z 层扫描图像 µm）使用8 kHz共振扫描器。
注：12 kHz 共振扫描器可提高采集速度。 - 获取 384 × 384 像素的图像以观察完整的巨核细胞和血管。根据需要使用线平均，以实现快速采集并保持良好分辨率。确定图像堆栈采集的时间间隔，通常 10 秒或 30 秒 用于前血小板的可视化。
注意：此处采用8次行平均以获得更高的信噪比，从而可使用8 kHz共振扫描器以每10秒1帧的速度进行图像采集。 确保在实时采集过程中允许进行线平均。
- 快速短时采集（血小板）
注意：对于血小板流速等快速事件的较短时间采集，必须最大限度提高图像帧的采集速率。 选择合适的采集类型可优化帧采集速率（例如，采用空间-时间采集类型“xyt”）。- 必要时，通过旋转成像视野将图像大小调整至血管，并将其最小化（例如，256 × 90 像素）。
- 使用可达到的最高速度进行扫描。
- 使用双向扫描。
注意：进行双向扫描时，需确保相位调节得当。 - 尽量减少线平均，以在图像清晰度和采集速度之间找到最佳平衡。
注意：对于血小板速度测量，若有助于提高采集速度，像素化的图像可能已足够。 - 缩小 z 轴扫描范围以提高采集速度。采集 仅需 1 个 z-stack 即可 量化血小板速度。采集10-20秒以测量血小板速度。
注意：使用12 kHz共振扫描器在这些条件下最高可获得每秒133帧的成像速度。参数需根据实际条件进行调整。在某些血管中，血小板流速过快，仍难以利用这些设置可靠地量化血小板速度。
- 血小板前体宽度和长度的测量
注意：要使用 ImageJ 加载在 Leica 软件上获得的 LIF 文件，需先在 ImageJ 上下载并安装 LOCI 插件以使用 Bio-Formats 导入器。- 血小板前体宽度
- 使用 ImageJ 打开视频。进行宽度测量时，仅使用不含血管的前血小板视频。为分离不同通道，请点击 图像|颜色 并选择 拆分通道.
- 对于 z 轴堆栈视频，通过点击对每个时间点进行平均 z 轴投影 图像|序列 并选择 Z 投影。对于 投影类型，进入 平均强度.
- 对图像进行去噪处理。通过点击来减去背景 过程|减去背景 并应用 滚动球半径：50.0 像素。 通过点击来平滑图像 处理与平滑.
- 在血小板前体的基部附近（靠近巨核细胞，避开其他任何物体）描 trace 一条线。
注意：别忘了通过单击设置图像的比例尺，以获得所需单位的数值 分析并设置比例尺默认情况下，图像的单位为像素。 - 绘制强度分布曲线，拟合高斯曲线，并计算半高全宽（FWHM）。为此，通过点击以下宏中的脚本实现： 插件｜新建 并选择 大体 并单击运行 宏|运行宏: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("高斯"x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; print(FWHM)
注意：确保线扫描中仅有一个对应于前血小板强度的单一峰。 - 执行步骤4.7.5中描述的操作，对1个切片或随时间重复操作，以获得前血小板的平均宽度
- 血小板前体长度
- 沿前血小板从靠近巨核细胞基部至顶端的路径描线。使用分段线追踪前血小板的形态。对每个时间点重复此操作。
- 记得使用 ROI Manager 保存每一行：点击 分析 | 工具 并选择 ROI 管理器 点击 在 添加 在 ROI 管理器 窗口中逐条添加至管理器。要将所有行保存到文件夹中，请点击 ROI 管理器 在 取消选择 | 更多 并单击 保存. 从 ROI 管理器中提取每条线的长度值测量）从结果表中。
注意：请勿忘记通过点击设置图像比例尺，以获得所需单位的数值 分析并设置比例尺默认情况下，图像的单位为像素。
- 血小板前体宽度
- 血小板速度测量
注意：血小板速度通过记录血管内荧光标记血小板流动10-20秒的视频进行计算。首先对图像进行处理，获得周期性重复的线扫描数据。运动产生的条纹其倾斜角度与速度相关，从而可据此计算速度。此处采用基于Radon变换的方法计算速度，该方法比经典的奇异值分解（SVD）方法更具鲁棒性。15.- 使用 ImageJ 进行图像处理
- 使用 ImageJ 打开视频。通过点击应用高斯模糊滤波器 过程 | 滤光片选择 高斯模糊，并应用 Sigma（半径）：2.00选择一个较小的区域来测量血流，并沿血流方向绘制3条相邻的直线。
注意：每次使用 ROI 管理器时，务必通过点击保存每一行 分析 | 工具 | ROI 管理器 单击 添加 在 ROI 管理器 窗口以逐行添加并保存；首先点击 取消选择 | 更多 然后点击 保存. - 使用 ImageJ 线扫描软件，通过点击每条线来构建相应的 kymograph 图像 | 图像序列；选择 重新切片 并应用以下参数： 输出间距（微米）：1.000 / 切片数量：1 / 避免插值保存所得的时空图像。
注意：最终图像显示了血流中血小板随时间呈线性运动所对应的条纹。条纹的角度与血小板运动速度相关。
- 使用 ImageJ 打开视频。通过点击应用高斯模糊滤波器 过程 | 滤光片选择 高斯模糊，并应用 Sigma（半径）：2.00选择一个较小的区域来测量血流，并沿血流方向绘制3条相邻的直线。
- 使用 Matlab 或 GNU Octave 软件进行速度测量
注意：血流中血小板速度的估算基于Drew及其合作者所描述的Radon变换计算分析方法，通过时空图像实现15该数学方法的描述超出本综述的范围，读者可参考 Drew 等人的出版物以获取有关计算的详细信息15Matlab 代码及相关信息可在其网站 https://www.drew-lab.org/code 获取。- 使用 Matlab 或 GNU Octave 软件打开代码。
注意：代码可能需要根据预期的研究目的进行调整。 - 从3幅时空图像中提取对应于同一血管段绘制的相邻线条的数值，计算该血管段的平均血小板流动速度。
注意：切记将结果转换为正确的计量单位（例如， µ米/秒（m/s）。
- 使用 Matlab 或 GNU Octave 软件打开代码。
- 使用 ImageJ 进行图像处理
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结果
通过本方案，将荧光示踪剂Qtracker-655经静脉注射，用于成像颅骨骨髓中吻合的窦状血管，并显示由箭头所示的血流方向（图4A，左图）。利用mTmG小鼠，在每条血管分支中记录eGFP荧光标记的血小板20秒，并使用ImageJ和GNU Octave软件测量其流速（图4A，右图）。请注意血流速度和方向的异质性。由于血管存在吻合结构，窦状血管呈现出复杂的血流模式，包括正向流动、反向回流甚至停滞现象，如视频1中记录的分叉处所示。同一分叉结构在图4B（左图）中展示，其中红色和蓝色箭头分别标示相反方向的血流。该分叉处血小板流速的测量结果已呈现在右侧图表中（图4B，右图），红色曲线代表左侧血管分支的流速，蓝色曲线代表右侧血管分支的流速。结果显示每条血管分支中的流速随时间呈现不规则变化，包括加速、停滞和减速等阶段。需要注意的是，在某些血管中，血流速度过快，导致在当前采集条件下难以进...
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讨论
血小板形成的机制高度依赖于骨髓微环境。因此，活体显微成像已成为该领域内用于实时观察该过程的重要工具。通过将表达Cre重组酶的巨核细胞特异性小鼠与携带条件性荧光基因表达盒的任意flox小鼠杂交，可获得巨核细胞具有荧光标记的小鼠。本研究中采用了mTmG报告小鼠（B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10）与Pf4-cre小鼠杂交11，从而在巨核细胞和血小板中实现强烈的绿色荧光标记12。需要注意的是，已有文献报道Pf4-cre小鼠在白细胞（包括单核细胞/巨噬细胞和成纤维细胞）中存在一定的表达渗漏现象12,13。
然而，巨核细胞因其体积较大且具有细胞核而易于识别。刚进入该领域的实验人员可将[mTmG; Pf4-cre]小鼠中的观察结果与巨核细胞特异性标记后的结果进行比较。这可通...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Florian Gaertner（奥地利科学技术研究所，克洛斯特诺伊堡，奥地利）在我们实验室建立双光子显微镜技术时提供的双光子显微成像实验方面的专业指导，以及Yves Lutz（法国伊尔基什IGBMC/CBI影像中心）在双光子显微镜使用方面的专业知识和帮助。我们还感谢Jean-Yves Rinkel提供的技术支持，以及Ines Guinard为图1示意图所作的绘图。感谢ARMESA（医学与公共卫生研究与发展协会）在双光子显微镜购置过程中提供的支持。AB获得了法国血液机构（APR2016）和法国国家科研署（ANR-18-CE14-0037-01）博士后奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GNU Octave 软件 | GNU 项目 | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | 外科胶水注射液 |
| Leica Microsystems 4tunes HyD 混合探测器 | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU 项目 | 最低所需版本 | |
| Imalgene/氯胺酮 1000 瓶/10 mL | Boehring | 03661103003199 | 眼部防护 |
| 配备 25 倍水镜（数值孔径 0.95）的 Leica SP8 MP DIVE 显微镜 | Leica Microsystems | AlexaFluor-488 与 Qtracker-655 的同步激发 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | 蓝色和黄色硅胶牙科糊剂 |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 血管标记物 | Invitrogen | Q21021MP | 注射溶液 |
| 共振扫描仪，8 或 12 kHz | |||
| Rompun 赛拉嗪 2% 瓶/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| 速干胶凝胶 | 用于将环固定于骨上 | ||
| Surflo 静脉导管 - 蓝色 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| 钛宝石脉冲激光器（Coherent）（飞秒） | Coherent |
参考文献
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