本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。
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摘要
摘要
三维（3D）生物打印技术利用基于水凝胶的复合材料（或称生物材料墨水），按特定图案沉积，形成可接种细胞的基质。由于许多生物材料墨水可能对原代细胞具有潜在的细胞毒性，因此在将其用于成本较高的3D组织工程过程之前，有必要确定这些水凝胶复合材料的生物相容性。一些3D培养方法（包括生物打印）要求将细胞包埋于3D基质中，这使得在不造成机械损伤的情况下难以提取和分析细胞的存活率及生物标志物表达变化。本方案以概念验证为目的，描述了一种方法，用于评估嵌入结晶纳米纤维素（CNC）的琼脂糖复合材料的生物相容性；该复合材料被制备成24孔培养系统，并利用流式细胞术检测小鼠骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的细胞活力和生物标志物表达水平。
暴露于CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质18小时后，通过碘化丙啶（PI）通透性测定，BMMC的活力未发生改变。然而，培养在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基底上的BMMC似乎略微上调了高亲和力IgE受体（FcεRI）和干细胞因子受体（Kit；CD117）的表达，尽管这种变化似乎不依赖于生物墨水复合物中CNC的含量。BMMC的活力还通过时间过程实验进行了评估，即将其暴露于由纤维状纳米纤维素（FNC）和海藻酸钠组成的商用生物材料墨水经3D挤出式生物打印机制造的水凝胶支架中。在6至48小时的时间范围内，通过流式细胞术以及微量滴定法（XTT和乳酸脱氢酶检测）测定，FNC/海藻酸钠基底未对BMMC的活力产生不利影响。本方案描述了一种高效的方法，可用于快速筛选候选生物材料墨水在作为肥大细胞接种用3D支架时的生化相容性。
引言
近年来，人们对三维培养系统和三维生物打印的兴趣日益增长，这使得水凝胶及水凝胶复合材料受到广泛关注。这些复合材料具有黏性且多孔的仿生特性，按重量计可含有高达99%的水分，与生物组织的含水量相当。1,2,3这些水凝胶复合材料的特性因而能够在不影响细胞活力和功能的前提下促进细胞生长。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），已被用作水凝胶复合材料中的增强材料、生物材料植入物开发中的细胞支架，以及二维（2D）和三维（3D）结构中的组分 体外 细胞培养4,5由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞大多不表现出明显的细胞毒性6肠上皮细胞7人骨髓来源的间充质干细胞8或类神经元细胞9然而，人类骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖能力随着木质纳米纤维素复合材料黏度的增加而降低，表明必须仔细测试基质成分对细胞功能的不利影响。8.
类似地，CNC 在被巨噬细胞内化后可诱导炎症反应，这在三维免疫细胞培养系统中可能产生严重后果10,11事实上，目前关于CNC如何影响其他免疫细胞反应的数据非常有限，尤其是由肥大细胞启动的过敏性炎症反应。肥大细胞是一类表达高亲和力IgE受体FceRI的颗粒性白细胞，该受体负责介导针对过敏原的炎症反应激活。肥大细胞的增殖与分化依赖于干细胞因子（SCF），后者可结合酪氨酸激酶受体Kit。肥大细胞起源于骨髓中的前体细胞，这些前体细胞进入血液循环后，进一步向外周迁移，广泛分布于人体所有组织中12由于肥大细胞在三维组织环境中发挥作用，因此它们是研究免疫学过程的理想免疫细胞候选者 体外 三维组织模型。然而，迄今为止，尚无可行的 体外 含有肥大细胞的三维组织模型
由于肥大细胞具有高度敏感性，并且容易对外部刺激产生促炎反应，因此在将肥大细胞引入三维支架时，必须仔细考虑三维基质的组成成分以及生物打印方法，下文将进一步讨论。组织构建物可由两大类生物材料制备而成，即生物墨水和生物材料墨水。两者的区别在于：根据 Groll 等人13,14的定义，生物墨水是含有细胞的水凝胶复合物，而生物材料墨水则是不含细胞的水凝胶复合物。因此，使用生物墨水打印的三维构建物包含预先包埋于水凝胶基质中的细胞，而使用生物材料墨水打印的三维构建物则需在打印后接种细胞。基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水进行培养支架的生物制造，最常采用挤出式三维生物打印机实现，该设备通过气动或机械驱动的活塞施加压力，将生物墨水/生物材料墨水经微尺度喷嘴挤出14。挤出式生物打印机采用“自下而上”的方式，通过逐层堆叠二维截面图案来沉积生物墨水，从而构建三维支架。
为了适用于挤出式生物打印，基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水必须具备触变性（剪切稀化）特性，即当生物墨水/生物材料墨水中的水凝胶聚合物在受到剪切应力作用时，能够像流体一样通过微通道喷嘴流动，而在剪切应力移除后迅速恢复为黏稠的凝胶状状态15。由于水凝胶基生物墨水/生物材料墨水含水量高，其聚合物必须通过物理或共价交联方式形成网络结构，以维持三维生物打印结构的形态和结构完整性。对于含细胞的生物墨水，细胞在交联过程中会直接暴露于化学应力之下。此外，在将细胞包埋于生物墨水水凝胶基质中进行挤出打印的过程中，细胞还会受到剪切应力的影响，可能导致细胞活力下降甚至死亡。一旦完成三维组织模型的生物打印，便难以区分细胞毒性究竟来源于水凝胶基质本身，还是源于挤出过程或交联过程。这一问题在三维支架体系中尤为突出，因为细胞在打印前已预先嵌入水凝胶基质中，难以将其完整分离用于后续分析，而此类操作可能严重损害肥大细胞的存活能力。
一种更温和的生成含肥大细胞三维组织构建物的方法，是将细胞从细胞培养悬浮液中接种至预先打印的多孔生物材料墨水三维支架中，该方法利用了肥大细胞从循环系统迁移至外周组织的天然能力。这种细胞接种方法具有双重优势：（i）肥大细胞不会受到挤出和交联过程分别带来的剪切力和化学应力；（ii）在暴露处理后，可通过轻柔冲洗将细胞从三维支架中轻松回收用于分析，且不会对细胞活力产生不利影响。相较于二维水凝胶圆片，在三维生物打印的多孔水凝胶支架上接种肥大细胞并分析其细胞活力的额外优势在于，此类三维生物打印水凝胶支架能够模拟天然组织的微尺度拓扑结构特征 体内 组织，而这些结构在传统的二维平面水凝胶圆片中并不存在。该方法是一种合适、快速且经济有效的手段，可在投入昂贵的三维组织工程实验之前，评估候选生物墨水水凝胶基质对肥大细胞及其他免疫细胞可能产生的灾难性细胞毒性效应。
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方案
注意：本实验方案包含五个部分：（1）小鼠骨髓的分离及小鼠骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的分化；（2）在24孔体系中制备CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基底，并在该基底上培养BMMCs；（3）从CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基底上回收BMMCs，并通过流式细胞术分析细胞活力及生物标志物表达；（4）利用市售的纤维状纳米纤维素（FNC）/海藻酸钠复合生物墨水进行水凝胶支架的3D生物打印；（5）在FNC/海藻酸钠水凝胶支架上培养BMMCs，并通过流式细胞术、XTT法和乳酸脱氢酶（LDH）微量滴定法分析细胞活力。
1. BMMC 培养物的制备
注意：小鼠通过 CO2 异氟烷麻醉后窒息处死。分离胫骨和股骨，收集全部骨髓。所有动物实验均依照加拿大动物护理委员会指南和政策进行，并获得阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会的批准。
- 通过将 表1 中列出的补充剂加入 RPMI-1640 培养基中，配制完全 RPMI-1640 培养基，使其达到指定的终浓度。使用 NaOH 将培养基 pH 值调节至 7.4–7.6，用一次性瓶顶滤器（孔径 0.2 µm）过滤除菌，并在避光条件下于 4 °C 保存，最长可保存 2 个月。
- 根据当地大学动物护理委员会的方案和程序，获取小鼠股骨。
注意：本研究中使用的股骨来自 C57BL/6 小鼠，但若其他品系与研究相关，也可使用。 - 使用剪刀去除髋关节处的皮肤和肌肉，然后轻轻扭转并从髋臼中拉出股骨（图1）。注意不要折断股骨头。在胫骨中腓骨处用剪刀将胫骨与股骨分离。在跟骨上方稍作切割，移除足部并弃去。
- 使用手术刀去除股骨和胫骨碎片上的皮肤和软骨。用剪刀在股骨和胫骨的两端各作一个干净的切口，暴露出内部的红色骨髓。如有需要，此时可去除腓骨，但需注意腓骨可能有助于在冲洗骨髓过程中操作胫骨。
- 准备一支带有 26 G 针头的 5 mL 鲁尔锁注射器，并吸入约 5 mL 上述制备的完全培养基。
注意：此时也可使用不含添加剂的不完全 RPMI 培养基，以节省试剂。 - 用镊子夹住股骨或胫骨，将针头插入骨的一端，轻轻推动注射器。将骨置于一个 50 mL 无菌锥形离心管上方，缓慢向骨内注入约 5 mL 培养基，施加一定压力。观察骨髓以细长的红色条带状从骨的另一端流出并落入锥形管中。
- 将抽吸物离心沉淀后重悬于完全培养基中，或直接转移至含有 50 mL 完全 RPMI-1640 培养基的 175 cm2 无菌组织培养瓶中。在含 30 ng/mL 小鼠重组白细胞介素（IL）-3 的完全 RPMI-1640 培养基中维持培养。
- 培养 1 天后，在光学显微镜下观察细胞。此时培养物包含形态和大小各异的异质性细胞群体，以及较大的骨髓组织碎片。每 3–5 天使用上述完全 RPMI-1640 培养基添加 15 mL 新鲜培养基进行换液，确保细胞密度始终不超过 1 × 106 个细胞/mL。每周一次，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，收集细胞后重悬于新鲜完全 RPMI-1640 培养基中，并按 1:4 比例传代至新的 T175 培养瓶中，每瓶加入 50 mL 培养基。
- 培养 4 周后，通过流式细胞术检测 CD117（Kit）和 FceRI 受体的表面表达水平，以确定细胞纯度（如下文第 3.2 节所述）。
注意：培养 4 周后，99% 的细胞应同时表达 CD117（Kit）和 FcεRI。 - 自第 4 周起，使用含 20 ng/mL IL-3 的完全 RPMI-1640 培养基维持骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的培养。约 6 周时，细胞将停止增殖，不再需要传代。每 3–5 天更换培养基，每周通过离心收集细胞，重悬于新鲜完全 RPMI-1640 培养基中继续培养。
2. CNC/琼脂糖/D-甘露醇 水凝胶基底的制备及BMMC培养
- 在玻璃瓶中，加入 0.2 g 琼脂糖粉末至磷酸盐缓冲液（PBS）中（终浓度为 2% w/v），总体积为 10 mL，于 100 °C 加热沸腾 1 分钟以溶解。
- 将 2.5 g CNC 粉末溶于 PBS 中，定容至 10 mL，配制 25% w/v 的混合液。
- 将 2 g CNC 粉末溶于 PBS 中，定容至 10 mL，配制 20% w/v 的混合液，并对该 20% w/v 混合液进行系列稀释，制备 10%、5% 和 2% w/v 的 CNC 混合液。
- 将 25%、20%、10%、5% 和 2% w/v 的 CNC 混合液加热至 37 °C，持续 10 分钟（图 2A）。
- 向热的琼脂糖溶液中加入 0.46 g D-甘露醇（终浓度为 4.6% w/v），并溶解。
- 在不同的锥形管中，将预热的 25%、20%、10%、5% 和 2% w/v CNC-PBS 混合液与热的琼脂糖/D-甘露醇溶液按 1:1 体积比混合，得到水凝胶混合物中最终的 CNC 浓度分别为 12.5%、10%、5%、2.5% 和 1% w/v。
- 迅速操作，将步骤 2.6 中制备的上述溶液各 500 µL 加入 24 孔细胞培养板中，每种条件设四个复孔，室温静置 30 分钟以促进聚合（图 2B）。
- 使用微量移液器，小心地将 1000 µL 密度为 1.1 × 106 个细胞/mL 的 BMMC 悬液铺加在水凝胶基质表面，避免枪头接触凝胶，以免损伤凝胶表面并产生颗粒。
- 将 BMMC 在水凝胶基质上置于无菌培养箱中（5% CO2，湿化环境），37 °C 培养 18 小时。
3. 流式细胞术分析
- 通过PI排斥法进行骨髓来源肥大细胞活力的流式细胞术分析
- 小心地从CNC/琼脂糖/D-甘露醇凝胶上层移除含有BMMC的培养基，避免触及凝胶，将细胞转移至1.5 mL微量离心管中。
- 用含0.5% w/v 牛血清白蛋白的PBS（pH 7.4）洗涤BMMCs两次，300 × g 在室温下孵育5分钟，然后重悬于180 µL PBS-0.5% w/v BSA中，调整终浓度至1.5 × 106 细胞/mL。将细胞转移至96孔圆底培养板中。
注意：使用 0.2 µm 孔径的注射器滤器将所有 PBS-0.5% w/v BSA 溶液重复过滤除菌两次，并于 4 °C 保存。 - 向细胞中加入20 µL PBS-0.5% w/v BSA，或加入用PBS-0.5% w/v BSA配制的10x PI（100 µg/mL），使终浓度为10 µg/mL，于4 °C避光孵育1小时，或于室温避光孵育15分钟。使用配备氩离子激光器（488-514 nm）和带通滤光片的流式细胞仪检测578 nm荧光发射信号。每样本在室温下以30 µL/min流速采集20,000个事件。按以下方法进行数据分析（见3.2.7–3.2.10节）。
- 基于Kit（CD117）的BMMC流式细胞术分析 FcεRI 表面受体表达
- 小心地从CNC/琼脂糖/D-甘露醇凝胶上层移除含有BMMC的培养基，避免触碰凝胶，将细胞转移至1.5 mL微量离心管中。
- 用含0.5% BSA的过滤PBS洗涤BMMCs两次，300 × g离心 g 在室温下孵育5分钟，然后重悬于180 µL含0.5% w/v BSA的PBS中（1.5 × 106 细胞/mL）。将重悬的细胞转移至96孔圆底培养板中。
- 加入20 µL 10倍稀释的抗体工作液至细胞中，使CD117（c-Kit）-藻红蛋白（PE）和FcεRIα-别藻蓝蛋白（APC）的终浓度分别为0.06 µg/mL和0.06 µg/mL。
注意：10倍抗体工作液必须用经滤膜除菌的PBS-0.5% w/v BSA配制。 - 向未在3.2.3步骤中用任一抗体-荧光染料偶联物染色的细胞分装孔中，分别加入20 µL含大鼠IgG2b κ同型对照-PE或 Armenian hamster IgG同型对照-APC的10倍浓度同型对照工作液。
注意：同型对照抗体，即大鼠 IgG2b κ 同型对照-PE 和 Armenian hamster IgG 同型对照-APC，用于控制抗体在 BMMC 上的非特异性结合。由于 BMMC 不表达高水平的 FcR，使用同型对照抗体时通常不会检测到较高的背景荧光。用滤膜除菌的 PBS-0.5% w/v BSA 配制 10 倍浓度的同型对照工作液。 - 将96孔圆底板在4 °C避光孵育1小时。
- 向每孔加入 200 µL 新鲜的 PBS-0.5% w/v BSA 缓冲液洗涤细胞，并在 300 × g 条件下离心 g 室温下孵育5分钟。再重复洗涤步骤一次。小心移除上清液，避免接触细胞沉淀；保留少量上清液以确保细胞沉淀不受扰动。
- 洗涤后，将细胞重悬于100 µL经0.2 µm孔径注射器滤器无菌过滤两次的PBS（pH 7.4）中，其中含0.5% w/v BSA和0.05% w/v叠氮化钠。使用流式细胞仪，按照上述步骤3.1.3所述，采集PE和APC检测通道的荧光数据。
- 使用能够查看和分析扩展名为的流式细胞术数据文件的软件进行数据分析 ".fcs".
- 开始分析，沿前向散射（FSC）作图 x-轴和侧向散射（SSC）沿 y-轴，并根据前向散射光（FSC）在log范围内的保守细胞群进行设门10 1.5-5.0 和对数范围的 SSC10 未处理且未染色细胞中的数值为0.75-3.25，如图所示 图3A(i),(ii).
注意：此步骤旨在确保在分析中排除低FSC和SSC值的细胞碎片。与其他免疫细胞类型（如单核细胞和淋巴细胞）相比，肥大细胞通常具有较强的颗粒性（高SSC）且体积较大（高FSC）。 - 接下来，生成经染料、抗体或同型对照染色的未处理样本的FSC vs. SSC散点图及直方图谱，并根据所用特异性抗体-荧光素偶联物或染料的发射光谱，获取PE或APC通道的平均荧光强度（MFI）。将相同的门控策略和参数应用于所有与不同CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质共孵育并经相应同型对照、抗体或染料染色的BMMC样本，获取MFI值。
注意：未处理的染色样本的FSC与SSC散点图应与步骤3.2.9中获得的未处理/未染色样本的散点图无法区分，以确保染色过程不会改变细胞大小（由FSC测定）或细胞颗粒度（由SSC测定）。图3A（i），（ii）). - 根据4次独立实验的结果，计算各样本的平均MFI及其标准误（SEM），随后使用统计分析软件包生成图表。
- 在流式细胞术数据分析软件中制备直方图叠加图图3B，4A(ii)，B(ii)).
4. FNC/海藻酸钠水凝胶基质的3D生物打印
注意：本研究中使用的3D生物打印机是一种气动挤出系统，配备两个独立的、可温控的打印头。用于3D生物打印水凝胶支架的生物材料墨水由以下成分组成：(a) 高度水合的纤维状纳米纤维素（FNC），其形态与胶原蛋白相似；(b) 海藻酸钠；以及 (c) D-甘露醇。该墨水以无菌水凝胶悬浮液的形式提供，封装于3 mL卡式筒中，可连接无菌鲁尔锁式锥形生物打印喷嘴（22、25 或 27 G）。
- 在室温（20–25 °C）下使用本方案，此时打印头和打印平台均处于室温。
- 将生物材料墨盒在 4 °C 下储存，以维持水凝胶复合物的稳定性。在开始 3D 生物打印前，从冰箱中取出一个墨盒（3 mL），并使其平衡至室温。
- 将生物墨盒安装到 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机上
- 取下 3 mL 生物材料墨盒两端的蓝色端盖（图 5B(i)），并在墨盒的鲁尔锁接头端安装一个无菌的 22 G（蓝色）锥形生物打印喷嘴。
注意：在安装墨盒并执行后续校准步骤之前，必须先将所需的锥形生物打印喷嘴安装到生物墨盒上，否则将导致 3D 生物打印机的 z 轴校准不准确。 - 将打印头 1（PH1，左侧）的气压供气管连接到墨盒的另一端，并将带有锥形生物打印喷嘴的墨盒插入 PH1 的垂直插槽中（图 5A(ii)）。
- 将墨盒牢固地插入 PH1 中，使锥形生物打印喷嘴延伸至打印头下方。顺时针拧紧 PH1 上的螺丝直至手指拧紧，以固定生物墨盒。请注意，3D 生物打印可在 PH2 空置的情况下进行。
- 取下 3 mL 生物材料墨盒两端的蓝色端盖（图 5B(i)），并在墨盒的鲁尔锁接头端安装一个无菌的 22 G（蓝色）锥形生物打印喷嘴。
- 校准 3D 生物打印机的 x-y-z 轴
- 开启 3D 生物打印机电源，并在通过 USB 2.0 电缆连接的 PC 上启动生物打印机软件。
- 在软件中点击 连接 按钮，以将软件与 3D 生物打印机同步。
注意：当打印头的紫外发光二极管灯循环亮灭，且 HEPA 过滤器风扇循环关闭再开启时，表示同步成功。在执行后续步骤中的归位操作和起始点校准前，必须先完成软件与 3D 生物打印机的同步。 - 观察 3D 生物打印机主控制菜单中的四个选项：(i) 准备打印、(ii) 生物打印、(iii) 工具菜单 和 (iv) 状态界面。选择 准备打印 选项，然后向下滚动并选择 归位轴 选项。
注意：3D 生物打印机将首先将打印头组件向后和向左移动，分别校准 y 轴和 x 轴。随后，在打印头暂停于最左侧位置时，生物打印机会抬升打印平台，直到位于打印平台上的 z 轴校准开关与安装在打印头 1 上的锥形生物打印喷嘴接触。 - 在成功完成 x-y-z 轴校准后，观察到打印平台轻微下降，打印头移动至打印平台中心点上方（图 5A(i)）。
- 为在 24 孔板中进行生物打印而进行的起始点校准
- 从密封的塑料包装中取出一个无菌 24 孔培养板，在板底面 D1 孔的中心位置用永久性记号笔标记一个点。取下板盖，将 24 孔培养板放置于打印平台上，使 D1 孔位于打印平台的左前角。
- 在主控制菜单中选择 工具菜单，然后选择 移动轴。沿 x 轴和 y 轴以 1 mm 为步长移动打印头，直到 PH1 的锥形生物打印喷嘴正对 D1 孔下方标记的点。如有必要，可通过以 0.1 mm 为步长移动打印头，进一步微调锥形生物打印喷嘴的位置。
- 记录当锥形生物打印喷嘴正对 D1 孔中心时，3D 生物打印机控制面板屏幕上显示的 x 和 y 坐标。
注意：以本实验所用的 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机为例，其 x 和 y 坐标如下：x : -46.5 和 y : -27.5。这些坐标将作为在 24 孔板中进行生物打印时 D1 孔中心的起始点。 - 接下来，以 1 mm 为步长抬升打印平台，直到 D1 孔底部几乎接触安装在打印头 1 上的锥形生物打印喷嘴。如有必要，可进一步以 0.1 mm 为步长微调打印平台的移动（图 5A(ii)）。然后，从 工具菜单 中选择 Z 轴校准 选项，并进一步选择并确认 存储 Z 校准 选项。
- 返回主菜单，选择 准备打印 选项。向下滚动并选择 校准 Z 选项。
注意：3D 生物打印机将在成功执行 z 轴校准后降低打印平台（图 5A(iii)）。
- 使用正确的起始点坐标更新 24 孔板 G 代码文件
- 在生物打印机软件中打开提供的 24 孔板几何代码（G 代码）文件（补充文件 1）。
注意：该 24 孔板 G 代码文件编码了在每个孔中打印两层 5 × 5 × 1 mm 的矩形结构（图 5C(i),(iii)）。所提供的 G 代码文件可用于任何 3D 生物打印软件。 - 注意 G 代码文件第 1 行内容为 G0 X-50.0 Y-33.5 ;D1 孔中心位置。将第 1 行中的 x 和 y 坐标更新为步骤 4.5.3 中获得的数值，即第 1 行应更新为 G0 X-46.5 Y-27.5 ;D1 孔中心位置。将文件另存为新名称。
注意：此操作用于校准 G 代码文件，以确保打印基于所用特定 3D 生物打印机的 x,y 坐标从 D1 孔中心开始。该方法可用于校准任何挤出式 3D 生物打印机的 24 孔板 G 代码文件。本研究中仅打印了 24 孔板的左半部分，即 A1–3、B1–3、C1–3 和 D1–3 孔。另提供一个编码在 3 × 4 网格中打印两层 5 × 5 × 1 mm 矩形结构的独立 G 代码文件（补充文件 2，图 5C(ii)）。
- 在生物打印机软件中打开提供的 24 孔板几何代码（G 代码）文件（补充文件 1）。
- 调整打印头 1（PH1）的挤出压力
- 确保气动泵已牢固连接至 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机后部的气源接口，并开启气动泵。
- 拉出 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机右侧的前部控制旋钮。
注意：前部控制旋钮调节 PH1 的压力，后部控制旋钮调节 PH2 的压力。 - 观察位于生物打印机正面的 PH1 和 PH2 数字压力表，其读数应均接近 0 kPa。缓慢顺时针旋转前部控制旋钮，直至 PH1 左侧压力表显示的压力达到 12 kPa（图 5A(iii)）。
- 在已安装墨盒的打印喷嘴下方放置一张折叠的纸巾或一段防水密封膜，注意不要触碰打印喷嘴。
- 在 3D 生物打印机的主控制菜单中选择 准备打印。
- 导航至并选择 开启 PH1。注意生物材料墨水开始从打印喷嘴挤出。如有必要，顺时针旋转控制旋钮以增加挤出压力，直至生物材料 墨水以连续丝状形式挤出，并记录新的压力设定值。操作应迅速，以避免浪费生物材料墨水。
- 选择 关闭 PH1 以停止生物材料 墨水的挤出，从打印平台上取下含有挤出生物材料 墨水的纸巾或薄膜，并关闭生物打印机门。
注意：3D 生物打印机将根据 G 代码文件的指令在打印过程中自动开启 PH1 的气压供应。
- 在 24 孔板格式中 3D 打印矩形水凝胶基质
- 在 3D 生物打印机的主控制菜单中选择 工具菜单。导航至并选择 禁用 SD 打印，以允许生物打印机软件将 G 代码文件传输至 3D 生物打印机进行打印。
- 点击生物打印机软件中的 加载 按钮，并选择在步骤 4.6.2 中保存的已更新 24 孔板 G 代码文件。
- 在软件右侧控制面板中选择 打印预览 选项卡，然后点击 打印 按钮，开始在 D1 孔中进行生物打印。
注意：若使用 3 × 4 网格孔板 G 代码文件，生物打印将在 24 孔板的 A3 孔结束（图 5C(ii),D），而非常规全板打印时的 A6 孔。 - 在完成矩形结构的生物打印后，盖上 24 孔板盖，将其转移至 II 级生物安全柜中。
- 将每个矩形结构浸入两滴无菌的 50 mM CaCl2 溶液中（图 5B(ii)），并在室温下孵育 5 分钟。
注意：此步骤通过 Ca2+ 离子与海藻酸钠聚合物链发生离子交联，使矩形结构保持其结构完整性。 - 小心吸除每个结构中的 CaCl2 溶液，并用 1 mL 的 1× PBS（pH 7.4）冲洗一次，以去除多余的 CaCl2（图 5D）。
- 为防止生物打印的水凝胶结构脱水，在骨髓单个核细胞（BMMCs）准备接种前，应将 3D 打印的矩形结构保存在新鲜的 1× PBS 中（图 5D）。
5. 三维生物打印直角支架上BMMCs的孵育及活力检测
- 在三维生物打印直角水凝胶支架上孵育BMMCs
- 将BMMCs细胞分装接种至3D打印的直角网格支架上，每种处理时间设置三个重复，处理时间分别为6、18、24和48小时，确保所有处理组同时结束实验。同时，将BMMCs细胞接种于空孔中作为未处理对照组，每种时间点同样设置三个重复，处理时间与实验组一致。
- 无菌操作下将BMMCs从T175 cm²培养瓶中转移2 将培养瓶中的细胞转移至无菌的50 mL锥形管中，于200 × g 室温下孵育5分钟。
- 将沉淀重悬于50 mL含20 ng/mL IL-3的新鲜完全RPMI培养基中，取台盼蓝染色的BMMC等分试样，用血细胞计数板计数活细胞密度。
- 根据步骤 5.1.3 中计算的细胞密度，制备 6 mL 的 BMMC 悬液，终密度为 1 × 106 细胞/毫升
- 48小时孵育设置，吸出含有3D生物打印直角水凝胶支架的A1-3孔中的PBS，然后用移液器加入1 mL BMMC（1 × 106 细胞/mL）悬液加入每孔中。同时，用移液器将1 mL BMMC（1 × 106 将细胞悬液（cells/mL）加入无生物打印结构的A4-6孔中，作为未处理对照组。将含有生物打印支架的其余孔（B1-3、C1-3、D1-3）在不含添加剂的RPMI培养基中孵育，以防止脱水，直至分别达到24、18和6小时处理时间点时接种BMMC。将无生物打印支架的孔（B4-6、C4-6、D4-6）加入1 mL PBS，孵育至对应24、18和6小时时间点时进行BMMC接种。
- 将24孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2 加湿环境
- 24小时孵育设置，吸去B1-6孔中已有的培养基/缓冲液，每孔接种1 mL BMMC（1 × 106 将细胞悬液（细胞浓度为 cells/mL）加入这些孔中，然后将培养板放回培养箱。
- 18小时孵育设置，吸去C1-6孔中已有的培养基/缓冲液，每孔接种1 mL BMMC（1 × 106 将细胞悬液（细胞数/mL）加入这些孔中。将培养板放回培养箱。
- 6小时孵育设置，吸除 D1-6 孔中已有的培养基/缓冲液，每孔接种 1 mL BMMC（1 × 106 将细胞悬液（细胞数/mL）加入这些孔中。将培养板放回培养箱。
- 终止孵育从24孔板的每个孔中分装样品，用于（i）碘化丙啶（PI）染色及流式细胞术分析，（ii）XTT细胞活力检测，以及（iii）LDH释放检测。因此，在孵育结束前应提前标记好圆底96孔板和所需的1.5 mL微量离心管。
- XTT代谢实验的细胞取样
- 在每个孔中将BMMCs充分重悬于培养基中，注意避免损伤或破坏3D生物打印的水凝胶支架。
- 无菌操作下，将每个孔中40 µL均匀的BMMC悬液转移至含有760 µL新鲜完全RPMI培养基的无菌1.5 mL离心管中（终体积为800 µL），短暂涡旋混匀。
- 将100 µL稀释后的BMMC悬液以每组三个复孔分别加入平底96孔微孔板中，该微孔板应适用于吸光度测定（参见 材料表在微孔板分光光度计上检测。
- 使用多通道微量移液器，将50 µL XTT工作液加入含有BMMC细胞悬液的每个孔中。
注意：使用前，将 XTT 试剂 5 mL 与电子耦合试剂 100 µL 混合配制 XTT 工作液。将上述组分从 -20 °C 取出后，立即在 37 °C 水浴中解冻。 - 将96孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2 湿润环境孵育24小时。
- 孵育结束后，从培养箱中取出96孔板，使其冷却至室温。使用微孔板分光光度计在450 nm处测定吸光度值，并以650 nm处的背景值进行校正。
- 乳酸脱氢酶（LDH）检测的上清液取样
- 将24孔板中每孔剩余的BMMC悬液（960 µL）转移至微量离心管中，在200 × g 室温下孵育5分钟。
- 从每个微量离心管中，用移液器吸取三份100 µL细胞培养上清液，加入96孔平底微孔板中。弃去每个微量离心管中剩余的上清液，保留BMMC沉淀，用于后续5.4.1–5.4.8步骤中PI染色。
- 将50 µL LDH工作液加入每份100 µL上清液中。
注意：请参阅 补充文件 3 用于制备LDH检测试剂。 - 室温避光孵育1小时。
- 向每个孔中加入50 µL 1 M乙酸以终止反应。
- 在微孔板分光光度计上测定490 nm处的吸光度值，并以680 nm处为背景进行减除。
- 通过碘化丙啶（PI）排斥法进行骨髓来源肥大细胞的流式细胞术分析以检测细胞活力
- 将BMMC沉淀重悬于流式洗涤缓冲液（含0.5% w/v BSA的PBS [pH 7.4]）中，于300 × g离心沉淀细胞 g 室温下孵育5分钟。
- 用流洗缓冲液重复洗涤步骤一次。
- 将每个BMMC沉淀重悬于400 µL流式洗涤缓冲液中。
注意：总共将有24个重悬的BMMC样本：12个BMMC样本在生物打印的水凝胶基质上孵育（4个时间点，每个时间点设3个复孔），12个BMMC样本在无生物打印结构的孔中孵育（4个时间点，每个时间点设3个复孔）。 - 在一个 圆底96孔微孔板，移液器 20 µL 流式洗涤缓冲液 孔中 A1-12 和 B1-12在同一个微量滴定板中，用移液器吸取 20 µL 10倍PI染色液（流式洗涤缓冲液中含100 µg/mL PI） 孔中 C1-12 和 D1-12.
- 将12个在生物打印水凝胶基质上孵育的BMMC样本各180 µL分装至孔中 A1-12 （每孔一个样本）。将12个未与生物打印水凝胶基质共孵育的BMMC样本各180 µL分装至孔中 B1-12 （每孔一个样本）。将分装至A1-12和B1-12孔的BMMC样本用作各处理条件下的未染色对照（共24个对照）。
- 将12个在生物打印支架上孵育的BMMC样本各180 µL分装至孔中 C1-12 （每孔一个样本）。将12个未与生物打印结构共培养的BMMC样本各取180 µL加入孔中 D1-12 （每孔一个样本）
注意：C1-12 和 D1-12 孔中的 BMMC 样品将使用终有效浓度为 10 µg/mL 的 PI 进行染色（共 24 个染色样品）。 - 在避光条件下，将培养板于 4 °C 孵育 1 小时，或于室温孵育 15 分钟。
- 孵育期结束后，按照第3.1节所述方法，直接从微量滴定板中在流式细胞仪上分析样品。
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结果
一种成功的生物材料油墨或培养基质最关键的特性之一是生物相容性。首要的是，该基质不得诱导细胞死亡。目前有多种基于微孔板和流式细胞术的方法可用于定量细胞活力与坏死情况；然而，这些方法不适用于分析嵌入水凝胶基质中的细胞。在本实验方案中，通过将骨髓来源的间充质细胞（BMMCs）接种于水凝胶基质或生物打印支架上，从而规避了上述限制。经过特定的孵育时间（本研究中为6–48小时）后，可通过微量移液器轻松收获BMMCs，无需对水凝胶基质或生物打印支架进行机械破坏或水解处理，避免对细胞造成物理损伤。随后，利用碘化丙啶（PI）通透性方法结合流式细胞术快速分析BMMCs的存活率。PI是一种膜不通透性染料，无法进入细胞膜完整的活细胞，仅在插入DNA碱基对之间时产生荧光16。
因此，只有细胞膜受损的细胞才对PI具有通透性，因而会产生荧光。PI通透性分析表明，当BMMC在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质上培养时，其活力未发生改变。事实上，与未在CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基质中培养的BMMC相比，所测试的所有CNC浓度（最高达12.5% w/v）均未对BMMC...
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讨论
3D 生物仿生组织的制备需要将模拟细胞外基质成分的生物墨水与细胞组分成功结合，以构建生理性的类似结构 体内 组织。因此，在构建生理性的仿生组织时，必须使用原代细胞而非永生化细胞。然而，原代免疫细胞（如肥大细胞）特别容易受到生物墨水基质本身可能引发的细胞毒性效应和表型变化的影响，这是不希望出现的情况。因此，在进行包含多种嵌入生物墨水基质中细胞类型的复杂组织3D生物打印之前，能够快速评估候选生物材料墨水对肥大细胞活力和表型（表面受体表达）的影响具有显著优势，尤其是在该过程成本高且耗时的情况下。
本实验方案的关键在于将骨髓来源的肥大细胞（BMMC）——一种原代肥大细胞——培养在预先制备的候选水凝胶生物墨水基质表面（含1–12.5%纳米纤维素晶体的琼脂糖），从而便于后续高效回收BMMC，并通过流式细胞术分析细胞活力及细胞表面受体的表达。从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓时，由于这些骨骼较为脆弱且体积较小，操作过程需要精确并注重细节。成功分离骨髓并将其接种至细胞培养基后，必须持续使用30 ng/mL小鼠重组IL-3培养4周，以持续刺激造血祖细胞分化为同时表达Kit（CD117）和F...
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披露
本工作由加拿大国家研究委员会和阿尔伯塔创新基金会资助。
致谢
感谢阿尔伯塔创新基金会（Alberta Innovates）提供纤维素纳米晶体（CNC），并感谢Ken Harris和Jae-Young Cho在制备CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质过程中提供的技术指导。我们还感谢Ben Hoffman、Heather Winchell和Nicole Diamantides在INKREDIBLE+ 3D生物打印机的安装与校准过程中提供的技术建议与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>A | |||
| 冰醋酸 | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| 琼脂糖（OmniPur） | EMD Millipore 公司 | 2125-500GM | |
| 中国台湾仓鼠IgG同型对照，APC（克隆：eBio299Arm） | 赛默飞世尔科技 | 17-4888-82 | |
| <强>B | |||
| β-巯基乙醇 | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（NAD） | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL 注射器（鲁尔锁扣接头） | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide 针头 26G × 1/2 英寸 | BD | 305111 | |
| BioLite 24 孔多孔培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 930-186 | |
| BioLite 96 孔多孔培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 通风瓶塞 | 赛默飞世尔科技 | 130-191 | |
| II级生物安全柜 | Microzone Corp.，加拿大 | BK-2-6-B3 | |
| BSA，第五组分（OmniPur） | EMD Millipore 公司 | 2930-100GM | |
| <强>C | |||
| C57BL/6小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| CD117（c-Kit）单克隆抗体，PE（克隆号：2B8） | 赛默飞世尔科技 | 12-1171-82 | |
| CELLINK 生物墨水（3 x 3 mL 筒装） | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl₂ 交联剂 - 无菌瓶装 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK 3 cc 空 cartridges，带末端和尖端帽 | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare 用于 PC | CELLINK LLC | 2.4.1 版本 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D 生物打印机 | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| 细胞增殖检测试剂盒II（XTT）（Roche） | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| 离心机（台式） | Eppendorf | 5804R | |
| 康宁科斯特 96孔透明平底未处理PS微孔板 | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 培养箱 | Binder GmbH，德国 | 9040-0113 | |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特 | A00-1-1102 | |
| <强>D | |||
| D-甘露醇（MilliporeSigma Calbiochem） | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| <强>F | |||
| Falcon 15 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌 | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌 | 康宁 | 352070 | |
| FceR1α 单克隆抗体，APC标记（克隆：MAR-1） | 赛默飞世尔科技 | 17-5898-82 | |
| 胎牛血清（FBS），经鉴定，热灭活 | 赛默飞世尔科技 | 12484028 | |
| FlowJo 软件 | Becton Dickinson & Co. USA | 版本 10.6.2 | |
| <强>G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | 版本 8.4.3 | |
| <强>H | |||
| 血细胞计数板（改进型Neubauer，0.1 mm深度Levy型） | VWR | 15170-208 | |
| HEPES 钠盐 | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| <强>我 | |||
| 碘硝基四唑氯化物（INT） | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| <强>L | |||
| L-谷氨酰胺 200 mM（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 25030-081 | |
| L-乳酸锂 | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| <强>M | |||
| MEM非必需氨基酸 100 mL 100倍浓度（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 11140-050 | |
| 1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（MPMS） | Sigma Aldrich | M8640 | |
| 微型离心管（1.7 mL，透明） | Axygen | MCT-175-C | |
| 微型离心管（2.0 mL，透明） | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic（用于制备MilliQ超纯水） | 默克密理博 | ZMQS60001 | |
| <强>N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm 滤器单元（0.2 mm 孔径，500 mL） | 赛默飞世尔科技 | 566-0020 | |
| Nalgene 注射器滤器（0.2 mm PES，25 mm） | 赛默飞世尔科技 | 725-2520 | |
| <强>P | |||
| 青霉素-链霉素溶液 100 mL（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4，无钙/镁，500 mL（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 10010-023 | |
| 碘化丙啶，1.0 mg/mL（Invitrogen） | 赛默飞世尔科技 | P3566 | |
| <强>R | |||
| 大鼠IgG2b κ同型对照，PE（克隆：eB149/10H5） | 赛默飞世尔科技 | 12-4031-82 | |
| 重组小鼠IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 培养基 1× + 2.05 mM L-谷氨酰胺（HyClone） | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| <强>S | |||
| Sarstedt 96孔圆底聚苯乙烯透明微量检测板（82.1582.001） | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| 叠氮化钠，500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 丙酮酸钠（100 mM）100倍溶液（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 11360-070 | |
| <强>T | |||
| Tris碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇） | Sigma Aldrich | 252859 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%，用于显微镜检查） | Sigma Aldrich | 93595 | |
| <强>V | |||
| VARIOSKAN LUX 微孔板分光光度计（型号：3020） | 赛默飞世尔科技 | VLBL00D0 |
参考文献
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57(2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).
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