用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备

最近对3D培养系统和3D生物打印的兴趣将注意力集中在水凝胶和水凝胶复合材料上。这些复合材料可用作粘稠但多孔的仿生剂，可由高达99%的重量含水量组成，可与生物组织相媲美^1，2，3。因此，水凝胶复合材料的这些特征允许细胞生长，而不会影响其活力和功能。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），它已被用作水凝胶复合材料，生物材料植入物开发中的细胞支架以及二维（2D）和3D 体外 细胞培养中的增强材料^4，5。在大多数情况下，由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞⁶，肠上皮细胞⁷，人骨髓来源的间充质干细胞⁸或神经元样细胞⁹没有明显的细胞毒性。然而，人骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖与木基纳米纤维素复合材料粘度的增加相关，这表明必须仔细测试基质的组成，以确定其对细胞功能的有害影响⁸。

同样，CNC可以在内化时诱导巨噬细胞中的炎症反应，这可能在3D免疫细胞培养系统中产生严重后果^10，11。事实上，关于CNC如何影响其他免疫细胞反应，特别是由肥大细胞引发的过敏性炎症反应，可用的数据很少。肥大细胞是颗粒状白细胞，表达高亲和力IgE受体FCERI，负责激活对过敏原的炎症反应。它们的增殖和分化依赖于干细胞因子（SCF），其结合酪氨酸受体Kit。肥大细胞来源于骨髓祖细胞，这些祖细胞进入循环并随后在外周迁移，在所有人体组织中无处不在¹²。由于肥大细胞在3D组织环境中起作用，因此它们是研究 体外 3D组织模型中免疫过程的理想免疫细胞候选者。然而，迄今为止，还没有含有肥大细胞的活体 外 3D组织模型。

由于肥大细胞的高度敏感性及其对外部刺激引发促炎反应的倾向，因此需要仔细考虑3D基质成分以及将肥大细胞引入3D支架的生物打印方法，如进一步讨论的那样。组织结构可以从两大类生物材料（即生物墨水和生物材料油墨）中生物制造。区别在于生物墨水是充满细胞的水凝胶复合材料，而生物材料油墨是没有细胞的水凝胶复合材料，如Groll等人^13，14所定义。因此，用生物墨水打印的3D构建体包含预先嵌入在水凝胶基质中的细胞，而用生物材料油墨打印的3D构建体需要在打印后接种细胞。来自水凝胶基生物墨水/生物材料墨水的培养支架的生物制造通常使用挤出3D生物打印机进行，该打印机通过气动或机械驱动的活塞在压力下通过微尺度喷嘴挤出生物墨水/生物材料墨水¹⁴。挤出生物打印机通过将生物墨水沉积在2D横截面图案中以"自下而上"的方法顺序堆叠在一起来制造3D支架。

为了与挤出生物打印兼容，基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水必须具有触变性（剪切变稀）特性，即生物墨水/生物材料墨水的组成水凝胶聚合物在承受剪切应力时像流体一样流过微通道喷嘴，但在去除剪切应力后恢复到粘稠的凝胶状状态¹⁵.由于其高含水量，水凝胶基生物墨水/生物材料油墨的聚合物必须以物理或共价方式交联，以保持3D生物打印结构的结构和结构完整性。在充满细胞的生物墨水的情况下，细胞在交联过程中直接受到化学应力的影响。将细胞封装在生物墨水水凝胶基质中的过程也会使细胞受到剪切应力，这可能导致活力降低和/或细胞死亡。一旦3D组织模型被生物打印，就很难区分水凝胶基质本身引发的细胞毒性水平以及挤出和交联过程。这在3D支架的背景下尤其具有挑战性，其中细胞预先嵌入在水凝胶基质中，因此难以去除细胞以进行后续分析，这将不利于肥大细胞的活力。

生成包含肥大细胞的3D组织结构体的更温和的方法涉及将细胞从细胞培养悬浮液中接种到预打印的多孔生物材料墨水3D支架中，这利用了肥大细胞从循环迁移到外周组织的先天能力。这种细胞接种方法的好处是双重的:（i）肥大细胞不会分别受到挤出和交联过程中的剪切和化学应力，以及（ii）通过温和洗涤进行分析，细胞暴露后可以很容易地从3D支架上取出，而不会对其生存能力产生不利影响。在3D生物打印的多孔水凝胶支架上接种和分析肥大细胞的细胞活力的另一个好处是，3D生物打印的水凝胶支架概括了 体内 组织的微观地形特征，这些特征不存在于散装的2D平面水凝胶盘中。这种方法是一种合适，快速且具有成本效益的方法，可以在投资昂贵的3D组织工程实验之前确定候选bioink水凝胶基质对肥大细胞以及其他免疫细胞的潜在灾难性细胞毒性作用。

注意:该方案由五个部分组成:（1）小鼠骨髓的分离和小鼠骨髓来源的肥大细胞（BMMCs）的分化，（2）在24孔系统中制造CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物并在底物上培养BMMC，（3）从CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物中去除BMMC并使用流式细胞术分析活力和生物标志物表达， （4）从市售原纤维纳米纤维素（FNC）/海藻酸钠复合生物材料墨水中对水凝胶支架进行3D生物打印，以及（5）在FNC /海藻酸钠水凝胶支架上培养BMMC，并使用流式细胞术，XTT和乳酸脱氢酶（LDH）微量滴定测定分析活力。

1. BMMC文化的产生

注意:小鼠在异氟醚麻醉后通过_CO2 窒息安乐死。分离胫骨和股骨，收获整个骨髓。所有动物研究均根据加拿大动物护理指南和政策委员会进行，并得到阿尔伯塔大学健康科学动物护理和使用委员会的批准。

1. 通过将 表 1中列出的补充剂添加到指示的最终浓度中来制备完整的RPMI-1640培养基。使用NaOH将培养基的pH值调节至7.4-7.6，使用一次性瓶盖过滤器（孔径为0.2μm）进行过滤灭菌，并在4°C黑暗中储存长达2个月。
2. 根据当地大学动物护理委员会的协议和程序从小鼠中获取股骨。
   注意:在这项研究中，从C57BL / 6小鼠中分离出股骨，但如果与研究相关，可以使用任何菌株。
3. 使用剪刀从髋关节上取下皮肤和肌肉，然后通过稍微拧出髋窝轻轻拉动股骨（图1）。注意不要折断股骨头。用剪刀将胫骨从内侧胫骨上切开。通过切开刚好在跟骨上方的爪子并丢弃。
4. 使用手术刀，去除股骨和胫骨碎片上的皮肤和软骨。使用剪刀，在股骨和胫骨的两端做一个干净的切口，露出里面的红色骨髓。如果需要，此时切除腓骨，但请注意，它可能有助于在骨髓冲洗期间操纵胫骨。
5. 准备一根 26 G 针头和 5 mL 鲁尔锁式注射器，并填充约 5 mL 如上所述制备的完整培养基。
   注意:此时，没有添加剂的不完全RPMI也可用于节省试剂。
6. 用镊子固定股骨或胫骨，将针头插入骨头的一端，然后轻轻按压注射器。将骨头放在50 mL无菌锥形管上，轻轻地将约5 mL培养基注入骨中，施加一些压力。观察骨髓碎片从骨头的另一端脱落，形成薄薄的红丝带并进入锥形管。
7. 向下旋转吸出物并重悬于完整培养基中，或直接转移到含有50 mL完整RPMI-1640培养基的T175 ^cm2 无菌组织培养瓶中。在具有30 ng / mL小鼠重组白细胞介素（IL）-3的完整RPMI-1640培养基中维持抽吸物。
8. 1天后，在光学显微镜下观察培养物。培养物将由不同形状和大小的异质细胞群甚至更大的骨髓组成。如上所述，使用完整的RPMI-1640培养基每3-5天加入15 mL新鲜培养基，并确保细胞密度不超过1×¹⁰⁶ 个细胞/mL。每周一次，在室温下以200× g 离心细胞5分钟，重悬于新鲜完整的RPMI-1640培养基中，并在新鲜的T175烧瓶中将1:4分成50mL培养基。
9. 4周后，通过流式细胞术测量CD117（Kit）和FCERI受体的表面表达来确定细胞纯度，如下所述（第3.2节）。
   注意:4周后，99%的细胞CD117（Kit）和FcεRI应呈双阳性。
10. 在4周及以后，在完全RPMI-1640培养基中用20 ng / mL IL-3维持BMMC。在大约6周时，细胞将停止分裂，不再需要分裂。每3-5天喂一次培养物，每周离心一次沉淀细胞，并重悬于新鲜完整的RPMI-1640培养基中。

2. CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶底物的制备和BMMC培养

1. 在玻璃瓶中，将0.2g琼脂糖粉末加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）（2%w / v）至最终体积为10 mL，并在100°C下煮沸1分钟以溶解。
2. 将2.5克CNC粉末溶解在PBS中，最终体积为10 mL，以制备25%w / v混合物。
3. 将2克CNC粉末溶解在PBS中至最终体积为10 mL以制备20%w / v混合物，并连续稀释20%w / v混合物以制备10%，5%和2%w / v CNC混合物。
4. 将 25%、20%、10%、5% 和 2% w/v CNC 混合物加热至 37 °C 10 分钟（图 2A）。
5. 向热琼脂糖溶液中加入0.46gD-甘露醇（4.6%w / v）并溶解。
6. 将预热的25%、20%、10%、5%和2%w/v CNC-PBS混合物与热琼脂糖/D-甘露醇溶液以1:1的比例在单独的锥形管中混合，以产生水凝胶混合物中12.5%、10%、5%、2.5%和1%w/v的最终CNC浓度。
7. 快速工作，将步骤2.6中制备的上述溶液中的500μL/孔四倍体加入24孔培养板中，并在室温下静置30分钟以促进聚合（图2B）。
8. 用微量移液器小心地将1000μLBMC悬浮液以1.1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL的密度分层在水凝胶底物的顶部，并避免用移液器的尖端接触凝胶，因为这会损坏凝胶表面并产生颗粒。
9. 将BMMC在37°C的无菌培养箱（5%CO ₂，加湿气氛）中孵育水凝胶底物18小时。

3. 流式细胞术分析

1. 通过 PI 排除对 BMMC 活力进行流式细胞术分析
   1. 小心地从CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇的顶部取出含有BMMC的培养基，避免凝胶，并将细胞转移到1.5mL微量离心管中。
   2. 用含有0.5%w / v牛血清白蛋白的PBS（pH 7.4）在室温下以300× g 洗涤BMMC两次5分钟，并重悬于180μLPBS-0.5%w / v BSA至1.5×¹⁰⁶ 个细胞/ mL的最终密度。将细胞转移到96孔圆底板中。
      注意:使用0.2μm孔径注射器过滤器对所有PBS-0.5%w / v BSA溶液进行两次过滤灭菌，并储存在4°C。
   3. 向细胞中加入20μLPBS-0.5%w / v BSA或10x PI（100μg/ mL）在PBS-0.5%w / v BSA中制备，最终浓度为10μg/ mL，并在4°C下孵育1小时或在室温下在黑暗中孵育15分钟。使用配备氩离子激光器（488-514 nm）和带通滤光片的流式细胞仪获取荧光数据，以检测578 nm处的荧光发射。在室温下以 30 μL/min 的流速采集每个样品 20，000 个事件。按如下所述分析数据（第3.2.7-3.2.10节）。
2. 用于试剂盒 （CD117） 和 FcεRI 表面受体表达的 BMMCs 的流式细胞术分析
   1. 小心地从CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇的顶部取出含有BMMC的培养基，避免凝胶，并将细胞转移到1.5mL微量离心管中。
   2. 用过滤的PBS-0.5%BSA在室温下以300× g 洗涤BMMC两次5分钟，并重悬于180μL含有0.5%w / v BSA的PBS（1.5×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）。将重悬的细胞转移到96孔圆底板中。
   3. 向细胞中加入20μL10x抗体工作溶液，分别达到0.06μg/ mL的CD117（c-Kit）-藻红蛋白（PE）和0.06μg/ mL的FcεRIα-别癣菌蓝蛋白（APC）的最终浓度。
      注意:10x抗体工作溶液必须在过滤灭菌的PBS-0.5%w / v BSA中制备。
   4. 加入20μL含有大鼠IgG2b κ同种型对照-PE或亚美尼亚仓鼠IgG同种型对照-APC的10x同种型对照工作溶液，以分离含有未在步骤3.2.3中用任何一种抗体 - 荧光团偶联物染色的细胞的孔。
      注:同种型对照、大鼠IgG2b κ同种型对照-PE和亚美尼亚仓鼠IgG同种型对照-APC用于控制抗体对BMMC的非特异性附着。由于BMMC不表达高水平的FcR，因此很少用同种型对照抗体检测到高背景荧光。在过滤器灭菌的PBS-0.5%w / v BSA中制备10x同种型控制工作溶液。
   5. 在黑暗中将96孔圆底板在4°C下孵育1小时。
   6. 通过向每个孔中加入200μL新鲜PBS-0.5%w / v BSA缓冲液来洗涤细胞，并在室温下以300× g 离心5分钟。再次重复洗涤步骤。小心除去上清液而不接触细胞沉淀;留下一些上清液，以确保细胞沉淀不受干扰。
   7. 洗涤后，将细胞重悬于100μL的0.5%w / v BSA，0.05%w / v的PBS中的叠氮化钠（pH 7.4）中，该PBS用0.2μm孔径注射器过滤器无菌过滤两次。使用流式细胞仪在PE和APC检测器通道中获取荧光数据，如上文步骤3.1.3所述。
   8. 使用能够查看和分析扩展名为".fcs"的流式细胞仪数据文件的软件分析数据。
   9. 首先通过绘制沿 x轴的前向散射（FSC）和沿 y轴绘制侧散射（SSC）和守恒细胞群的门，FSC范围为_log10 1.5-5.0，SSC范围为_log10 0.75-3.25，如图 3A（i），（ii）所示。
      注:这用于确保从分析中消除FSC和SSC值较低的电池碎片。与其他免疫细胞类型（如单核细胞和淋巴细胞）相比，肥大细胞通常是非常颗粒状（高SSC）和大（高FSC）细胞。
   10. 接下来，生成已用染料、抗体或同种型对照染色的未处理样品的FSC与SSC点阵图和直方图谱，并根据所用的特定抗体 - 荧光团偶联物或染料的发射光谱在PE或APC通道中获得平均荧光强度（MFI）。将相同的门和参数应用于所有BMMC样品，用不同的CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物孵育并用相应的同种型对照，抗体或染料染色;获取小额信贷机构。
       注:从本质上讲，未处理染色样品的FSC与SSC点阵图应与步骤3.2.9中获得的未处理/未染色样品难以区分，以确保染色程序不会改变细胞大小（由FSC测量）或粒度（由SSC测量）（图3A（i），（ii））。
   11. 从4个独立实验中计算每个样本的平均MFI和标准均值误差（SEM），然后使用统计分析软件包生成图形。
   12. 在流式细胞术数据分析软件中准备直方图叠加层（图3B，4A（ii），B（ii））。

4.3D FNC/海藻酸钠水凝胶底物的生物打印

注:本研究中使用的3D生物打印机是一种气动挤出系统，配备了两个独立的温控打印头。用于3D生物打印水凝胶支架的生物材料墨水由（a）高度水合的原纤维纳米纤维素（FNC）配制而成，其形态学上与胶原蛋白相似，（b）海藻酸钠和（c）D-甘露醇。它以 3 mL 墨盒中的无菌水凝胶悬浮液的形式提供，无菌鲁尔锁锥形生物打印喷嘴（22、25 或 27 G）可连接到该卡夹上。

1. 在室温下与打印头和打印床一起使用此协议，其中室温为20-25°C。
2. 将生物材料墨盒储存在4°C，以保持水凝胶复合材料的稳定性。在开始3D生物打印之前，从冰箱中取出墨盒（3 mL），使其平衡到室温。
3. 将生物墨水墨盒安装到 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机上
   1. 从 3 mL 生物材料墨盒中取出蓝色端盖（图 5B（i）），然后将无菌的 22 G（蓝色）锥形生物打印喷嘴固定在 Bioink 墨盒的 luer 锁定端。
      注意:在安装墨盒并执行后续校准步骤之前，必须将所需的锥形生物打印喷嘴固定在生物墨盒上，因为如果不这样做将导致3D生物打印机的 z轴校准不当。
   2. 将打印头1（PH1，左）的气压供应管连接到墨盒的另一端，然后将墨盒及其连接的锥形生物打印喷嘴插入PH1的垂直插槽（图5A（ii））。
   3. 将墨盒牢固地固定在PH1中，锥形生物打印喷嘴延伸到打印头下方。顺时针拧紧PH1上的螺钉，直到手指拧紧以将Bioink墨盒锁定到位。请注意，3D生物打印可以在PH2留空的情况下执行。
4. 校准 3D 生物打印机的 x-y-z 轴
   1. 打开 3D 生物打印机的电源，并通过 USB 2.0 电缆在连接到 3D 生物打印机的 PC 上启动生物打印机软件。
   2. 在软件中，单击 CONNECT 按钮将软件与 3D 生物打印机同步。
      注:当打印头紫外线发光二极管灯循环打开和关闭，并且HEPA滤光片风扇再次关闭和打开时，同步成功。在归位生物打印机轴和起点校准之前，必须将软件同步到3D生物打印机，如后续步骤中所述。
   3. 观察3D生物打印机主控制菜单中的四个选项:（i） 准备生物打印，（ii） 生物打印，（iii） 实用程序菜单和（iv） 状态屏幕。选择" 准备 BIOPRINT" 选项，然后向下滚动到"主轴"选项并选择" 主轴 "选项。
      注意:然后，3D生物打印机将向后和向左移动打印头组件，以分别校准 y轴和 x轴。此后，将打印头停在最左边的位置，生物打印机将抬起打印床，直到 z轴校准开关（位于打印台上）与安装在打印头上的锥形生物打印喷嘴接触1
   4. 成功校准 x-y-z 轴后，观察打印基的轻微下降以及打印头重新定位到打印床中心点上方的情况（图5A（i））。
5. 用于在24孔板中进行生物打印的生物打印机的起点校准
   1. 从密封的塑料包装中取出无菌的24孔培养板，并在板底侧的孔D1中心点处用永久性标记标记一个点。取下印版盖，将24孔培养板放在打印台上，孔D1位于打印床的左前角。
   2. 在主控制菜单上，选择" 实用工具菜单" ，然后选择" 移动轴"。沿 x 轴和 y 轴以 1 mm 为增量移动打印头，直到 PH1 的锥形生物打印喷嘴直接位于孔 D1 下标记的点上。如有必要，通过以0.1 mm为增量移动打印头来微调锥形生物打印喷嘴在点上的位置。
   3. 当直接在D1孔的中心上方时，记录锥形生物打印喷嘴的 x和 y坐标，如3D生物打印机的控制面板屏幕上所示。
      注意:对于此处使用的INKREDIBLE+ 3D生物打印机， x 和 y 坐标如下: x : -46.5 和 y : -27.5。这些坐标作为D1孔中心的起点，用于在24孔板中进行生物打印。
   4. 接下来，以1毫米为增量抬起打印床，直到孔D1的底部几乎接触到安装在打印头1中的锥形生物打印喷嘴。如有必要，以0.1毫米为增量微调打印床的移动（图5A（ii））。然后，从 "实用工具"菜单中，选择" Z 轴校准 "选项，并进一步选择并确认" 存储 Z 校准 "选项。
   5. 返回主菜单，然后选择" 准备 BIOPRINT" 选项。向下滚动到并选择" 校准 Z "选项。
      注:3D生物打印机现在将在成功执行 z轴校准后降低打印床（图5A（iii））。
6. 使用正确的起始点坐标更新 24 孔板 G 代码文件
   1. 在生物打印机软件中打开提供的24孔板几何代码（G代码）文件（补充文件1）。
      注:此 24 孔 G 代码文件对每个孔中 2 层 5 x 5 x 1 mm 直线结构的打印进行编码（图 5C（i），（iii））。提供的G代码文件可以与任何3D生物打印软件一起使用。
   2. 请注意，G 代码文件的第 1 行读取 G0 X-50.0 Y-33.5 ;D1的中心位置很好。使用步骤4.5.3中获得的值更新第1行上的 x 和 y坐标，即第1行现在应显示 为G0 X-46.5 Y-27.5 ;D1的中心位置很好。以新名称保存文件。
      注意:此过程用于校准G代码文件，以便根据所使用的特定3D生物打印机的x，y坐标在D1井的中心开始打印。这种方法可用于校准24孔板G代码文件，以便使用任何挤出3D生物打印机进行打印。出于本研究的目的，仅打印了24孔板的左半部分，即孔A1-3，B1-3，C1-3和D1-3。还提供了一个单独的G代码文件，用于编码在3 x 4网格中打印2层5 x 5 x 1 mm直线结构（补充文件2，图5C（ii））。
7. 调整打印头 1 （PH1） 的挤出压力
   1. 确保气动泵与 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机的后部进气口紧密连接，并打开气动泵。
   2. 拉出位于 INKREDIBLE+ 3D 生物打印机右侧的前向控制旋钮。
      注:前向控制旋钮调节PH1的压力，而后控制旋钮调节PH2的压力。
   3. 观察位于生物打印机正面的PH1和PH2数字压力表，每个读数接近0 kPa。顺时针缓慢旋转前向控制旋钮，直到左侧压力表指示的PH1压力达到12 kPa（图5A（iii））。
   4. 将折叠的薄纸或防水密封膜放在已安装墨盒的打印喷嘴下方，注意不要接触打印喷嘴。
   5. 从 3D 生物打印机的主控制菜单中，选择" 准备生物打印"。
   6. 导航到并选择" 打开 PH1"。请注意，生物材料墨水开始从打印喷嘴挤出。如有必要，通过顺时针旋转控制旋钮来增加挤出压力，直到生物材料油墨在连续长丝中挤出，并记录新的压力设置。快速工作以避免浪费生物材料墨水。
   7. 选择" 关闭 PH1" 以停止生物材料油墨的挤出，从打印台上取出含有挤出生物材料油墨的薄纸或薄膜，然后关闭生物打印器门。
      注:3D生物打印机将在打印过程中按照G代码文件的指示自动打开PH1的气压供应。
8. 24 孔板格式的直线水凝胶底物的 3D 生物打印
   1. 从 3D 生物打印机的主控制菜单中，选择" 实用工具菜单"。导航到并选择 禁用SD打印，这将允许生物打印机软件将G代码文件传输到3D生物打印机进行打印。
   2. 单击生物打印机软件中的 LOAD 按钮，然后选择步骤4.6.2中保存的更新的24孔板G代码文件。
   3. 在软件右侧控制面板中，选择" 打印预览 "选项卡，然后单击" 打印 "按钮开始在D1孔中进行生物打印。
      注意:如果使用3 x 4网格孔板G代码文件，生物打印将在24孔板的孔A3中终止（图5C（ii），D），而不是在打印完整的24孔板的情况下终止于孔A6。
   4. 完成直线结构的生物打印后，用盖子盖住24孔板，并将其移至II类生物安全柜中。
   5. 将每个直线结构浸入两滴无菌50 mM _CaCl2 溶液中（图5B（ii）），并在室温下孵育5分钟。
      注意:这有助于将海藻酸盐聚合物链与^{Ca2 +} 离子进行离子交联，并允许直线结构保持其结构完整性。
   6. 小心地从每个构建体中吸出_CaCl2 溶液，并在1mL的1x PBS（pH 7.4）中冲洗一次，以除去多余的_CaCl2 （图5D）。
   7. 为了防止生物打印的水凝胶结构脱水，将3D生物打印的直线结构保持在新鲜的1x PBS中，直到BMMC准备好接种到结构上（图5D）。

5. BMMCs在3D生物打印直线支架上的孵育和可行性测试

1. BMMCs在3D生物打印直线水凝胶支架上的孵育
   1. 将BMMC的等分试样一式三份地接种到3D生物打印的直线支架上，一式三份，持续四个不同的持续时间，例如6，18，24和48小时，以便所有处理同时终止。使用一式三份播种到空孔中的BMMC，持续时间与未处理的对照相同。
   2. 无菌地将BMMC从T175 ^cm2 培养瓶转移到无菌的50 mL锥形管中，并在室温下以200× g 沉淀BMMC5分钟。
   3. 将沉淀重悬于含有20ng / mL IL-3的50mL新鲜完整RPMI培养基中，并使用血细胞计数器计数台盼蓝色染色BMMC的等分试样来计算活细胞密度。
   4. 根据步骤5.1.3中计算的细胞密度，以1×106个细胞/ mL的最终密度制备^6mL 等分试样的BMMC悬浮液。
   5. 对于48小时的孵育设置，将PBS从含有3D生物打印的直线水凝胶支架的A1-3孔中吸取，并将1mL的BMMC（1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）悬浮液移入每个孔中。此外，将1mL的BMMC（1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）悬浮液移入没有生物打印构建体的A4-6孔中作为未处理的对照。将含有生物打印支架（B1-3，C1-3，D1-3）的剩余孔孵育在不含添加剂的RPMI中，以防止脱水，直到达到与BMMC播种的适当时间，持续24，18和6小时处理时间。用1 mL PBS填充没有生物打印支架（B4-6，C4-6，D4-6）的孔，直到达到24，18和6小时时间点的BMMC播种的适当时间。
   6. 将24孔板在37°C下在5%CO ₂ 加湿的气氛中孵育。
   7. 对于24小时孵育设置，从孔B1-6中吸取预先存在的培养基/缓冲液，并将1mLBMC（1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）悬浮液接种到这些孔中。将培养皿放回培养箱。
   8. 对于18小时孵育设置，从孔C1-6中吸取预先存在的培养基/缓冲液，并将1mLBMC（1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）悬浮液接种到这些孔中。将培养皿放回培养箱。
   9. 对于6小时孵育设置，从孔D1-6中吸取预先存在的培养基/缓冲液，并将1mLBMC（1×¹⁰⁶ 个细胞/ mL）悬浮液接种到这些孔中。将培养皿放回培养箱。
   10. 对于孵育终止，从24孔板的每个孔中分配样品，用于（i）PI染色和流式细胞术分析，（ii）XTT细胞活力测定和（iii）LDH释放测定。因此，确保在孵育终点之前标记圆底96孔板和必要的1.5 mL微量离心管。
2. 用于 XTT 代谢测定的细胞采样
   1. 将BMMC完全重悬在每个孔内的培养基中，注意不要损坏和碎裂3D生物打印的水凝胶支架。
   2. 无菌地将40μL均质BMMC悬浮液从每个孔转移到含有760μL新鲜完整RPMI培养基（最终体积= 800μL）的无菌1.5mL微量离心管中，并短暂涡旋混合。
   3. 将100μL稀释的BMMC悬浮液一式三份分配到平底96孔微量滴定板上，该微量滴定板适用于在微孔板分光光度计上记录吸光度测量值（见 材料表）。
   4. 使用多通道微量移液器将50μLXTT工作溶液分配到含有BMMC细胞悬浮液的每个孔中。
      注意:通过将5 mL XTT试剂与100μL电子偶联试剂混合来制备XTT工作溶液。使用前立即在37°C的水浴中从-20°C解冻这些组分。
   5. 将96孔板在37°C下在5%CO ₂ 加湿气氛中孵育24小时。
   6. 在孵育结束时，从培养箱中取出96孔板，并使其冷却至室温。在450nm处的微孔板分光光度计上记录吸光度值，并在650nm处进行背景减法。
3. 用于乳酸脱氢酶 （LDH） 测定的上清液取样
   1. 将剩余的BMMC悬浮液（960μL）从24孔板的每个孔转移到微量离心管中，并在室温下以200× g 沉淀细胞5分钟。
   2. 将三个100μL等分试样从每个微量离心管中移入96孔微量滴定平底板中。弃去每个微量离心管中剩余的上清液，并保留BMMC沉淀，以便在5.4.1-5.4.8部分用PI进一步染色。
   3. 将50μLLDH工作溶液移液到每个100μL等分试样的上清液中。
      注:有关 LDH 测定试剂的制备，请参阅 补充文件 3 。
   4. 在室温下在黑暗中孵育1小时。
   5. 将50μL1M乙酸移液到每个孔中以停止反应。
   6. 在490nm处的微孔板分光光度计上记录吸光度值，并在680nm处进行背景减法。
4. 通过碘化丙啶（PI）排除对BMMC活力进行流式细胞术分析
   1. 将BMMC沉淀重悬于流动洗涤缓冲液（PBS [pH 7.4]含有0.5%w / v BSA）中，并在室温下以300× g 沉淀细胞5分钟。
   2. 再次使用流动洗涤缓冲液重复洗涤步骤。
   3. 将每个BMMC沉淀重悬于400μL流动洗涤缓冲液中。
      注意:总共将有24个重悬的BMMC样品:12个BMMC样品在生物打印的水凝胶底物上孵育（4个时间点一式三份），12个BMMC样品在没有生物打印构建体的孔中孵育（4个时间点一式三份）。
   4. 在 圆底96孔微量滴定板中，将 20μL流动洗涤缓冲液 移入孔 A1-12 和 B1-12中。在同一微量滴定板中，将 20μL10x PI染色溶液（100μg/ mL流动洗涤缓冲液中） 移液到 孔C1-12 和 D1-12中。
   5. 将180μL在生物打印水凝胶底物上孵育的12个BMMC样品分配到 孔A1-12 中（每孔一个样品）。将12个BMMC样品中的180μL分配到没有生物打印水凝胶底物的情况下孵育到 孔B1-12 中（每孔一个样品）。使用分配到A1-12和B1-12孔中的BMMC样品作为每种处理条件的未染色对照（共24个对照）。
   6. 将12个BMMC样品中的180μL在生物打印构建体上孵育到 孔C1-12 中（每孔一个样品）。将12个BMMC样品中的180μL分配到没有生物打印构建体的情况下孵育到孔 D1-12 中（每孔一个样品）。
      注:C1-12和D1-12孔中的BMMC样品将以10μg/mL的最终有效PI浓度（总共24个染色样品）进行染色。
   7. 将板在4°C下孵育1小时或在室温下在黑暗中孵育15分钟。
   8. 在孵育期结束时，直接在流式细胞仪上从微量滴定板上分析样品，如前面在第3.1节下所述。

成功的生物材料油墨或培养基质的最关键特征之一是生物相容性。首先，底物不得诱导细胞死亡。有几种基于微量滴定和流式细胞术的方法来量化细胞活力和坏死;然而，这些方法不适合分析嵌入在水凝胶基质中的细胞。在该协议中，通过将BMMC接种到水凝胶底物或生物打印的支架上来规避上述限制。在特定的潜伏期（本研究中为6-48小时）之后，BMMCs很容易通过微量移液收获，而无需对水凝胶底物或生物打印支架进行机械破坏或水解，否则会对细胞造成物理损伤。然后通过流式细胞术使用PI渗透率方法快速分析BMMC的活力。PI是一种不透膜染料，仅在DNA16碱基对之间插入时才从具有完整细胞膜的活细胞中排除和荧光。

因此，只有细胞膜受损的细胞才能渗透到PI，因此会发出荧光。PI通透性分析表明，当BMMC在CNC/琼脂糖/D-甘露醇底物上培养时，其活力没有变化。事实上，与在没有CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶底物的情况下培养的BMMC相比，测试的CNC浓度（高达12.5%w / v）都没有对BMMC的活力产生任何不利影响（图3B，C）。同样重要的是，生物墨水或培养基质不会改变细胞的形态。基于流式细胞术FSC与SSC图，与在没有CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物的情况下培养的BMMC相比，具有最高CNC浓度（12.5%w / v）的水凝胶底物没有改变BMMC的天然尺寸（FSC）或粒度（SSC）（图3A（i），（ii））。

生物材料墨水或培养基质的另一个重要特征是它必须具有维持其所支持的细胞的分化和表型的能力。肥大细胞的两个最典型的生物标志物是高亲和力IgE受体FcεRI，它促进BMMC对抗原的反应和干细胞因子受体Kit（CD117），这是肥大细胞存活和分化所必需的。成熟的肥大细胞由这两个表面受体的表达来定义，并且对于生物墨水底物以维持它们在培养物中，它不能显着改变这两个受体的表达。CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物在CNC浓度≥2.5%时似乎增加了FcεRI和试剂盒表达（图4A（iii），B（iii））。有趣的是，升高的FcεRI和Kit表达水平在2.5%至12.5%CNC之间保持相对一致，这表明了平台效应，并表明其效应不依赖于CNC的浓度，而是依赖于水凝胶复合材料的其他一些参数。

本研究产生的3D生物打印水凝胶生物材料墨支架由原纤维纳米纤维素（FNC）代替结晶纳米纤维素和海藻酸钠作为凝胶剂，而不是琼脂糖。与CNC17相比，原纤维纳米纤维素表现出独特的纳米级形貌特征，除了3D生物打印的FNC水凝胶生物墨水底物的微观结构外，还可能潜在地影响BMMC的生存能力。在FNC / 海藻酸盐/ D-甘露醇生物墨水支架的3D生物打印和离子交联之后（图6），分别在3D生物打印的水凝胶支架上培养BMMC6，18，24和48小时，以评估BMMC响应FNC / 海藻酸盐/ D-甘露醇支架的活力动态变化， 如果有的话，在很长一段时间内。XTT测定表明，与单独培养的BMMC相比，在所有测试的时间点上，在3D生物打印水凝胶支架上培养的BMMC的代谢活性在〜100%时保持相对一致（图7A）。细胞的裂解导致LDH释放到细胞培养基中，LDH测定检测到其作为其氧化还原酶活性的函数。

与单独培养的BMMC相比，在3D生物打印水凝胶支架上培养的BMMC表现出LDH释放的逐渐时间依赖性增加;然而，这一趋势具有小于9%的非显着标准偏差（图7B）。在每个时间点，在3D生物打印水凝胶支架上培养的BMMC的PI染色显示，与单独培养的BMMC相比，存活率没有显着变化（图7C）。值得注意的是，在3D生物打印水凝胶支架上培养的PI染色BMMC的MFI在所有时间点都保持相对一致（PI-MFI为7000），并且与在CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物上培养的BMMC相似，其在所有CNC浓度（2.5-12.5%）上表现出7000的一致PI-MFI。总的来说，这些数据表明FNC /海藻酸盐/D-甘露醇水凝胶支架不会对BMMC的生存能力产生不利影响。

图 1:小鼠腿的解剖结构，描绘了从中分离骨髓的胫骨和股骨。请单击此处查看此图的放大图。

图2:CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶底物的制备。 （A）CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶底物制备方案示意图。（B）将CNC/琼脂糖/D-甘露醇制剂（PBS/琼脂糖/D-甘露醇中的0、1、2.5、5、10和12.5%（w/v）CNC）加载到如图所示的24孔板上。缩写: PBS = 磷酸盐缓冲盐水;CNC = 结晶纳米纤维素。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:在CNC /琼脂糖/D-甘露醇底物上孵育后，通过碘化丙啶排除对BMMC活力的流式细胞术分析。 从CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇水凝胶底物中除去BMMC，洗涤两次，重悬于PBS-0.5%w / v BSA中，在4°C下用PI染色1小时，并通过流式细胞术（n = 4）进行分析。每个样品总共获得了20，000个细胞，包括PE通道中的PI荧光发射检测。使用流式细胞术分析软件进行数据分析。（A）前向散射（x轴）与侧散射（y轴）点阵图分析来自（i）未处理的对照BMMC（0%CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇）和（ii）在12.5%CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇上培养的BMMC，描绘了用于数据分析的门控细胞群。（B）来自未经处理的对照BMMC（0%CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇）和在12.5%CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇上培养的门控细胞（未染色或用PI染色）的直方图叠加图谱。（C）将BMMC在不同的CNC /琼脂糖/D-甘露醇底物（1-12.5%（w / v）CNC）上培养18 h，并通过PI染色细胞的流式细胞术分析确定细胞活力。相对于未处理并用PI染色的BMMC，在不同CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物（1-12.5%（w / v）CNC）上孵育的BMMC的PI MFI的图形表示。缩写:BMMCs =骨髓来源的肥大细胞;CNC = 结晶纳米纤维素;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;BSA = 牛血清白蛋白;PI = 碘化丙啶;PE = 藻红素。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:FcεRI和试剂盒（CD117）细胞表面受体表达的流式细胞术分析。 在没有或存在CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物的情况下培养BMMC18小时，除去并分析受体表达。数据代表 4 个重复项。未处理的BMMC样品（0%CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇）中总细胞群的前向散射（x轴）与侧散射（y轴）点图，用（A）（i）同种型对照抗体-APC或（B）（i）同种型对照抗体-PE染色，以及用于数据分析的门控细胞群。单独（0% CNC/琼脂糖/D-甘露醇）或 12.5% CNC/琼脂糖/D-甘露醇底物孵育门控BMMC（用同种型对照抗体或（A）（ii）抗FcεRI-APC抗体或（B）（ii）抗试剂盒-KIT-PE抗体染色）的直方图叠加图谱。将BMMC在不同的CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇底物（1-12.5%（w / v）CNC）上培养18小时，然后分别通过流式细胞术（n = 4）进行FcεRI和Kit表面受体表达分析。在不同的CNC/琼脂糖/D-甘露醇底物（1-12.5%（w/ v）CNC）上培养后，分别用（A）（iii）抗FcεRI-APC或（B）（iii）抗Kit-PE抗体染色的BMMC的小额信贷机构的图形表示，相对于未经处理（0%CNC）的细胞，并且染色相似。缩写: CNC = 结晶纳米纤维素;APC = 异体细胞蓝蛋白;PE = 藻红素;BMMCs = 骨髓来源的肥大细胞;MFI = 平均荧光强度。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 5:以 24 孔板格式生物打印 5 x 5 x 1 mm 2 层直线 bioink 水凝胶支架所需的 3D 生物打印机设备和耗材。 （A）（i） 气动挤出 3D 生物打印机，在完成其 x-y-z 轴的归位后，打印头组件位置处于静止位置。（一）（二） 在安装生物墨盒的情况下对打印头1进行起始点校准，并将打印喷嘴直接放置在孔D1的中间，尺寸为 x-y-z 。（一）（iii） Z轴校准后PH1的位置，PH1的挤出压力设置为12 kPa。（二）（i） 含有 NFC/海藻酸盐/D-甘露醇生物材料墨水配方的生物墨盒（3 毫升）。（二）（ii）50 mM CaCl2 交联溶液的液滴分配器。（三）（i） 来自G代码文件的打印布局示意图，该文件编码在24孔板的所有孔中打印5 x 5 x 1 mm 2层直线生物墨水水凝胶支架。（三）（ii） 来自G代码文件的打印布局示意图，该文件编码仅在24孔板的A1-3，B1-3，C1-3和D1-3孔中打印5 x 5 x 1 mm 2层直线生物墨水水凝胶支架。（三）（iii）切片程序Slic3r中5 x 5 x 1 mm 2层直线生物墨水水凝胶支架图案的扩展视图。（四）实际3D生物打印的5 x 5 x 1 mm 2层直线生物墨水水凝胶支架的顶视图，以24孔板格式浸入PBS中。缩写:3D =三维;PH1 = 打印头 1;NFC = 纳米原纤维纤维素;G代码 = 几何代码;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 6:描绘了 FNC/海藻酸盐/D-甘露醇水凝胶支架上 3D 生物打印和 BMMC 培养工作流程的示意图。 使用 FNC/海藻酸盐/D-甘露醇生物墨水对水凝胶支架进行 3D 生物打印，该 G 代码文件编码 5 x 5 x 1 mm 2 层网格图案，水凝胶支架与 CaCl2 交联，并在交联的 FNC/藻酸盐/D-甘露醇水凝胶结构体上培养 BMMCs。缩写:3D =三维;2D = 二维;G代码 = 几何代码;FNC = 原纤维纳米纤维素;BMMCs = 骨髓来源的肥大细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7:在FNC /海藻酸盐/D-甘露醇支架上孵育后BMMC活力的流式细胞术（PI）和微量滴定（XTT和LDH）测定。该值分别表示为单独培养6，18，24和48小时的BMMC的XTT代谢数据的百分比。误差线表示标准偏差 （n=3）。（B）分别在FNC /海藻酸盐/D-甘露醇生物墨水支架上培养6，18，24和48小时的BMMC的LDH酶释放测定数据。值表示为相对于分别单独培养6，18，24和48小时的BMMC释放的LDH酶的折叠变化。误差线表示标准偏差 （n=3）。（C）单独或在FNC / Alginate / D-甘露醇生物墨水支架上分别培养6，18，24和48小时的PI染色BMMC的流式细胞术数据。误差线表示标准偏差 （n=3）。缩写: LDH = 乳酸脱氢酶;BMMCs = 骨髓来源的肥大细胞;FNC = 原纤维纳米纤维素;PI = 碘化丙啶;MFI = 平均荧光强度。请点击此处查看此图的放大版本。

表1:完整的RPMI-1640介质补充剂。

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这项工作得到了加拿大国家研究委员会和艾伯塔省创新的支持。