本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
三维（3D）生物打印技术利用基于水凝胶的复合材料（或称生物材料墨水），按特定图案沉积，形成可接种细胞的基质。由于许多生物材料墨水可能对原代细胞具有潜在的细胞毒性，因此在将其用于成本较高的3D组织工程过程之前，有必要确定这些水凝胶复合材料的生物相容性。一些3D培养方法（包括生物打印）要求将细胞包埋于3D基质中，这使得在不造成机械损伤的情况下难以提取和分析细胞的存活率及生物标志物表达变化。本方案以概念验证为目的，描述了一种方法，用于评估嵌入结晶纳米纤维素（CNC）的琼脂糖复合材料的生物相容性；该复合材料被制备成24孔培养系统，并利用流式细胞术检测小鼠骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的细胞活力和生物标志物表达水平。
暴露于CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质18小时后，通过碘化丙啶（PI）通透性测定，BMMC的活力未发生改变。然而，培养在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基底上的BMMC似乎略微上调了高亲和力IgE受体（FcεRI）和干细胞因子受体（Kit；CD117）的表达，尽管这种变化似乎不依赖于生物墨水复合物中CNC的含量。BMMC的活力还通过时间过程实验进行了评估，即将其暴露于由纤维状纳米纤维素（FNC）和海藻酸钠组成的商用生物材料墨水经3D挤出式生物打印机制造的水凝胶支架中。在6至48小时的时间范围内，通过流式细胞术以及微量滴定法（XTT和乳酸脱氢酶检测）测定，FNC/海藻酸钠基底未对BMMC的活力产生不利影响。本方案描述了一种高效的方法，可用于快速筛选候选生物材料墨水在作为肥大细胞接种用3D支架时的生化相容性。
引言
近年来，人们对三维培养系统和三维生物打印的兴趣日益增长，这使得水凝胶及水凝胶复合材料受到广泛关注。这些复合材料具有黏性且多孔的仿生特性，按重量计可含有高达99%的水分，与生物组织的含水量相当。1,2,3这些水凝胶复合材料的特性因而能够在不影响细胞活力和功能的前提下促进细胞生长。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），已被用作水凝胶复合材料中的增强材料、生物材料植入物开发中的细胞支架，以及二维（2D）和三维（3D）结构中的组分 体外 细胞培养4,5由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞大多不表现出明显的细胞毒性6肠上皮细胞7人骨髓来源的间充质干细胞8或类神经元细胞9然而，人类骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖能力随着木质纳米纤维素复合材料黏度的增加而降低，表明必须仔细测试基质成分对细胞功能的不利影响。8.
类似地，CNC....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本实验方案包含五个部分：（1）小鼠骨髓的分离及小鼠骨髓来源肥大细胞（BMMCs）的分化；（2）在24孔体系中制备CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基底，并在该基底上培养BMMCs；（3）从CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基底上回收BMMCs，并通过流式细胞术分析细胞活力及生物标志物表达；（4）利用市售的纤维状纳米纤维素（FNC）/海藻酸钠复合生物墨水进行水凝胶支架的3D生物打印；（5）在FNC/海藻酸钠水凝胶支架上培养BMMCs，并通过流式细胞术、XTT法和乳酸脱氢酶（LDH）微量滴定法分析细胞活力。
1. BMMC 培养物的制备
注意：小鼠通过 CO2 异氟烷麻醉后窒息处死。分离胫骨和股骨，收集全部骨髓。所有动物实验均依照加拿大动物护理委员会指南和政策进行，并获得阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会的批准。
- 通过将 表1 中列出的补充剂加入 RPMI-1640 培养基中，配制完全 RPMI-1640 培养基，使其达到指定的终浓度。使用 NaOH 将培养基 pH 值调节至 7.4–7.6，用一次性瓶顶滤器（孔径 0.2 µm）过滤除菌，并在避光条件下于 4 °C 保存，最长可保存 2 个月。
- 根据当地大学动物护理委员会的方案和程序，获取小鼠股骨。
注意：本研究中使用的股骨来自 C57BL/6 小鼠，但....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
一种成功的生物材料油墨或培养基质最关键的特性之一是生物相容性。首要的是，该基质不得诱导细胞死亡。目前有多种基于微孔板和流式细胞术的方法可用于定量细胞活力与坏死情况；然而，这些方法不适用于分析嵌入水凝胶基质中的细胞。在本实验方案中，通过将骨髓来源的间充质细胞（BMMCs）接种于水凝胶基质或生物打印支架上，从而规避了上述限制。经过特定的孵育时间（本研究中为6–48小时）后，可通过微量移液器轻松收获BMMCs，无需对水凝胶基质或生物打印支架进行机械破坏或水解处理，避免对细胞造成物理损伤。随后，利用碘化丙啶（PI）通透性方法结合流式细胞术快速分析BMMCs的存活率。PI是一种膜不通透性染料，无法进入细胞膜完整的活细胞，仅在插入DNA碱基对之间时产生荧光16。
因此，只有细胞膜受损的细胞才对PI具有通透性，因而会产生荧光。PI通透性分析表明，当BMMC在CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质上培养时，其活力未发生改变。事实上，与未在CNC/琼脂糖/D-甘露醇水凝胶基质中培养的BMMC相比，所测试的所有CNC浓度（最高达12.5% w/v）均未对BMMC.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
3D 生物仿生组织的制备需要将模拟细胞外基质成分的生物墨水与细胞组分成功结合，以构建生理性的类似结构 体内 组织。因此，在构建生理性的仿生组织时，必须使用原代细胞而非永生化细胞。然而，原代免疫细胞（如肥大细胞）特别容易受到生物墨水基质本身可能引发的细胞毒性效应和表型变化的影响，这是不希望出现的情况。因此，在进行包含多种嵌入生物墨水基质中细胞类型的复杂组织3D生物打印之前，能够快速评估候选生物材料墨水对肥大细胞活力和表型（表面受体表达）的影响具有显著优势，尤其是在该过程成本高且耗时的情况下。
本实验方案的关键在于将骨髓来源的肥大细胞（BMMC）——一种原代肥大细胞——培养在预先制备的候选水凝胶生物墨水基质表面（含1–12.5%纳米纤维素晶体的琼脂糖），从而便于后续高效回收BMMC，并通过流式细胞术分析细胞活力及细胞表面受体的表达。从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓时，由于这些骨骼较为脆弱且体积较小，操作过程需要精确并注重细节。成功分离骨髓并将其接种至细胞培养基后，必须持续使用30 ng/mL小鼠重组IL-3培养4周，以持续刺激造血祖细胞分化为同时表达Kit（CD117）和F.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
本工作由加拿大国家研究委员会和阿尔伯塔创新基金会资助。
致谢
感谢阿尔伯塔创新基金会（Alberta Innovates）提供纤维素纳米晶体（CNC），并感谢Ken Harris和Jae-Young Cho在制备CNC/琼脂糖/D-甘露醇基质过程中提供的技术指导。我们还感谢Ben Hoffman、Heather Winchell和Nicole Diamantides在INKREDIBLE+ 3D生物打印机的安装与校准过程中提供的技术建议与支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>A | |||
| 冰醋酸 | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| 琼脂糖（OmniPur） | EMD Millipore 公司 | 2125-500GM | |
| 中国台湾仓鼠IgG同型对照，APC（克隆：eBio299Arm） | 赛默飞世尔科技 | 17-4888-82 | |
| <强>B | |||
| β-巯基乙醇 | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（NAD） | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL 注射器（鲁尔锁扣接头） | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide 针头 26G × 1/2 英寸 | BD | 305111 | |
| BioLite 24 孔多孔培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 930-186 | |
| BioLite 96 孔多孔培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 通风瓶塞 | 赛默飞世尔科技 | 130-191 | |
| II级生物安全柜 | Microzone Corp.，加拿大 | BK-2-6-B3 | |
| BSA，第五组分（OmniPur） | EMD Millipore 公司 | 2930-100GM | |
| <强>C | |||
| C57BL/6小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| CD117（c-Kit）单克隆抗体，PE（克隆号：2B8） | 赛默飞世尔科技 | 12-1171-82 | |
| CELLINK 生物墨水（3 x 3 mL 筒装） | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl₂ 交联剂 - 无菌瓶装 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK 3 cc 空 cartridges，带末端和尖端帽 | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare 用于 PC | CELLINK LLC | 2.4.1 版本 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D 生物打印机 | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK 无菌标准锥形生物打印喷嘴 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| 细胞增殖检测试剂盒II（XTT）（Roche） | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| 离心机（台式） | Eppendorf | 5804R | |
| 康宁科斯特 96孔透明平底未处理PS微孔板 | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 培养箱 | Binder GmbH，德国 | 9040-0113 | |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特 | A00-1-1102 | |
| <强>D | |||
| D-甘露醇（MilliporeSigma Calbiochem） | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| <强>F | |||
| Falcon 15 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌 | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL 聚苯乙烯圆锥形管，无菌 | 康宁 | 352070 | |
| FceR1α 单克隆抗体，APC标记（克隆：MAR-1） | 赛默飞世尔科技 | 17-5898-82 | |
| 胎牛血清（FBS），经鉴定，热灭活 | 赛默飞世尔科技 | 12484028 | |
| FlowJo 软件 | Becton Dickinson & Co. USA | 版本 10.6.2 | |
| <强>G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | 版本 8.4.3 | |
| <强>H | |||
| 血细胞计数板（改进型Neubauer，0.1 mm深度Levy型） | VWR | 15170-208 | |
| HEPES 钠盐 | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| <强>我 | |||
| 碘硝基四唑氯化物（INT） | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| <强>L | |||
| L-谷氨酰胺 200 mM（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 25030-081 | |
| L-乳酸锂 | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| <强>M | |||
| MEM非必需氨基酸 100 mL 100倍浓度（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 11140-050 | |
| 1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（MPMS） | Sigma Aldrich | M8640 | |
| 微型离心管（1.7 mL，透明） | Axygen | MCT-175-C | |
| 微型离心管（2.0 mL，透明） | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic（用于制备MilliQ超纯水） | 默克密理博 | ZMQS60001 | |
| <强>N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm 滤器单元（0.2 mm 孔径，500 mL） | 赛默飞世尔科技 | 566-0020 | |
| Nalgene 注射器滤器（0.2 mm PES，25 mm） | 赛默飞世尔科技 | 725-2520 | |
| <强>P | |||
| 青霉素-链霉素溶液 100 mL（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4，无钙/镁，500 mL（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 10010-023 | |
| 碘化丙啶，1.0 mg/mL（Invitrogen） | 赛默飞世尔科技 | P3566 | |
| <强>R | |||
| 大鼠IgG2b κ同型对照，PE（克隆：eB149/10H5） | 赛默飞世尔科技 | 12-4031-82 | |
| 重组小鼠IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 培养基 1× + 2.05 mM L-谷氨酰胺（HyClone） | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| <强>S | |||
| Sarstedt 96孔圆底聚苯乙烯透明微量检测板（82.1582.001） | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| 叠氮化钠，500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 丙酮酸钠（100 mM）100倍溶液（Gibco） | 赛默飞世尔科技 | 11360-070 | |
| <强>T | |||
| Tris碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇） | Sigma Aldrich | 252859 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%，用于显微镜检查） | Sigma Aldrich | 93595 | |
| <强>V | |||
| VARIOSKAN LUX 微孔板分光光度计（型号：3020） | 赛默飞世尔科技 | VLBL00D0 |
参考文献
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
