用Fluo-4/AM染色苹果果肉中的胞质Ca2+

摘要

将苹果果肉细胞的原生质体分离后，用钙荧光试剂负载，以检测细胞质中Ca²⁺浓度。

摘要

胞质 Ca²⁺ 在植物发育过程中发挥关键作用。钙成像技术是检测胞质中 Ca²⁺ 动态变化的最灵活方法。本研究中，我们通过酶解法获得了具有活性的果肉细胞原生质体。分离得到的原生质体在 37 °C 条件下与小分子荧光试剂（Fluo-4/AM）孵育 30 分钟。荧光探针成功标记了胞质中的 Ca²⁺，但未在液泡中积累。作为 Ca²⁺ 通道阻断剂的 La³⁺ 可降低胞质荧光强度。这些结果表明，Fluo-4/AM 可用于检测果肉细胞胞质中 Ca²⁺ 的变化。综上所述，我们建立了一种有效分离果肉细胞原生质体并利用小分子钙荧光探针负载于果肉细胞胞质中以检测 Ca²⁺ 的方法。

引言

Ca²⁺ 在植物信号转导和代谢中发挥重要作用^1,2。此外，它还调控果实品质性状^3,4，包括硬度、糖含量以及贮藏期间对生理失调的敏感性^5,6。细胞质 Ca²⁺ 在信号转导中具有重要作用，并调控植物的生长与发育⁷。细胞内钙稳态的紊乱可导致苹果苦痘病⁸、梨褐斑病⁹ 和番茄脐腐病¹⁰，影响果实品质并造成严重的经济损失^3,11。钙成像具有足够的空间和时间分辨率，是观察活细胞中 Ca²⁺ 动态变化的重要方法^12,13。

目前，活细胞内钙离子成像主要有两种方法：一种是使用化学小分子荧光探针¹⁴，另一种是基因编码的钙离子传感器（GECI）^15,16。鉴于在果树中建立稳定转基因体系较为困难，且果实发育周期较长，因此GECI_S不适用于果实Ca²⁺的荧光成像。

小分子荧光探针（如 Fluo-4/AM）具有独特优势：其 AM 酯形式（可穿透细胞膜的乙酰氧基甲酯衍生物）可直接大量加载到活细胞中，无需转染，因而操作灵活、快速且无细胞毒性¹⁷。Fluo-4/AM 已成功应用于Pyrus pyrifolia¹⁸和矮牵牛¹⁹的花粉管，以及拟南芥Arabidopsis²¹的保卫细胞²⁰和根毛细胞中。

目前，关于果肉细胞钙荧光染色的报道较少²²。钙作为一种重要的矿质元素，在苹果等仁果类果树的生长发育和品质调控中发挥着关键作用。苹果树被公认为全球重要的经济树种，苹果也被视为一种健康食品²³。本研究通过酶解法从苹果果肉中获得具有活性的原生质体，随后将小分子荧光试剂导入细胞质，以检测Ca²⁺。

方案

1. 原生质体提取

1. 配制基础溶液：20 mM CaCl₂、5 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和 0.4 M D-山梨醇。
   注意：使用 0.1 M Tris 缓冲液将基础溶液的 pH 调至 5.8，经 0.22 µm 水系滤膜过滤后，于 4 °C 保存。
2. 配制酶解液：将 0.3%（w/v）Macerozyme R-10 和 0.5%（w/v）纤维素酶 R-10 加入基础溶液中混合。
3. 向 1.5 mL 离心管中加入 0.5 mL 酶解液。选取一个健康且成熟的苹果，将果肉切成 10 × 5 × 1 mm³ 的大小（图 1A-1C）。
4. 将苹果果肉小块放入含有酶解液的 1.5 mL 离心管中，然后盖紧管盖（图 1D）。
5. 在避光条件下，于 28 °C、70 rpm/min 的摇床中孵育 1 小时。
6. 洗涤果肉小块。吸除全部酶解液，然后加入 0.5 mL 基础溶液。
7. 在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。
8. 为获得原生质体悬液，从离心管底部吸取溶液（图 1E）。

2. 小分子钙离子荧光染色

1. 按1:1:2的比例配制Fluo-4/AM负载溶液，其中含2 mM Fluo-4/AM、20% F-127和10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS：80 mM Na₂HPO₄、1.36 M NaCl、20 mM KH₂PO₄和26 mM KCl）。
2. 在装有原生质体悬液的1.5 mL离心管中，加入1 µL Fluo-4/AM负载溶液至终体积为99 µL，确保荧光染料的终浓度为5 µM。混匀后盖紧管盖。
3. La³⁺处理：取98 µL原生质体悬液，加入1 µL 10 mM La³⁺溶液和1 µL Fluo-4/AM负载溶液，配制成100 µM La³⁺处理液。混匀后盖紧管盖。
4. 在37 °C避光条件下孵育30分钟。
5. 在室温下以300 × g离心2分钟，洗涤原生质体。吸除70 µL上清液，并加入70 µL基础溶液。
6. 将原生质体悬液在37 °C孵育30分钟，以完成完全去酯化。
7. 吸取15 µL原生质体悬液，滴加至载玻片上。
8. 在荧光显微镜下观察（补充图S1）。
   注：应使用高灵敏度彩色相机，例如配备3.45 µm像素分辨率的3.2 MP（2048 × 1536）CMOS传感器。
9. 选择GFP通道进行成像（20倍）。将亮度设置为0.5。
   ​注：照明光源为可调光强LED灯立方体，内置硬涂层滤光片组。Fluo-4/AM的激发波长为490 nm。

3. 原生质体活力检测

1. 制备荧光素二乙酸酯（FDA）储备液：将FDA溶解于丙酮中，直至终浓度为1 mg/mL。
2. 配制FDA工作液：取1 µL储备液与99 µL丙酮混合。
3. 向99 µL原生质体悬浮液中加入1 µL FDA工作液，通过移液吹打混匀后关闭管盖。
   注意：FDA的最终浓度为100 µg/L。
4. 室温避光染色5分钟。
5. 制备载玻片并在荧光显微镜下观察。
6. 选择GFP通道进行成像（图1F）。

4. 图像分析

1. 使用图像分析和电子表格软件（例如 Image-Pro Plus 和 Excel 2010）分析所获得的图像。
2. 从原生质体中选择两条垂直直径以计算荧光强度（补充图 S2）。测量不同处理条件下所有原生质体的荧光强度。最终处理时使用图像编辑软件。

5. 统计分析

1. 使用统计软件进行统计分析（补充图 S3）。数据以均值 ± 标准差表示。采用学生t检验分析实验组之间的差异。

结果

按照上述方案，我们采用酶解法从果肉中获得了具有活力的原生质体（图1）。部分原生质体含有液泡，而另一些则无。当未加载Ca²⁺荧光探针时，原生质体不显示荧光；而当Fluo-4/AM进入原生质体后，细胞质呈现荧光，液泡则无荧光（图2）。该结果表明，Fluo-4/AM成功标记了细胞质中的Ca²⁺，且未观察到探针在其他细胞器中的区室化积累²⁴。原生质体经FDA染色5分钟，显示出细胞质荧光，说明高温（37 °C）不影响原生质体的活力。

La³⁺是一种Ca²⁺通道阻断剂²⁵，在将Fluo-4/AM加载到原生质体时加入。100 µM的La³⁺降低了钙荧光强度（图3）。

讨论

本研究通过酶解法获得了有活力的原生质体。需要注意的是，该方法需要使用新鲜苹果。本实验方案可快速从果肉中分离出大量原生质体，用于科研工作。该方法的应用不仅限于‘富士’苹果；‘斗南’和‘蜜脆’（Honey Crisp）苹果果肉的原生质体也可通过相同方案提取（补充图S4）。酶解后的原生质体溶液中含有一定量的细胞碎片，但相较于以往方法已有一定程度改善。作为重要的细胞材料，苹果果肉原生质体可用于细胞蛋白表达技术、单细胞测序及其他相关研究。

关于植物细胞中化学荧光试剂染色的方法已有多种报道³⁰。例如，Fluo-3/AM 可在低温（4 °C）条件下负载，使其进入根尖细胞³¹；Fluo-3/AM 也可在高温（37 °C）条件下负载至花粉管中³²。Fluo-4/AM 已成功用于Pyrus pyrifolia花粉管的染色（25 °C，15 分钟）¹⁸，以及拟南芥...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10× 磷酸盐缓冲液	Solarbio	P1022	PBS（磷酸盐缓冲溶液）是一种磷酸盐缓冲体系，可提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力，是生物学中常用于分子克隆和细胞培养的缓冲盐溶液，pH值为7.4。
2-(N-吗啉代)乙磺酸	Solarbio	M8010	生物缓冲剂
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	二水合氯化钙为白色或灰色化学物质，多呈颗粒状。
纤维素酶 R-10	Yakult Honsha	MX7352	降解植物细胞壁。
D-山梨醇	Solarbio	S8090	具有良好的保湿性能，可防止干燥，并防止糖、盐等物质结晶。
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 是一种非离子型表面活性聚醚（分子量约为12500道尔顿），已被发现有助于促进水不溶性染料及其他物质在生理介质中的溶解。
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA 是一种可穿透细胞膜的酯酶底物，可作为细胞活力探针，同时检测酶活性（用于激活其荧光）和细胞膜完整性（用于细胞内荧光产物的滞留）。
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	绿色荧光钙离子指示剂 Fluo-4/AM 是 Fluo-3/AM 的改进版本，在相同浓度下具有更快的加载速度和更强的荧光信号，可被488 nm氩离子激光有效激发。
荧光显微镜	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	观察荧光图像。
离析酶 R-10	Yakult Honsha	MX7351	降解植物组织以分离单个细胞。
Tris	Solarbio	T8060	广泛用于生物化学和分子生物学实验中缓冲液的配制。