通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

摘要

神经元树突的形态通常与其功能相关。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程均表现为形态学表型。本方案描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突分支及其相关的树突棘。

摘要

大脑活动，即神经元之间传递的电化学信号，取决于神经网络的连接模式以及神经元内部突起和亚结构的形态。因此，人们对大脑功能的许多认识都是伴随着成像技术的发展而取得的，这些技术使我们能够更深入地了解神经元在大脑中的组织方式和连接关系。组织透明化技术的进步使得对较厚脑切片进行高分辨率成像成为可能，从而促进了神经元亚结构（如树突分支和树突棘）的形态重建与分析。与此同时，图像处理软件的发展为快速分析大规模成像数据集提供了方法。本研究展示了一种相对快速的方法，结合CLARITY组织透明化技术、共聚焦显微镜和图像分析，对标记的神经组织厚切片进行高分辨率的处理、可视化和分析。该实验方案将有助于深入理解健康大脑中神经连接模式和神经元形态的特征，以及在脑部疾病状态下这些特征发生的变化。

引言

理解复杂三维生物结构的空间组织、连接模式和形态对于阐明特定细胞和组织的功能至关重要。这一点在神经科学领域尤为突出，人们已投入巨大努力来构建中枢神经系统的高分辨率神经解剖图谱^1,2。对构成这些图谱的神经元进行细致观察可发现其形态多样，其连接方式和位置反映了这些不同神经元群体的功能^3,4。此外，对亚细胞结构（尤其是树突棘）的研究可以揭示突触的成熟程度，从而反映发育过程以及神经系统疾病状态^5,6,7。因此，提高成像分辨率和通量的技术方法对于在各个尺度上更深入理解脑功能至关重要。

近年来的技术进步极大地扩展了用于标记和操控神经元群体的分子与遗传工具箱。新型荧光标记物的开发，结合将这些标记物导入神经元的新方法，使得在同一动物或脑组织样本中对相互作用的神经元群体进行差异性标记成为可能^8,9,10,11。由于不透明的脂质会散射光线，而脑组织富含脂质，因此对神经元群体的成像长期以来主要局限于薄切片，或依赖先进的显微技术（如共聚焦、多光子和光片显微镜）来观察深层结构。然而，组织透明化技术的进步显著推动了这一领域的发展。透明脂质交换丙烯酰胺杂交的刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶（CLARITY）便是其中一种技术，该方法将目标组织浸润于水凝胶单体（丙烯酰胺和双丙烯酰胺）中，随后用去垢剂洗涤¹²。水凝胶单体发生杂交，形成稳定、三维、光学透明且允许大分子标记物渗透的水凝胶支架。核酸和蛋白质保留在杂交基质内，而脂质则通过去垢剂洗涤被去除（图1）。由此获得的组织既具有足够的刚性以维持细胞和非脂质分子的原始形态与空间取向，又具备足够的光学透明度，便于高分辨率地清晰成像深层结构。组织结构和空间取向的保持使得厚切片成像成为可能，从而完整保留细胞间的连接关系和空间分布特征。此外，由于在透明化过程中蛋白质和核酸的位置及可及性得以保留，透明化后的组织仍可保留基于表达的标记物以及外源性标记。因此，CLARITY 成为一种强大的方法，可用于高分辨率成像大量深层脑结构及其之间的连接网络。

CLARITY 技术的应用极大地改进了对神经元群体的成像方法。该技术尤其擅长生成大量的成像数据。CLARITY 与多种基于蛋白质的荧光技术兼容。本实验方案采用基于慢病毒的方法，稀疏地标记表达 EGFP 和 tdTomato 的细胞；然而，表达 tdTomato 或 EGFP 的转基因报告等位基因也常被用于细胞标记与重建。选择一种光稳定性好且亮度高的荧光染料至关重要（例如 EGFP 或 tdTomato）。此外，使用强启动子驱动荧光染料的表达可获得更优的对比度和图像质量。该技术的局限性在于，对如此大量数据的准确分析往往既耗时又费力。专用显微镜有助于提高通量并减轻工作负担。然而，构建、拥有和/或操作先进显微镜的成本通常对许多实验室而言过高。本研究提出了一种高通量、相对快速且简便的方法，结合大组织片段的 CLARITY 组织透明化处理与标准共聚焦显微镜，实现对大量神经组织的高分辨率可视化。本实验方案通过以下步骤描述该方法：1）神经组织的解剖与准备；2）组织透明化处理；3）组织封片；4）对制备好的组织切片进行成像；5）利用显微成像软件进行全切片图像的重建与分析（图2）。这些步骤最终获得高分辨率图像，可用于分析完整脑组织中的神经元群体、神经元连接模式、三维树突形态、树突棘的数量与形态，以及分子表达模式。

方案

以下方案遵循贝勒医学院的所有动物护理指南。

1. 解剖与组织制备

1. 通过向密闭容器中放入浸有异氟烷的毛巾，并将小鼠置于其中，使用过量异氟烷实施安乐死（或采用其他经IUCAC批准的方法）。
2. 使用25 G针头经心脏灌注动物，先灌注10 mL冰冻PBS，随后灌注10 mL 4% PFA。
3. 解剖出目标脑区（或组织）。
4. 将解剖得到的组织置于4% PFA中，在4 °C下过夜。适当的固定对该方案至关重要，此步骤不得省略或缩短。
5. 在4% PFA中固定至少12小时后，将组织转移至4%丙烯酰胺水凝胶混合液中，在4 °C下孵育24小时。
   ​注意：解冻水凝胶时，需确保其未发生聚合，若水凝胶温度过高则可能发生聚合。应在冰上解冻，以防止提前聚合。

2. 组织透明化

1. 将脑组织（仍浸没在水凝胶中）放入真空孵育箱中，在 37 °C、-90 kPa 真空条件下孵育 3 小时 。保持管盖未拧紧，以确保真空正常形成。
2. 在室温（25 °C）下，用 PBS 轻柔振荡洗涤组织 10 分钟。
3. 将聚合后的组织样本放入电泳室中，并记录组织在电泳室内的方向。
4. 用电泳 SDS 缓冲液填充电泳室和储液槽。
5. 以恒定电流模式运行样品，条件为 70 V、1 A、35 C，运行时间约为每毫米组织 2 小时。
   1. 定期检查样品；可能需要更长时间才能充分清除。建议清除的起始时间为每毫米脑组织 1–2 小时。完整的小鼠脑组织通常需要 8–10 小时才能充分清除。取出样品前请记住其方向，并确保将其以相同方向重新放回电泳室。
      ​注意：图 3A 显示了完全清除后的脑组织外观。由于存在溶解的 SDS，此时脑组织看起来呈不透明状而非透明，但在脂质提取后应几乎无黄色组织色泽。

3. 准备和安装透明化组织

1. 当样品完成透明化处理且外观足够透明时，在室温下用 PBS 洗涤过夜。尽可能频繁地更换新鲜 PBS。此步骤至关重要，可去除残留的十二烷基硫酸钠（SDS），避免其在后续步骤中形成沉淀。
2. 在最后一次 PBS 洗涤后，在室温下用去离子水洗涤组织，每次 5 分钟，共洗涤三次。此步骤中组织将变得不透明，并可能发生膨胀。
3. 将组织在折射率匹配溶液中（见表 1）于室温孵育至少 4 小时。图 3B 显示了在折射率匹配溶液中孵育后的透明化组织片段。
4. 在组织于折射率匹配溶液中孵育期间，如有需要，可构建合适的成像腔室以用于样品观察。
5. 小组织样品/切片的成像腔室构建
   1. 以玻璃载片作为固定基底，放置橡胶或塑料间隔垫，并用瞬干胶固定。若无预制间隔垫，可使用锥形管横截面制成的塑料环替代。
   2. 确保将这些部件牢固地粘附在玻璃载片上，不得留有任何缝隙（图 3C）。
   3. 将透明化后的组织置于已预先充满折射率匹配溶液的固定腔室内。
   4. 将盖玻片盖在上方，并用指甲油密封，以牢固固定组织。
   5. 通过在盖玻片上方直接滴加一滴折射率匹配封片溶液，即可对该组织进行成像。
6. 大组织成像腔室
   1. 当组织厚度超过 5 mm 时（适用于完整脑组织或半脑），需构建此类腔室。
   2. 使用一个直径为 10 cm、侧壁较高的玻璃培养皿，在其中心放置一个 50 mL 锥形管，确保该锥形管的直径足够大，可容纳所用物镜的镜筒。
   3. 配制 3% 琼脂糖水溶液，倒入玻璃培养皿与锥形管之间的空隙中，静置冷却 1 小时（图 3D）。这将形成一圈固化的琼脂糖环（图 3E）。
   4. 使用瞬干胶将组织牢固地粘附在腔室底部，并向腔室内加入折射率匹配溶液。在不会被成像的区域涂抹胶水以固定组织，以便后续从培养皿中回收组织时不会损伤感兴趣区域。
      注意：此操作具有时间敏感性，因为折射率匹配介质若未隔绝空气并在 4 °C 下保存，可能开始发生聚合。

4. 成像透明化组织样本

1. 使用配备25倍/0.95数值孔径、4 mm工作距离物镜的共聚焦显微镜采集图像。
2. 开启所有相关成像设备。将样品放置于载物台上，并在成像腔室顶部滴加一滴折射率匹配溶液。
3. 小心地将物镜接近浸没介质，形成连续的介质柱。
4. 利用落射荧光找到合适的成像视野。
5. 通过测试合适的设置，开始图像采集程序。
   1. 参考图4A设置分辨率和扫描速度。若使用共聚焦显微镜成像，应完全关闭针孔，以获得最薄的光学切片，从而实现最佳的z轴分辨率。
   2. 逐步增加激光功率或传感器增益，直至获得具有高信噪比的合适图像。
   3. 若采用标准EGFP/tdTomato双色成像，参考图4B设置光信号采集参数。
   4. 根据观察到的组织起始点和终止点设置z轴层扫参数，并参考图4C根据所需的z轴分辨率设定步进大小。
      注意：较小的步进大小可提高z轴分辨率，但也会增加激光驻留时间，可能导致样品漂白。
   5. 当对图像采集参数满意后，开始采集图像。
   6. 确保图像具有高信噪比，并能清晰显示结构的边界（图4D）。

5. 使用显微镜分析软件进行图像处理和三维定量分析

注意：显微图像分析软件包是用于三维图像可视化和处理的强大工具。其中许多程序非常适合处理从透明化组织样本成像中生成的大型数据集。以下步骤及相关图示对应于 Imaris 软件的工作流程。

1. 打开图像堆栈，并将其导入所选的分析软件中。
2. 在三维空间中查看图像，并使用显示调节器调整查找表，以更好地可视化图像。
   注意：图5A展示了通过双光子显微镜结合CLARITY组织透明化技术可实现的成像深度极限。图5B展示了来自图5A中z轴堆栈的清晰可辨的树突结构以及明显的树突棘形态。
3. 为滤除任何一致的背景信号，点击图像处理按钮，并选择背景减除滤波器。
   注意：图5C显示了处理前存在均匀雾状背景信号的图像。图5D显示了应用背景减除滤波器后的图像。
4. 观察三维图像，并通过从多个角度和缩放级别查看，熟悉该图像。
5. 开始树突追踪，首先选择Filament（丝状结构）追踪工具。
6. 点击手动编辑Filament，跳过自动创建。
7. 将模式设置为自动路径，并勾选自动居中和自动直径校正选项。
8. 按住Shift键并右击细胞体，以设定起始点。
9. 沿树突全长进行神经元追踪；在树突末端左击以设定终止点，使软件能够自动计算起点与终点之间的路径。
10. 对所有树突重复此步骤，完整描绘出细胞结构。
11. 可视化已追踪的细胞，并确认其准确性。根据需要进行手动调整。
12. 选择Creation（创建）选项卡。
13. 选择重新计算树突直径选项。
14. 按照向导完成操作，以获得更精确的树突追踪结果。
15. 选择Draw（绘制）选项卡。
16. 点击Spine（树突棘）单选按钮，开始绘制树突棘。
17. 根据需要设置树突棘的近似直径，并使用测量工具获取树突棘直径的准确表示。
18. 点击树突棘头部中心以添加新的树突棘。
19. 对树突上的所有树突棘重复此操作。
    注意：在手动添加树突棘时，必须从所有可能的角度观察树突。
20. 检查新添加的树突棘的准确性，并根据需要进行修改。
21. 选择Creation（创建）选项卡。
22. 选择重新计算树突棘直径选项，使软件能够确定正确的头部和颈部直径，这对下游数据分析至关重要。
23. 完成树突棘直径创建向导的全部步骤。
24. 观察计算结果，并根据需要进行任何手动调整。图5E展示了一个包含树突棘的完整追踪神经元。
25. 为生成树突棘分类列表，请选择Tools（工具）选项卡。
    注意：此功能需要安装MATLAB扩展。
    1. 要安装MATLAB扩展，请打开首选项窗口。
    2. 选择Custom Tools（自定义工具）选项。
    3. 添加适当的MATLAB运行时MCR。
26. 点击分类树突棘。
27. 编辑树突棘分类所需的参数。
28. 在MATLAB扩展中点击分类树突棘。图5F显示了叠加了颜色编码分类树突棘的树突。
29. 选择Statistics（统计）选项卡。
30. 通过点击该选项卡左下角的配置按钮，设置所需的统计参数以量化数据。
31. 选择统计表示方法后，使用该窗口右下角的将当前选项卡显示的统计结果导出至文件按钮导出数据。
32. 使用首选的绘图方法绘制统计图表。

结果

图像采集后，使用分析软件中的内置统计工具和分类脚本对代表性细胞形态进行了分析。所收集的数据（图6A）显示，神经元2具有更大的树突结构，并且树突棘密度更高。总体而言，这些数据表明，与神经元1相比，神经元2具有更复杂的树突结构。为验证该结果，进一步进行了标准的Sholl分析，结果证实神经元2的树突复杂性高于神经元1，表现为在距胞体50–100 µm范围内Sholl交叉次数增加（图6B）。最后，根据形态和大小，将两个成像神经元的树突棘分为四个主要类别。呈现丝状伪足样形态的树突棘可能属于较不成熟的亚型；而具有明确头部的树突棘（称为蘑菇状棘）则可能含有更成熟、更发达的突触⁷。此处展示的分析表明，与神经元2相比，神经元1含有更高比例的丝状伪足样树突棘（图6C）。因此，从形态学角度来看，神经元2在发育上更为成熟，表现为体积更大、分支更丰富，并含有更高密度的成熟树突棘。

讨论

在现代组织透明化技术出现之前，研究神经元形态需要耗时的切片、成像以及对相邻超薄切片进行重建。利用电泳组织透明化技术结合共聚焦成像，能够无阻碍地观察完整的神经元形态。从完整的树突树到最小的突触小结，神经元形态的成像与定量分析从未如此可行。

透明化脑组织的制备过程简便，仅需一种专用设备。采用本方案进行透明化和成像的组织避免了繁琐的切片、操作和封片步骤，显著缩短了从实验到图像采集所需的时间。此外，未经切片而直接成像的组织能更真实地保留原始结构，因为不存在机械损伤或需要后续图像重建的问题。最后，该方案通过同时成像大尺度特征（如树突树）和小尺度亚微米特征（如树突棘），进一步节省了时间。

本方案中的一个重要步骤集合是透明化处理后进行的洗涤步骤。这些步骤对于彻底清除SDS电泳透明缓冲液的残留至关重要。如果透明后的组织未充分洗涤，在封片过程中将形成沉淀物。这些沉淀物有时可通过将组织在37-55 °C下短暂孵育重新溶解。然而，若沉淀物持续存在，将会散射光线，导致成像深度和图像质量下降。

与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥管	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" 针头	BD	305127
30% 丙烯酰胺（无双丙烯酰胺）	National Diagnostics	EC-810
50 mL 圆锥管	Thermo Scientific	339653
电泳组织透明溶液	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
水凝胶溶液试剂盒	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
16% 多聚甲醛	EMS	15710
PBS，1×，500 mL，每箱6瓶	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY 聚合系统	Logos	C20001
X-CLARITY 组织透明系统 II	Logos	C30001