小鼠卒中模型构建：光栓法诱导局灶性皮层损伤

摘要

本文介绍光化学血栓性脑卒中模型，该模型通过在给予光敏染料后利用激光照射，经完整颅骨诱导永久性微血管闭塞，从而产生脑卒中。

摘要

中风是发达国家中导致死亡和获得性成人残疾的主要原因。尽管针对新型治疗策略已进行了广泛研究，但中风患者的治疗选择仍然有限。因此，迫切需要进一步研究中风后的病理生理通路，例如炎症反应、血管生成、神经元可塑性以及再生。鉴于 体外 为重现大脑复杂性，实验性卒中模型对于分析和后续评估这些机制的新型药物靶点至关重要。此外，迫切需要为所有操作建立详细且标准化的模型，以应对所谓的“可重复性危机”。作为ImmunoStroke研究联盟的一项工作，本文描述了一种标准化的光化学血栓性小鼠模型，该模型通过腹腔注射玫瑰红（Rose Bengal），并使用561 nm激光照射完整颅骨实现。该模型可在无需侵入性手术的情况下，在小鼠脑部任意皮层区域诱导卒中，从而实现对大脑不同区域卒中的研究。本视频中，将展示光化学血栓模型中卒中诱导的手术方法以及 展示了组织学分析。

引言

缺血性卒中仍是发达国家中死亡和获得性成人残疾的主要原因^st 21世纪，全球2017年约有270万人因此死亡¹尽管科学界付出了巨大努力，目前可用的治疗方法仍然有限。此外，由于严格的排除标准，这些本已有限的治疗选择无法惠及许多患者，因此迫切需要开发新的治疗方法，以改善卒中后的功能恢复。

考虑到无法实现 体外 为了模拟大脑复杂的相互作用，动物模型对于卒中前期研究至关重要。小鼠是卒中研究领域最常用的动物模型。这些小鼠模型中的大多数旨在通过阻断大脑中动脉（MCA）的血流来诱导梗死，因为人类卒中病灶的大多数位于MCA供血区域。²尽管这些模型能更好地模拟人类脑卒中病灶，但其手术过程复杂，且梗死体积变异较大。

自Rosenblum和El-Sabban于1977年提出光化学血栓模型³，随后Watson等人将该模型应用于大鼠⁴以来，该模型已在缺血性脑卒中研究中得到广泛应用^5,6。光化学脑卒中模型通过向血流中预先注射光敏染料，再经光照激活，从而诱导产生局部且边界明确的皮质梗死。此过程可导致光照区域的....

方案

本视频中报道的实验均按照国家关于实验动物使用的规定进行，实验方案经德国政府委员会（德国慕尼黑上巴伐利亚行政区）批准。本研究所使用的小鼠为雄性C57Bl/6J小鼠，年龄10至12周，由德国查尔斯河实验室提供。动物饲养环境温度控制在（22 °C ± 2 °C），光照-黑暗周期为12小时，可自由摄取颗粒饲料和饮水ad libitum。

1. 材料与仪器的准备

1. 将玫瑰红（Rose Bengal）溶解于0.9%生理盐水中，配制成终浓度为10 mg/mL的溶液。连接加热毯以保持手术区域温暖，并在麻醉期间维持小鼠体温在37 °C。
2. 准备好剪刀、镊子、棉片、右泛醇（dexpanthenol）眼膏和缝合材料。准备一支不含针头的生理盐水注射器，用于保持手术区域湿润。准备好麻醉气体（100% O₂ + 异氟烷）。

2. 动物准备

1. 手术前30分钟注射镇痛剂（卡洛芬4 mg/kg，布托啡诺0.1 mg/kg）。
2. 记录小鼠体重，以调整玫瑰红（Rose Bengal）的注射剂量（10 µL/g，即100 µg/g）。
3. 将小鼠放入诱导室，以4%异氟烷气流进行麻醉，直至其身体和胡须的自发运动停止。
4. 将小鼠转移至立体定位仪，使其呈俯卧位，鼻部插入麻醉面罩。固定动物后，维持异氟烷....

结果

本文所述模型为光化学血栓性脑卒中模型，通过注射玫瑰红（Rose Bengal）并在完整颅骨上以561 nm恒定波长、光纤输出功率25 mW的光照持续照射20分钟建立。尽管完整的光化学血栓手术持续约30分钟，但动物始终处于轻度麻醉状态，脑损伤程度较轻。转移至笼中约10分钟后，所有动物均已清醒，能够在笼内自由活动，并与同笼动物互动。

脑梗死体积测定是在卒中诱导后24小时，利用焦油紫染色的连续冠状脑切片进行的（图2A）。平均梗死体积为29.3 mm³，占一侧脑半球的23%。此外，该卒中模型的变异度极低，标准差约为3.5%（图2B）。病灶区域累及运动皮层，但未累及皮层下结构。

光栓塞导致了中度且长期的感觉运动功能障碍，这通过综合神经评分¹⁷（图3）得以体现；一般性及局灶性神经功能缺损在术后.......

讨论

本方案介绍了一种光血栓诱导的实验性脑卒中模型，通过在腹腔注射玫瑰红染料后，使用561 nm激光照射完整颅骨来诱导血栓形成。直到最近，该模型的应用较少，但其使用正稳步增加。

在此模型中，诱导脑卒中期间无死亡情况。总体死亡率低于5%，死亡发生在手术过程中，原因在于麻醉相关并发症，或因符合排除标准而被实施安乐死。为确保该模型的低变异性及可重复性，建议采用以下排除标准：1）手术时间超过30分钟；2）缝合材料感染；3）咬伤；4）光栓塞术后24小时无梗死灶或无前肢不对称表现。

一种广泛使用的实验性脑卒中模型是通过缝合丝线暂时阻塞大脑中动脉（MCA），即将丝线经颈内动脉插入，直至硅胶包被的尖端阻塞MCA的起始部。该模型可通过撤出丝线实现再灌注，模拟了临床上因栓塞性血栓自发或经治疗性溶栓（rtPA）后脑血流恢复的情况^18,19。然而，该方法涉及复杂的手术操作，最终梗死范围变异性大，且死亡率较高

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
561 nm 波长激光器	Solna	Cobolt HS-03
乙酸	Sigma Life Science	695092
异氟烷麻醉系统	Drager
ApopTag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒	Millipore	S7100
Bepanthen 软膏	Bayer	1578681
C57Bl/6J 小鼠	Charles River	000664
准直器	Thorlabs	F240APC-A
棉签	NOBA Verbondmitel Danz	974116
焦油紫	Sigma Life Science	C5042-10G
冷冻切片机	Thermo Scientific CryoStar NX70
70% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
96% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
99% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
滤纸	Macherey-Nagel	432018
精细剪刀	FST	15000-00
镊子	FST	11616-15
加热毯	FHC DC Temperature Controller	40-90-8D
异氟烷	Abbot	B506
异戊烷	Fluka	59070
氯胺酮	Inresa Arzneimittel GmbH
激光散斑成像仪	Perimed	PeriCam PSI HR
大剪刀	FST	1410-15
磷酸盐缓冲液 pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
防护眼镜	Laser 2000	NIR-ZS2-38
玫瑰红	Sigma Aldrich	198250-5G
Roti-Histokit 封片介质	Roth	6638.1
生理盐水溶液	Braun	131321
体视显微镜	Zeiss	Stemi DV4
立体定位仪	Stoelting	51500U
Superfrost Plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
赛拉嗪	Albrecht