荧光标记小型细胞外囊泡的摄取 体外 以及在脊髓中

摘要

我们描述了一种使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并观察其摄取的实验方案 体外 鞘内给药后在脊髓中的分布。

摘要

小型细胞外囊泡（sEVs）是所有细胞分泌的、存在于体液中的50–150 nm囊泡。sEVs可将RNA、蛋白质和脂质等生物分子从供体细胞传递至受体细胞，因此在细胞间信号传导中发挥关键作用。在中枢神经系统（CNS）中，sEVs可介导包括神经免疫相互作用在内的细胞间信号交流。通过追踪标记的sEVs在受体细胞中的摄取情况，可研究sEVs的功能 体外 和 体内本文描述了使用PKH膜染料对RAW 264.7巨噬细胞条件培养基中的sEVs进行标记的方法，并展示了Neuro-2a细胞和原代星形胶质细胞在多个时间点对不同浓度标记sEVs的摄取情况 体外还展示了通过共聚焦显微镜观察到的经鞘内递送的sEVs在小鼠脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的摄取情况。代表性结果表明不同细胞对sEVs的摄取具有时间依赖性差异，这有助于确认sEVs成功递送至脊髓。

引言

小细胞外囊泡（sEVs）是纳米级的膜源性囊泡，大小范围为50-150 nm。它们起源于多泡体（MVBs），当MVBs与细胞质膜融合时被释放到细胞外。sEVs含有miRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质，这些分子以细胞间通讯的形式在细胞之间传递。sEVs可通过多种内吞途径被受体细胞摄取，而受体细胞对sEVs的捕获是由EVs表面分子与靶细胞表面分子之间的识别所介导的¹。

小细胞外囊泡（sEVs）因其能够触发受体细胞的分子和表型变化、作为治疗剂的应用价值，以及作为货物分子或药理学试剂载体的潜力而受到广泛关注。由于其体积微小，对sEVs进行成像和追踪具有挑战性，尤其是在体内研究和临床环境中。因此，已开发出多种方法用于标记和成像sEVs，以辅助其在体外和体内²的生物分布与追踪。

研究sEV生物分布及其与靶细胞相互作用的最常用技术是用荧光染料分子对其进行标记^3,4,5,6,7。最初，EVs使用常用于细胞成像的细胞膜染料进行标记。这些荧光染料通常可标记sEV上的脂质双分子层或目标蛋白。多种亲脂性染料在掺入细胞质后可产生强烈的荧光信号，包括DiR（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide）、DiL（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate）和DiD（1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-chlorobenzenesulfonate salt）^8,9,10,11。

其他疏水性染料（如PKH67和PKH26）具有高度荧光的极性头部基团和长链脂肪族烃尾部，可轻易插入任何脂质结构中，从而实现染料的长期滞留和稳定的荧光信号¹²。PKH染料也可用于标记细胞外囊泡（EVs），从而支持在活体（in vivo）条件下研究EV的特性¹³。此外，多种其他染料已被用于通过荧光显微镜和流式细胞术观察外泌体，包括脂质标记染料¹⁴以及细胞通透性染料，如羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）^15,16和钙黄绿素乙酰氧基甲酯（AM酯）¹⁷。

关于小细胞外囊泡（sEV）介导中枢神经系统内不同细胞间相互作用的研究，为神经炎症性和神经退行性疾病的发病机制提供了重要见解¹⁸。例如，神经元来源的sEV可传播β-淀粉样肽和磷酸化tau蛋白，在阿尔茨海默病的发病过程中发挥促进作用¹⁹。此外，红细胞来源的细胞外囊泡（EV）含有大量α-突触核蛋白，能够穿越血脑屏障，参与帕金森病的病理过程²⁰。sEV具有穿越生理屏障的能力²¹，并可将其携带的生物分子传递至靶细胞，因此可作为将治疗药物递送至中枢神经系统的便捷工具²²。

在脊髓中可视化多种中枢神经系统细胞对sEV的摄取，将有助于开展机制研究，并评估来自不同细胞来源的外源性sEV治疗效果。本文描述了标记巨噬细胞来源sEV并成像其摄取过程的方法 体外 和 体内 通过神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞在腰段脊髓中定性确认sEV的递送情况，以实现可视化验证。

方案

注意：所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并经机构动物护理与使用委员会批准。 & 德雷塞尔大学医学院动物使用委员会。使用定时妊娠的CD-1小鼠进行星形胶质细胞培养，所有母鼠均在受孕后15天接收。使用10至12周龄的C57BL/6小鼠进行 体内 摄取实验

1. 从 RAW 264.7 巨噬细胞中分离小细胞外囊泡（sEVs）

1. 将RAW 264.7细胞在含有10%无外泌体胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM无外泌体培养基中，于75 cm²培养瓶中培养24–48小时。
2. 收集300 mL条件培养基，在4 °C下以300 × g离心10分钟。
3. 收集上清液，在4 °C下以2,000 × g离心20分钟。
4. 将上清液转移至离心管中，在4 °C下以12,000 × g离心35分钟。
5. 收集上清液，经0.22 µm针头滤器过滤。
6. 转移至超速离心管中，在4 °C下以110,000 × g离心80分钟。
7. 保留上清液（无外泌体培养基），将沉淀物重悬于2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 °C下以110,000 × g离心1小时。
8. 将沉淀物重悬于100 µL PBS中，用于后续纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）表征，或重悬于放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液中用于蛋白质印迹（western blotting）。

2. sEVs 的表征

1. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
   注意：使用NTA测量来自RAW 264.7细胞的纯化sEVs的粒径分布及颗粒数量/浓度。
   1. 用过滤后的PBS稀释sEVs，使每个视野中包含20–60个囊泡，以实现最佳追踪效果。
   2. 使用恒流速的注射泵将稀释后的样品注入流动池中。
   3. 采集3–5段各30秒的视频。设置快门速度和增益，并手动调节相机参数，使尽可能多的囊泡可见并可被追踪和分析。
   4. 每次记录之间推进样品以进行重复测量。优化NTA采集后的分析参数，并在不同样品间保持参数一致。
   5. 使用NTA软件分析每段视频，获得囊泡的平均粒径和浓度。
   6. 所有NTA测量均需采用相同的系统设置，以确保一致性。
2. 蛋白质印迹（Western blot）
   1. 根据试剂盒说明书，使用蛋白定量试剂盒测定sEVs、细胞裂解液和外泌体耗竭培养基中的总蛋白含量。
   2. 细胞裂解液制备：将RAW 264.7细胞在75 cm²培养瓶中培养至80–90%汇合度。用0.25%胰蛋白酶消化10–15分钟，用培养基中和胰蛋白酶，然后在400 × g离心5分钟收集细胞。将细胞重悬于新鲜生长培养基中。
   3. 使用血细胞计数板计数细胞，取1 × 10⁶个细胞转移至另一离心管中。用PBS洗涤细胞两次（离心条件同上），并在最后一次离心所得细胞沉淀中加入50 µL裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液）。
   4. 涡旋混匀细胞，冰上孵育20分钟。在4 °C、10,000 × g离心30分钟，收集上清液（即裂解液）至新的微量离心管中，保存于−80 °C直至使用。
   5. 使用截留分子量为3 kDa的离心过滤器将2 mL外泌体耗竭培养基浓缩至100 µL，再进行蛋白定量。将sEVs与裂解缓冲液按1:1比例混合，涡旋30秒，冰上孵育15分钟，用于蛋白定量。
   6. 将等量蛋白（2 µg）的sEVs、RAW 264.7细胞裂解液和外泌体耗竭培养基与还原性上样缓冲液混合。
   7. 在95 °C变性样品5分钟，冰上冷却5分钟，然后在10,000 × g离心2分钟。将样品上样至12% Tris-甘氨酸蛋白凝胶 ，在125 V电压下电泳45分钟。
   8. 在25 V电压下将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续2小时。
   9. 转膜完成后，用封闭缓冲液（见材料表）在室温下封闭PVDF膜1小时。
   10. 在摇床上，4 °C孵育一抗过夜。
       注意：所用一抗包括抗CD81抗体（1:1,000）、抗ALG-2相互作用蛋白X（Alix）抗体（1:1,000）、抗Calnexin抗体（1:1,000）和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（1:1,000）。
   11. 用1× Tris-盐水缓冲液含0.1% Tween 20（TBST）洗涤膜3次，每次15分钟，在摇床上室温孵育1小时，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG或驴抗兔IgG二抗（1:10,000）。
   12. 用1× TBST洗涤膜3次，每次15分钟，使用HRP底物检测蛋白信号。
   13. 使用蛋白质印迹成像系统通过增强化学发光法分析印迹结果。
3. 透射电子显微镜（TEM）
   1. 将sEVs重悬于0.1 M磷酸缓冲液（PB）中含2%多聚甲醛（PFA）的溶液中进行固定；涡旋2次，每次15秒。
   2. 在洁净的Parafilm膜上滴加10 µL sEV悬液。将碳膜支持的Formvar铜网（涂层面向下）漂浮于液滴上，让囊泡在干燥环境中吸附20分钟。
   3. 将铜网（膜面朝下）置于PB液滴上洗涤3次，每次2分钟。
   4. 将铜网转移至50 µL 1%戊二醛中孵育5分钟。
   5. 用100 µL蒸馏水洗涤铜网8次，每次2分钟。
   6. 将铜网置于1%醋酸双氧铀液滴上染色2分钟，进行对比增强。
   7. 在覆有Parafilm的冰盘上，将铜网置于含0.2%醋酸双氧铀和2%甲基纤维素的50 µL溶液中，孵育10分钟，进行包埋。
   8. 使用不锈钢环支撑铜网，并用滤纸吸除多余液体。
   9. 将铜网保留在环上，室温晾干10分钟。
   10. 在80 kV电压下使用透射电子显微镜观察样品。

3. sEVs 的标记

1. 将20 µg sEVs溶于1 mL稀释缓冲液中，或在1 mL稀释缓冲液中加入等体积的PBS作为染料对照。
2. 将3 µL PKH67或PKH26染料溶于1 mL稀释缓冲液中，并用移液器混匀。
3. 将稀释后的PKH染料加入稀释的sEVs中，用移液器混匀。室温避光孵育5分钟。对于染料对照，将稀释后的染料与步骤3.1中稀释的PBS混合。
4. 向含有染料和sEV混合物的离心管以及染料对照管中各加入2 mL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，以吸收多余的染料。
5. 在4 °C下以110,000 × g离心1小时。弃去上清液，将沉淀物重悬于2 mL PBS中，再次在4 °C下以110,000 × g离心1小时。用PBS重复洗涤一次，将标记的sEVs或染料对照重悬于等体积的PBS中。
6. 采用Bradford法测定总蛋白含量。

4. 神经-2a细胞对sEVs的摄取

1. 将18 mm盖玻片放入12孔板中，每孔接种10 × 10⁴个Neuro-2a细胞，加入总体积为1 mL的完全DMEM培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素）。
2. 当细胞融合度达到80–90%时，更换为无外泌体的DMEM培养基。每孔分别加入1、5或10 µg标记的sEVs，孵育1、4或24小时，以进行剂量和时间依赖性摄取实验；或加入等体积的染料对照。

5. 原代星形胶质细胞培养

1. 出生后第4天，通过诱导低温使4只新生幼鼠麻醉。
2. 将脑组织收集至含有冰冷的、添加了10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的60 mm培养皿中。
3. 解剖两侧大脑皮层并去除脑膜。使用无菌刀片将组织切碎。
4. 将组织转移至含有木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶I消化缓冲液的15 mL锥形管中，37 °C孵育20分钟，每5分钟轻轻摇动一次。
   注意：处理4只小鼠的皮层时，将9 mL含7.5 U/mL木瓜蛋白酶的HBSS溶液在37 °C下激活至少30分钟，经0.22 µm注射器滤器过滤后，加入脱氧核糖核酸酶I至终浓度为0.1 mg/mL。
5. 吸弃上清液，加入5 mL完全DMEM以灭活酶活性。使用5 mL玻璃血清移液管和火焰抛光的巴斯德移液管，轻轻吹打以解离组织。
6. 将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，并在250 × g条件下离心细胞 g 4 °C下孵育5分钟。吸除培养基，将细胞接种于10 mL完全DMEM培养基中，置于75 cm²培养瓶内² 培养瓶。铺板后4小时，将上清液更换为15 mL新鲜DMEM培养基。
7. 14 天后 体外将培养瓶转移至摇床，在320 rpm条件下振荡6小时，以分离小胶质细胞和少突胶质细胞。
8. 使用5 mL细胞解离酶对剩余的星形胶质细胞进行胰蛋白酶消化处理（材料表) ，37 °C 下孵育 10 分钟。加入 5 mL 完全 DMEM 以终止酶反应，250 × g 4 °C下离心5分钟。
9. 用完全DMEM重悬细胞。接种5 × 10⁴ 24孔板中12 mm #1.5 盖玻片上的细胞

6. 星形胶质细胞对sEVs的摄取

1. 当星形胶质细胞达到80-90%融合度时，将培养基更换为无外泌体的DMEM培养基。
2. 向细胞中加入1 µg未标记或已标记的小细胞外囊泡（sEVs）、等体积的染料对照或PBS。在sEV处理后1小时和24小时分别取细胞进行染色。

7. 免疫荧光

1. 用 PBS 清洗细胞 3 次，并在室温下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PB 固定 10 分钟。
2. 用 PB 洗涤固定后的细胞，每次 5 分钟，共 3 次；然后用含 0.1% Triton X-100 的 PB 透化处理 10–15 分钟，再用 PB 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
3. 用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 PB 在室温下封闭细胞 1 小时。
4. 加入一抗：Neuro-2a 细胞使用微管相关蛋白 2（MAP2A，1:500），原代星形胶质细胞使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP，1:500），溶于新鲜配制的含 5% NGS 的 PB 中，4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
5. 用 PB 洗涤 3 次，每次 10 分钟；然后加入荧光标记的二抗（山羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 594；或山羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488），溶于含 5% NGS 的 PB 中，在室温下于摇床上孵育 2 小时。
6. 用 PB 洗涤 3 次，每次 10 分钟；然后加入 1 µg/mL 的核染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育 10 分钟；再次用 PB 洗涤细胞 3 次。
7. 将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封固于 #1 载玻片上，置于暗处过夜干燥，随后将制备好的玻片存放在 4 °C，待共聚焦显微镜成像时使用。

8. 体内 sEVs的摄取

1. 将5 µg未标记或标记的sEVs重悬于10 µL PBS中，或等体积（10 µL）染料对照液（按第3节制备），对C57BL/6小鼠进行鞘内注射。
2. sEVs注射后6小时和18小时，通过腹腔注射每公斤体重100 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪，对小鼠进行深度麻醉。
3. 用0.9%生理盐水对小鼠进行心脏灌流，以清除血液，随后灌注新配制的冰冻4% PFA/PB溶液。
4. 取出脊髓组织，在4% PFA/PB溶液中4 °C固定24小时。随后将组织置于含30%蔗糖的PB溶液中4 °C下进行冷冻保护处理，持续24小时或直至组织沉底。处理完成后将组织于4 °C保存，直至进行免疫组织化学分析。

9. 免疫组织化学

1. 将L4-L5脊髓组织包埋于O.C.T. 化合物中，置于干冰上冷冻至完全固化。
2. 使用冷冻切片机将组织切成30 µm厚的横截面（脊髓为横切面），并将切片收集至含有PB的24孔板中。用含0.3% Triton的PB洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
3. 用含5% NGS的0.3% Triton/PB溶液在室温下封闭非特异性结合位点，封闭2小时。
4. 在含5% NGS的0.3% Triton/PB溶液中稀释一抗：Anti-MAP2A（1:500）、GFAP（1:1,000）、用于小胶质细胞的Iba1（1:2,000），然后将切片置于4 °C摇床上孵育过夜。
5. 用0.3% Triton/PB洗涤切片3次，每次5分钟；然后加入二抗（驴抗兔IgG Alexa Fluor 488，1:500，或羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488，1:500）溶于5% NGS/PB中，在室温下孵育2小时。
6. 用PB洗涤切片3次，每次5分钟；然后在室温下用1 µg/mL的DAPI孵育切片10分钟。再次用PB洗涤切片3次，每次5分钟。
7. 在体视显微镜下，用细画笔将切片转移至洁净的粘附载玻片（材料表）上进行封片。
8. 用封片剂润湿盖玻片，于室温避光条件下固化过夜。
9. 使用相应的激光在共聚焦显微镜下成像。

结果

通过离心法从RAW 264.7条件培养基中分离sEVs后，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定纯化sEVs的浓度和粒径分布。RAW 264.7来源的sEVs平均粒径为140 nm，峰值粒径为121.8 nm，表明光散射检测中大多数可检测颗粒的粒径位于外泌体或sEVs典型的50–150 nm范围内（图1A）。根据2018年细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2018）²³的建议，我们分析了一组应存在于或排除于不同EV群体中的蛋白质。对sEVs、细胞裂解液和去外泌体培养基进行的蛋白质印迹分析显示，sEV来源的蛋白样品中含有sEV标志物蛋白Alix、CD81和GAPDH。内质网驻留蛋白calnexin在细胞裂解组分中富集，而在sEVs中未检测到，因此calnexin可作为细胞污染的阴性标志物（图1B）。

接下来，我们进行了sEV摄取的剂量-反应和时间进程实验 体外Neuro-2a 细胞分别与单剂量 1 µ...

讨论

在本方案中，我们展示了使用PKH染料对sEVs进行标记，并可视化其在脊髓中的摄取过程。PKH脂溶性荧光染料广泛用于通过流式细胞术和荧光显微镜对细胞进行标记^{3,5,6,12,24,25}由于PKH染料具有相对较长的半衰期和较低的细胞毒性，可广泛用于多种 体内 和 体外 细胞追踪研究^26,27尽管优异的膜保留性和生化稳定性具有优势，但荧光探针可能与伴随sEVs纯化的脂蛋白污染物发生嵌插，从而影响对sEV内化及功能研究结果的解读。因此，sEVs的纯化与标记是本方案中的关键步骤，因为染料若持续存在于污染物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器	MilliporeSigma	Z677094
抗 Alix 抗体	Abcam	ab186429	1:1000
抗 Calnexin 抗体	Abcam	Ab10286	1:1000
抗 CD81 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	1:1000
抗 GAPDH 单克隆抗体 (14C10)	Cell Signaling Technology	2118	1:1000
抗胶质纤维酸性蛋白抗体	Sigma-Aldrich	MAB360	免疫荧光实验中 1:500；免疫组化实验中 1:1000
抗 Iba1 抗体	Wako	019-19741	1:2000
抗 MAP2A 抗体	Sigma-Aldrich	MAB378	1:500
牛血清白蛋白 (BSA)	VWR	0332
细胞筛网，40 μm	VWR	15-1040-1
离心管	Thermo Scientific	3118-0050	12,000 x g
盖玻片，12 mm，#1.5	Electron Microscopy Sciences	72230-01
盖玻片，18 mm，#1.5	Electron Microscopy Sciences	72222-01
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	1 µg/mL
DC 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad	500-0116
脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I)	MilliporeSigma	D4513-1VL
驴抗兔 IgG H&L (HRP)	Abcam	ab16284	1:10000
驴抗兔 IgG H&L，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	1:500
双面磨砂显微镜载玻片，#1	Thermo Scientific	12-552-5
不含钙和镁的 DPBS	Corning	21-031-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Corning	10-013-CV
无外泌体胎牛血清	Gibco	A27208-01
胎牛血清 (FBS)	Corning	35-011-CV
FluorChem M 成像系统	ProteinSimple
FV3000 共聚焦显微镜	Olympus
羊抗小鼠 IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6789	1:10000
羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	1:500
羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21125	1:500
汉克平衡盐溶液 (HBSS)	VWR	02-0121
HEPES	Gibco	15630080
HRP 底物	Thermo Scientific	34094
Intercept 封闭缓冲液，TBS	LI-COR Biosciences	927-60001
Laemmli SDS 样品缓冲液	Alfa Aesar	AAJ61337AC
显微盖玻片，#1	VWR	48404-454
Microm HM550	Thermo Scientific
NanoSight NS300 系统	Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 软件	Malvern Panalytical
Neuro-2a 细胞系	ATCC	CCL-131
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corporation	NC9597281
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19210
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
PKH26	Sigma-Aldrich	MINI26-1KT
PKH67	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
蛋白酶抑制剂混合物	Thermo Scientific	1862209
PVDF 转膜膜	MDI	SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 细胞系	ATCC	TIB-71
RIPA 裂解缓冲液	Sigma-Aldrich	R0278
氯化钠	AMRESCO	0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold 载玻片	Thermo Scientific	15-188-48	粘附载玻片
T-75 培养瓶	Corning	431464U
Tecnai 12 数字透射电子显微镜	FEI Company
透射电镜铜网	Electron Microscopy Sciences	FSF300-cu
Tris-甘氨酸蛋白凝胶，12%	Invitrogen	XP00120BOX
Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液	Invitrogen	LC26755
Tris-甘氨酸转膜缓冲液	Invitrogen	LC3675
TrypLE Express	Gibco	12605028	细胞解离酶
吐温 X-100	Acros Organics	327371000
胰蛋白酶，0.25%	Corning	25-053-CL
吐温 20	Sigma-Aldrich	P1379
超速离心管	Beckman	344058	110,000 x g