我们描述了一种使用PKH染料标记巨噬细胞来源的小细胞外囊泡并观察其摄取的实验方案 体外 鞘内给药后在脊髓中的分布。
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本文内容
摘要
摘要
小型细胞外囊泡（sEVs）是所有细胞分泌的、存在于体液中的50–150 nm囊泡。sEVs可将RNA、蛋白质和脂质等生物分子从供体细胞传递至受体细胞，因此在细胞间信号传导中发挥关键作用。在中枢神经系统（CNS）中，sEVs可介导包括神经免疫相互作用在内的细胞间信号交流。通过追踪标记的sEVs在受体细胞中的摄取情况，可研究sEVs的功能 体外 和 体内本文描述了使用PKH膜染料对RAW 264.7巨噬细胞条件培养基中的sEVs进行标记的方法，并展示了Neuro-2a细胞和原代星形胶质细胞在多个时间点对不同浓度标记sEVs的摄取情况 体外还展示了通过共聚焦显微镜观察到的经鞘内递送的sEVs在小鼠脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中的摄取情况。代表性结果表明不同细胞对sEVs的摄取具有时间依赖性差异，这有助于确认sEVs成功递送至脊髓。
引言
小细胞外囊泡（sEVs）是纳米级的膜源性囊泡，大小范围为50-150 nm。它们起源于多泡体（MVBs），当MVBs与细胞质膜融合时被释放到细胞外。sEVs含有miRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质，这些分子以细胞间通讯的形式在细胞之间传递。sEVs可通过多种内吞途径被受体细胞摄取，而受体细胞对sEVs的捕获是由EVs表面分子与靶细胞表面分子之间的识别所介导的1。
小细胞外囊泡（sEVs）因其能够触发受体细胞的分子和表型变化、作为治疗剂的应用价值，以及作为货物分子或药理学试剂载体的潜力而受到广泛关注。由于其体积微小，对sEVs进行成像和追踪具有挑战性，尤其是在体内研究和临床环境中。因此，已开发出多种方法用于标记和成像sEVs，以辅助其在体外和体内2的生物分布与追踪。
研究sEV生物分布及其与靶细胞相互作用的最常用技术是用荧光染料分子对其进行标记3,4,5,6,....
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方案
注意：所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的规定，并经机构动物护理与使用委员会批准。 & 德雷塞尔大学医学院动物使用委员会。使用定时妊娠的CD-1小鼠进行星形胶质细胞培养，所有母鼠均在受孕后15天接收。使用10至12周龄的C57BL/6小鼠进行 体内 摄取实验
1. 从 RAW 264.7 巨噬细胞中分离小细胞外囊泡（sEVs）
- 将RAW 264.7细胞在含有10%无外泌体胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM无外泌体培养基中，于75 cm2培养瓶中培养24–48小时。
- 收集300 mL条件培养基，在4 °C下以300 × g离心10分钟。
- 收集上清液，在4 °C下以2,000 × g离心20分钟。
- 将上清液转移至离心管中，在4 °C下以12,000 × g离心35分钟。
- 收集上清液，经0.22 µm针头滤器过滤。
- 转移至超速离心管中，在4 °C下以110,000 × g离心80分钟。
- 保留上清液（无外泌体培养基），将沉淀物重悬于2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 °C下以110,000 × g离心1小时。
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结果
通过离心法从RAW 264.7条件培养基中分离出sEVs后，采用NTA检测纯化sEVs的浓度和粒径分布。RAW 264.7来源的sEVs平均粒径为140 nm，峰值粒径为121.8 nm，表明光散射测量中大多数可检测颗粒的粒径位于外泌体或sEVs典型的50–150 nm范围内（图1A）。根据2018年细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2018）23的建议，我们分析了一组应存在于或排除于不同EV群体中的蛋白质。对sEVs、细胞裂解液和去外泌体培养基进行的Western blot结果显示，sEV来源的蛋白样品中含有sEV标志物蛋白Alix、CD81和GAPDH。细胞裂解组分中富含内质网驻留蛋白calnexin，而该蛋白在sEVs中未被检测到。因此，calnexin可作为细胞污染的阴性标志物（图1B）。
接下来，我们对sEV的摄取进行了剂量反应和时间过程实验 体外. Neuro-2a 细胞与单次处理孵.......
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讨论
在本方案中，我们展示了使用PKH染料对sEVs进行标记，并可视化其在脊髓中的摄取过程。PKH脂溶性荧光染料广泛用于通过流式细胞术和荧光显微镜对细胞进行标记3,5,6,12,24,25由于PKH染料具有相对较长的半衰期和较低的细胞毒性，可广泛用于多种 体内 和 体外 细胞追踪研究26,27尽管优异的膜保留性和生化稳定性具有优势，但荧光探针可能与伴随sEVs纯化的脂蛋白污染物发生嵌插，从而影响对sEV内化及功能研究结果的解读。因此，sEVs的纯化与标记是本方案中的关键步骤，因为染料若持续存在于污染物.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS R01NS102836）以及宾夕法尼亚州卫生部通用研究增强计划（CURE）向 Seena K. Ajit 提供的资助支持。我们感谢 Bradley Nash 博士对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器 | MilliporeSigma | Z677094 | |
| 抗 Alix 抗体 | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| 抗 Calnexin 抗体 | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| 抗 CD81 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| 抗 GAPDH 单克隆抗体 (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| 抗胶质纤维酸性蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | MAB360 | 免疫荧光实验中 1:500；免疫组化实验中 1:1000 |
| 抗 Iba1 抗体 | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| 抗 MAP2A 抗体 | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | VWR | 0332 | |
| 细胞筛网，40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| 离心管 | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| 盖玻片，12 mm，#1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| 盖玻片，18 mm，#1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0116 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| 驴抗兔 IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| 驴抗兔 IgG H&L，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| 双面磨砂显微镜载玻片，#1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| 不含钙和镁的 DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| 无外泌体胎牛血清 | Gibco | A27208-01 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M 成像系统 | ProteinSimple | ||
| FV3000 共聚焦显微镜 | Olympus | ||
| 羊抗小鼠 IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| 羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| 羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| 汉克平衡盐溶液 (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP 底物 | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept 封闭缓冲液，TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS 样品缓冲液 | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| 显微盖玻片，#1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 系统 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 软件 | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a 细胞系 | ATCC | CCL-131 | |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF 转膜膜 | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 细胞系 | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA 裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| 氯化钠 | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold 载玻片 | Thermo Scientific | 15-188-48 | 粘附载玻片 |
| T-75 培养瓶 | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 数字透射电子显微镜 | FEI Company | ||
| 透射电镜铜网 | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-甘氨酸蛋白凝胶，12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-甘氨酸转膜缓冲液 | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | 细胞解离酶 |
| 吐温 X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| 胰蛋白酶，0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 超速离心管 | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
参考文献
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....
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