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方法文章

日常使用过程中聚丙烯婴儿奶瓶微塑料释放的采样、鉴定与表征

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DOI：

10.3791/62545

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2021年7月24日

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1AMBER Research Centre and Centre for Research on Adaptive Nanostructures and Nanodevices (CRANN), Trinity College Dublin, 2Department of Civil, Structural and Environmental Engineering, Trinity College Dublin, 3TrinityHaus, Trinity College Dublin, 4School of Chemistry, Trinity College Dublin, 5BEACON, Bioeconomy SFI Research Centre, University College Dublin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究详细阐述了一种可靠且经济高效的微塑料采集与检测方案，适用于日常使用的塑料制品中微塑料的分析。

摘要

微塑料（MPs）由于可能对人类健康构成风险，正引发全球关注。针对塑料制品（如一次性塑料杯和水壶）的案例研究表明，日常使用过程中微塑料的释放量可能极高。准确测定微塑料的释放水平，是识别和量化暴露来源、评估并控制由此带来风险的关键步骤。尽管针对海洋或淡水环境中微塑料检测的方案已较为成熟，但家用塑料制品所经历的使用条件差异较大。许多塑料制品在日常使用中频繁暴露于高温环境（可达100 °C），随后又冷却至室温。因此，开发一种能够模拟特定产品实际日常使用场景的采样方案至关重要。本研究聚焦于广泛使用的聚丙烯基婴儿奶瓶，旨在建立一种适用于多种塑料制品微塑料释放研究的经济高效方案。该方案可实现：1）在采样与检测过程中有效防止潜在污染；2）基于世界卫生组织（WHO）指南，真实模拟日常使用场景，并准确收集婴儿奶瓶释放的微塑料；3）对奶瓶释放的微塑料进行经济高效的化学定性和物理形貌表征。基于该方案，使用标准聚苯乙烯微塑料（直径2 µm）的回收率为92.4–101.2%，检测到的粒径约为设计尺寸的102.2%。本文详述的方案为微塑料样品的制备与检测提供了一种可靠且经济高效的方法，将显著推动未来关于塑料制品微塑料释放的研究。

引言

大多数类型的塑料不可生物降解，但会因氧化和机械摩擦等化学与物理过程分解成微小碎片1,2。尺寸小于5 mm的塑料碎片被归类为微塑料（MPs）。微塑料广泛存在于全球几乎各个角落，因其对人类和野生动物的潜在风险而成为全球关注的问题3,4。迄今为止，已在鱼类、鸟类、昆虫5,6以及哺乳动物（如小鼠的肠道、肾脏和肝脏中）发现微塑料的显著累积7,8。研究发现，微塑料的暴露和累积可损害小鼠的脂质代谢7,8。一项针对鱼类的风险评估研究表明，亚微米级微塑料可穿透血脑屏障并导致脑损伤9。需要注意的是，迄今为止所有关于微塑料风险的研究结果均来自动物实验，其对人类健康的特定风险仍不明确。

在过去两年中，随着人类暴露于微塑料（MP）水平的确认，人们对微塑料威胁人类健康的担忧显著增加。已在人类结肠10、孕妇胎盘11以及成人粪便12中发现微塑料的累积。精确测定微塑料的释放水平对于识别暴露来源、评估健康风险以及评价任何潜在控制措施的有效性至关重要。近年来，一些案例研究报道，日常使用的塑料制品（例如塑料水壶13和一次性杯子14）可释放极高数量的微塑料。例如，一次性纸杯（内壁覆有聚乙烯-PE或共聚物薄膜）在接触85–90 °C 热水后，每毫升液体中释放约250个微米级微塑料颗粒和1.02亿个亚微米级颗粒14。一项关于聚丙烯（PP）食品容器的研究报告称，单次使用过程中容器可释放高达7.6 mg的塑料颗粒15。由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和尼龙制成的茶包释放量甚至更高，可向一杯饮料（10 mL）中释放约116亿个微塑料颗粒和31亿个纳米级微塑料颗粒16。鉴于这些日常使用的塑料制品专为食品和饮料制备而设计，大量微塑料的释放是可能的，其摄入对人体健康构成潜在威胁。

关于家用塑料制品（例如塑料水壶13和一次性杯子14）释放微塑料（MP）的研究尚处于初期阶段，但预计该领域将受到科研人员和公众越来越多的关注。这些研究所需的方法与已在室温下海水或淡水环境中建立完善的实验方案存在显著差异17。相比之下，涉及家用塑料制品日常使用的研究通常涉及更高的温度（高达100 °C），并且在许多情况下会反复冷却至室温。先前的研究指出，塑料在接触热水时可释放数百万个微塑料颗粒16,18。此外，塑料制品的长期使用可能随时间改变塑料本身的性质。因此，开发一种能够准确模拟最常见日常使用场景的采样方案至关重要。微尺寸颗粒的检测是另一项重大挑战。以往研究表明，塑料制品释放的微塑料通常小于20 µm16,19,20。检测此类微塑料需要使用孔径小且表面光滑的膜过滤器。此外，还必须将微塑料与过滤器可能捕获的其他污染物区分开来。高灵敏度拉曼光谱法可用于化学成分分析，其优势在于无需使用高功率激光，从而避免因高激光功率而容易破坏微小颗粒的问题20。因此，该实验方案必须将无污染的操作流程、最优膜过滤器的选择以及快速准确识别微塑料的表征方法相结合。

本研究聚焦于以聚丙烯（PP）为材料的婴儿奶瓶（BFB），这是日常生活中最常用的塑料制品之一。研究发现，在冲泡配方奶粉的过程中，塑料奶瓶会释放出大量微塑料（MP）18。为进一步研究日常塑料制品中微塑料的释放情况，本文详细介绍了针对婴儿奶瓶的样品制备与检测方法。在样品制备过程中，严格遵循世界卫生组织（WHO）推荐的标准配方冲调流程（包括清洗、灭菌和混匀）21。通过依据WHO指南设计实验方案，我们确保了奶瓶中微塑料的释放过程能够真实模拟家长在日常中为婴儿冲调奶粉的实际操作。过滤步骤经过专门设计，以精确收集从奶瓶中释放出的微塑料颗粒。在微塑料的化学鉴定方面，优化了拉曼光谱仪的工作条件，以获得清晰且易于识别的微塑料光谱图，同时避免目标颗粒被激光灼伤。最后，建立了使用原子力显微镜（AFM）对微塑料进行精确三维形貌成像的最佳测试程序及施加作用力的参数。本文详述的实验方案（图1）为微塑料样品的制备与检测提供了一种可靠且成本较低的方法，将显著推动未来对塑料制品的相关研究。

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方案

1. 热水制备

  1. 所有与样品接触的器具均应使用由硼硅酸盐 3.3 制成的洁净玻璃器皿，以防止任何潜在污染。使用前需彻底清洗所有玻璃器皿。
    注意：玻璃器皿上已有的划痕或缺陷部位在加热和振荡过程中可能释放颗粒。建议使用者检查玻璃器皿，避免使用有划痕的器皿。我们对不同材质玻璃（如钠钙玻璃和硼硅酸盐玻璃）制成的器皿进行了比较，结果显示硼硅酸盐 3.3 释放的玻璃颗粒最少（可通过拉曼光谱法检测），因此建议在所有实验中使用硼硅酸盐 3.3 玻璃器皿。
  2. 将 360 mL 去离子水倒入玻璃烧杯中，用洁净的玻璃圆片盖住烧杯口，然后放入全新的微波炉中，以最大功率加热 2.5 分钟。加热后轻轻摇动烧杯，以消除因受热不均造成的温度梯度，此时烧杯内水温为 70 °C，可用于样品制备。
  3. 将 1 L 去离子水倒入玻璃器皿中，用微波炉加热 14 分钟，制备 95 °C 热水用于 BFB 灭菌。
    注意：切勿使用塑料水壶制备热水。塑料水壶在煮沸过程中会向热水中释放数百万个微塑料颗粒13。

2. 配方制备过程中的微塑料释放

注意：严格按照世界卫生组织（WHO）推荐的标准配方制备流程（清洁、灭菌和混合）21，以下三个步骤模拟了在配方制备过程中从婴儿奶瓶（BFBs）释放出的微塑料（MPs）的情况。

  1. 从药店收集全新的BFB产品，在拆除包装后彻底清洁。使用洗涤剂水清洗每个BFB（在室温下重复3次），再用蒸馏水冲洗（重复3次，室温）。最后，用去离子水（DI水）在室温下冲洗BFB 3次。
    注意：请勿使用超声处理清洁BFB。尽管超声处理在实验室中广泛用于混合和清洗，但对BFB进行超声可在1分钟内严重损坏瓶体表面，并导致聚丙烯（PP）产品释放微塑料（MP）。
  2. 将BFB浸泡于95 °C的去离子水（见第1.3节）中以对瓶体进行灭菌。为防止BFB漂浮，可用不锈钢镊子轻轻按压BFB外壁，确保整个瓶体完全浸入水中。
    1. 5分钟后取出瓶子，转移至洁净的玻璃培养皿中。在空气干燥过程中，将瓶子倒置于玻璃培养皿上，直至无可见液滴残留。
  3. 向已风干的瓶子中加入180 mL热的去离子水（70 °C，来自第1.2节，符合世界卫生组织（WHO）指南）。立即用玻璃培养皿盖住瓶口，并将瓶子放入摇床中。
    1. 为模拟配方混合过程，以180 rpm的速度振摇瓶子60秒。振摇结束后，将瓶子转移至洁净的玻璃板上，使其自然冷却。

3. 用于微塑料鉴定与定量的样品制备

  1. 使用去离子水超声并彻底冲洗玻璃滤器的所有部件（直径为 25 mm 的玻璃漏斗、烧结玻璃支撑底座和接收瓶）。
    1. 将一片镀金的聚碳酸酯-PC 膜滤器（孔径 0.8 µm，金涂层厚度 40 nm）放置在玻璃底座中央。
    2. 组装玻璃漏斗和不锈钢夹具以固定膜滤器。最后将组装好的玻璃滤器连接至真空泵（图 2）。
      注意：为确保膜滤器平滑贴附在玻璃底座表面，必须保持玻璃底座湿润。如有必要，在放置膜滤器前，应在玻璃底座表面滴加 1–2 滴去离子水。
  2. 小心混合 BFB 中的冷却水样（来自第 2.3 节），然后使用玻璃移液管将一定量的水样转移至玻璃漏斗中。开启真空泵，使水样缓慢通过膜滤器进行过滤。
    1. 过滤完成后，用去离子水冲洗玻璃漏斗内部，确保漏斗壁上无残留颗粒。
      注意：为避免颗粒在膜滤器表面重叠，必须谨慎选择通过滤器的水样体积。BFB 会释放大量颗粒，因此需要使用 3–5 张膜滤器才能完成全部水样的过滤。
  3. 断开真空泵并拆卸玻璃滤器。然后使用不锈钢镊子小心取出膜滤器，并将其转移至洁净的盖玻片上。用一小段纸胶带将膜滤器固定在盖玻片上。立即将样品存放于洁净的玻璃培养皿中。

4. 原子力显微镜形貌表征的样品制备

  1. 准备一个洁净的硅片。取50 µL水样（来自2.3节），滴加在硅片表面，并在约103 °C的烘箱中烘干。若水样中微塑料含量较低，可重复此步骤。
  2. 烘干1小时后，将硅片转移至洁净的玻璃培养皿中，并置于干燥器内冷却。
  3. 硅片冷却后，将样品保存在干燥洁净的玻璃培养皿中。

5. 使用拉曼光谱法对微塑料进行鉴定与定量

  1. 使用零级校正和硅片校准拉曼系统。确保硅片的峰位位于 520.7 cm-1，且当激光强度为 100% 时，峰强度高于 6000 a.u.。
  2. 设置拉曼系统的参数，以获得高信噪比的微塑料（MP）光谱，同时避免微塑料被烧毁。将系统设置如下：532 nm 激发激光，去除宇宙射线，激光强度为 10%（激光功率为 0.18 mW），光谱分辨率为 1.5 cm-1，曝光时间为 10-20 秒，累积次数为 10-40 次，光谱范围为 200-3200 cm-1。图 3 展示了累积时间从 1 秒到 400 秒的微塑料典型光谱。
    注意：切勿直接使用 100% 激光测试颗粒，以免造成快速烧毁（若颗粒较小，可在 1 分钟内烧毁）。应先使用低强度（10-50%）进行测试。
  3. 将滤膜样品（来自第 3.3 节）放置在拉曼样品台中央。在滤膜上选择四个具有代表性的测试点（其中两个位于工作区域中部，另两个靠近工作区域边缘，图 3C），进行测试（总测试面积约为 1.5 mm2）。
  4. 使用光学显微镜（100×）观察并拍摄滤膜表面的颗粒，随后通过拉曼光谱进行化学鉴定。
    1. 将获得的拉曼光谱与参考标准聚合物光谱（来自 BFB 块体材料及先前发表文献22）进行比对。
    2. 利用 2780-2980、1400-1640 和 709-850 cm-1 范围内的强峰确定颗粒的化学性质，这些峰分别对应于与聚合物材料相关的 CH/CH2/CH3 和 C-C 基团的伸缩振动（图 3）。
  5. 使用 ImageJ 分析已鉴定微塑料的尺寸和数量。
    1. 根据测试面积、总工作面积（227 mm2）以及已知的过滤样品体积，计算水样中微塑料的浓度。
    2. 将确认的微塑料按尺寸分为五组：0.8-5 µm、5-20 µm、20-50 µm、50-100 µm 和 > 100 µm。
    3. 最后，基于过滤样品体积、记录的微塑料数量以及滤膜的测试面积，计算每升水样中的微塑料数量。

6. 使用原子力显微镜对微塑料进行表面形貌表征

  1. 使用轻敲模式探针装配原子力显微镜系统（NT-MDT）。利用台阶高度标准样品（SHS）对系统进行校准。在最佳工作条件下设置系统：扫描速率为 1 Hz，扫描尺寸为 10–50 µm，调谐频率约为 160 kHz，扫描线数为 512 像素。
  2. 将第 4.3 节中的硅片固定在原子力显微镜样品台上。观察并拍摄硅片表面的目标颗粒，随后采用第 5 节中的方法进行化学鉴定。
  3. 将系统切换至原子力显微镜模式（拉曼光谱与原子力显微镜集成在同一系统中），检测已识别微塑料颗粒的表面形貌。
  4. 使用 Gwyddion 2.54 软件分析三维数据。选择剖面选项获取颗粒的尺寸和平均高度，使用3D 视图选项获取三维结构。

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结果

为验证本方案，通过将标准聚苯乙烯微塑料小球（直径为 2.0 ± 0.1 µm）加入去离子水中制备水样。添加的微塑料数量相当于 4,500,000 个粒子/L，接近BFBs释放微塑料的水平。按照方案第2-3节操作，成功收集了微塑料（图4A），回收率为92.4-101.2%。该回收率与先前关于微塑料的研究结果相当23。使用ImageJ分析，测得标准微塑料的直径为2.04±0.08 µm（其中±表示平均值的标准误差），约为设计尺寸（2.0 ± 0.1 µm）的102.2%。同时，也检测了其他类型微塑料（如PP和PE）可能产生的干扰，但在这些标准PS水样中均未检出。因此，本研究建立的方案可避免污染，是检测BFBs释放微塑料的可靠方法。

本方案用于检测八种畅销的瓶装婴儿配方奶粉（BFB）产品中微塑料（MP）的释放情况。图4B展示了收集在膜过滤器表面的典型微塑料颗粒。在使用拉曼光谱进行化学测定过程中（

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讨论

尽管关于海洋和淡水中微塑料（MPs）的研究已有广泛报道，并且相关标准操作规程已经建立17，但日常使用的塑料制品研究是一个重要的新兴研究领域。家用塑料制品所经历的不同环境条件意味着需要格外谨慎和努力，以获得可靠的结果。研究方案必须与真实的日常使用场景保持一致。例如，超声处理在实验室测试中被广泛用于样品清洗，但研究发现，仅1分钟的超声处理即可严重破坏BFB表面，导致微塑料释放量高出一个数量级。此前也有报道指出超声处理会引起类似的聚合物断裂27，这表明超声处理并不适合作为微塑料研究中塑料样品制备的清洗方法。

此外，必须识别并消除潜在的污染源。烧水壶被广泛用于制备热水，而热水是进行BFB测试所必需的。然而，单次煮沸可在塑料水壶中产生高达每升3000万个微粒13。微波炉是一种非接触式制备热水的方法，只需注意避免局部过热即可。在过滤操作中，建议使用玻璃移液管而非塑料移液管（通常由聚丙烯制成）。据报道，对于全新的聚丙烯产品，由于制造工艺的原因，其表面会附...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。本出版物中材料的呈现并不表示都柏林圣三一学院对特定公司或某些制造商产品的任何观点，也不意味着都柏林圣三一学院认可、推荐、批评或其他方式将这些公司或产品置于优于其他同类公司或产品的地位。本刊已尽力确保内容准确，但不承担因使用本文内容而产生的任何责任。已采取一切合理预防措施以核实本出版物所含信息，但所发布材料的分发不附带任何形式的明示或暗示保证。对于材料的解释和使用责任由读者自行承担。在任何情况下，都柏林圣三一学院均不对因使用本材料而引起的损害承担责任。

致谢

作者感谢爱尔兰企业局（资助编号：CF20180870）和爱尔兰科学基金会（资助编号：20/FIP/PL/8733、12/RC/2278_P2 和 16/IA/4462）提供的资金支持。我们还感谢都柏林圣三一大学工程学院奖学金以及中国国家留学基金管理委员会（编号：201506210089 和 201608300005）提供的经费支持。此外，我们感谢都柏林圣三一大学土木、结构与环境工程系及 AMBER 研究中心的 Sarah Mc Cormack 教授以及技术人员团队（David A. McAulay、Mary O'Shea、Patrick L.K. Veale、Robert Fitzpatrick 和 Mark Gilligan 等）提供的专业帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
原子力显微镜悬臂NANOSENSORSPPP-NCSTAuD-10用于获取聚丙烯微塑料的三维形貌
原子力显微镜NovaNT-MDT用于获取聚丙烯微塑料的三维形貌
洗涤剂Fairy Original1015054用于清洗全新产品
金镀层聚碳酸酯-PC膜滤膜-0.8 µmAPC, Germany0.8um25mmGold用于收集水中的微塑料，并有利于拉曼检测
Gwyddion 软件GwyddionGwyddion2.54用于确定微塑料的形貌
ImageJ 软件美国国立卫生研究院无，免费使用用于确定微塑料的尺寸
微波炉De'longhi, 意大利815/1195用于制备热水
光学显微镜，x100三丰，日本46-147用于寻找和观察微小的微塑料
拉曼光谱仪雷尼绍InVia 共焦拉曼系统用于化学鉴定聚丙烯微塑料
振荡摇床-SSL2Stuart, 英国51900-64用于模拟样品制备过程中的混合过程
标准聚苯乙烯微塑料微球Polysciences, 欧洲64050-15用于验证当前实验方案的稳健性
带玻璃尖端的移液管Macro, Brand26200用于将水样转移至玻璃滤膜
超声波清洗器Witeg, 德国DH.WUC.D06H用于清洗玻璃器皿
真空泵ILMVAC GmbH105697用于过滤水样

参考文献

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