在麻醉及清醒非人灵长类动物脑内进行光遗传学AAV载体注射

摘要

目前在非人灵长类动物中实施的光遗传学技术需要向大脑内注射病毒载体。理想的注射方法应具有可靠性，并且对于许多应用而言，能够靶向任意深度的单个位点，且这些位点可在死后组织学分析中被清晰、明确地识别。本文介绍了一种具备上述特性的注射方法。

摘要

光遗传学技术彻底改变了神经科学研究，并有望在神经系统疾病的基因治疗中发挥同样重要的作用。然而，光遗传学的临床应用需要在动物模型中证明其安全性和有效性，理想情况下应使用非人灵长类动物（NHP），因为它们在神经系统上与人类具有高度相似性。目前潜在可用于神经科学和医学研究的候选载体数量庞大，但尚无高通量的方法来测试这些载体。因此，亟需一种能够向非人灵长类动物脑内进行多个空间位置精确且体积可控的病毒载体注射，并能通过死后组织学方法明确识别注射位点的技术。本文所述即为此类方法。注射套管由聚四氟乙烯和不锈钢管连接构成，该套管可高压灭菌、一次性使用，且具有极低的最小装载体积，非常适合注射昂贵且高浓度的病毒载体溶液。通过在死腔中填充惰性红色染色矿物油，并与载体溶液形成清晰可见的弯月面，可实现对注射速率和体积的即时且准确测量。矿物油从套管后端注入，从而降低与病毒载体共注射的风险。套管可在10分钟内完成装载，注射操作可在20分钟内完成。该方法适用于对清醒或麻醉状态下的动物进行注射。当用于递送高质量病毒载体时，该技术可实现光遗传学蛋白的强效表达，从而实现对非人灵长类动物神经活动和行为的光学调控。

引言

在非人灵长类动物（NHP）中，光遗传学技术通常涉及将病毒载体直接注射到大脑中。其中一类非常适合此类应用的载体是 基于腺相关病毒（AAV）的载体。这些载体由蛋白质衣壳包裹单链DNA基因组构成，而该基因组又包含启动子、视蛋白基因，以及可选的其他蛋白质编码序列和基因调控元件。分子克隆技术的进步 促进了这些组分的改造与组合，从而推动新型载体的开发。因此，可用于非人灵长类动物光遗传学研究的AAV载体种类日益增多，数量迅速扩大。

目前，AAV 载体在非人灵长类动物光遗传学中的应用效能尚需验证 体内这一事实严重阻碍了研究进展。动物的使用必须尽可能节制，而在单个动物体内测试多种载体时，需要根据神经结构谨慎选择注射位点，并确保各注射位点之间有足够的距离以避免病毒扩散相互干扰。准确的组织学评估要求 注射需在空间和体积上精确。一种先前用于局灶性递送药理学试剂的注射技术^1,2,3,4 已对该注射技术进行改进和简化以实现此类注射。该技术成本低廉，使用可弃用且可消毒的组件，适用于麻醉或清醒行为状态的猴，可靶向任意深度的不同脑区。以下方案详细描述了可弃用组件的制备及注射操作的逐步流程 在非人灵长类动物脑部的注射。讨论了该技术的优缺点。

方案

所有实验均遵循《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并超过了实验动物资源研究所和国际实验动物护理评估和认证协会推荐的最低要求。所有操作均经过华盛顿大学动物护理和使用委员会评估并批准（UW IACUC 方案编号：4167-01）。五只健康的猕猴（2只 Macaca mulatta，3只 Macaca nemestrina；雄性，4-11岁）参与了本研究。所有外科手术过程中均使用无菌器械和无菌技术。

1. 制备套管（图1A）

1. 各部件的准备
   1. 使用圆盘磨床将皮下注射针头（30 G，长度13 mm）的尖端磨钝。
   2. 将不锈钢管（30 G，内径 = 0.16 mm，外径 = 0.31 mm）切割至与目标脑区深度相适应的长度（25 mm适用于向大脑皮层背侧表面注射）。使用圆盘磨床将切好的管子一端磨成斜面，另一端修平。用铰刀去除管子内壁的毛刺。
   3. 将聚四氟乙烯（PFTE）管（内径 = 0.23 mm ± 0.02 mm，壁厚 = 0.23 mm ± 0.02 mm，1 mm对应42 nL ± 7 nL液体）切割至适合待加载病毒载体溶液体积的长度（1 µL载体溶液占据24 mm管长）。通过插入已磨钝的皮下注射针头，将PTFE管两端扩口。
2. 将磨钝的皮下注射针头插入PTFE管一端约5 mm处。将未磨斜面的一端不锈钢管插入PTFE管另一端约5 mm处（图1A）。
3. 进行注射前测试。通过套管的皮下注射针头接头注入过滤水，确认水从不锈钢管斜面端的尖端流出，且两个连接处均无泄漏。

2. 麻醉动物的注射操作步骤

1. 手术准备
   1. 使用材料表中的程序对手术器械和用品进行灭菌。
   2. 如需定位深部脑结构，术前进行头部 MRI 扫描（图 2A）。
   3. 手术开始前，使用氯胺酮（10–15 mg/kg）对动物进行镇静，并通过肌肉注射给予抗生素（头孢唑林）和镇痛药（缓释型布托啡诺和美洛昔康）。随后通过隐静脉或头静脉的静脉导管给予丙泊酚。
   4. 对动物进行气管插管并转为异氟烷气体麻醉。通过稳定的心率、血压、呼吸频率、骨骼肌松弛以及无眼睑反射或回缩反射来确认麻醉效果充分。
   5. 剃除动物头部毛发。在角膜上涂抹人工泪膏以防止干燥。
2. 注射区域准备
   1. 将动物头部固定于立体定位仪框架中。使用纱布蘸取外科消毒液擦拭剃毛后的皮肤，轻压以清除任何碎屑，再用异丙醇冲洗。重复此过程三次。用无菌开窗洞巾覆盖动物。切开皮肤并分离肌肉。将操纵器安装至立体定位臂上，调整其位置以对准目标脑区，并使用灭菌笔在颅骨上标记开颅位置。
   2. 取下立体定位操纵器并进行开颅。如需要，切开硬脑膜（例如，以观察脑沟解剖标志）。随后将操纵器重新安装至立体定位臂上。
3. 病毒载体溶液装载（图 1C）
   1. 使用 P20 移液器将病毒载体溶液轻柔转移至灭菌的 PCR 管中，避免产生气泡。
   2. 将斜面朝下的套管连接至垂直放置的立体定位固定装置。将 1 mL 鲁尔锁注射器连接至套管的皮下针座。
   3. 将套管的斜面端浸入病毒载体溶液中。
      注意：注射器应已预先连接；若此时连接，会将气泡引入病毒载体溶液中。
   4. 使用 1 mL 注射器施加轻柔的负压，将溶液吸入套管中。通过肉眼观察溶液与空气之间的弯月面移动情况。
   5. 病毒载体溶液装载完成后，继续施加轻柔负压，直至溶液到达针座处。取下 1 mL 注射器，并向皮下针座中注入有色矿物油。
      注意：应沿针座内壁缓慢注入油，以在油与病毒载体溶液之间形成清晰的弯月面，并避免产生气泡。
   6. 将皮下针座连接至三通鲁尔锁止流阀的两个开放端口之一。
      注意：若将皮下针连接至关闭的端口，会在油后方引入不必要的气压。
   7. 关闭连接皮下针座的端口，用空气填充 1 mL 注射器，并将其连接至其余两个端口中的任意一个。最后关闭止流阀的剩余端口，使注射器与套管连通。
   8. 缓慢向套管内推入空气。当钝针 PTFE 管内的有色油出现时，检查溶液与有色油之间是否存在气泡。
   9. 若存在气泡，对注射器施加负压，使有色油退回针座内。移除气泡后施加正压，直至套管斜面端出现一滴病毒载体溶液。
   10. 取下 1 mL 注射器以释放油后方的多余气压，并关闭止流阀，防止病毒载体因重力作用从套管中流出。
   11. 将塑料尺用胶带固定在 PTFE 管上，用于测量注射过程中弯月面的移动（图 1B、D、F）。
4. 套管插入目标脑区（图 1B）
   1. 将套管固定于立体定位操纵器上。
   2. 由非无菌区助手手动将泵管（末端为鲁尔锁接头）传递给术者。术者应透过无菌套袖壁抓握鲁尔锁接头，将第二个无菌止流阀连接至接头，用胶带紧密缠绕固定，并放下套袖的领部，使其在重力作用下沿管路自然下垂。
   3. 将连接套管管路的止流阀与空气泵连接的止流阀对接。将空气泵设为低压，开启后逐渐增加压力，直至油推动通过套管，并在套管尖端可见一滴病毒载体溶液。
   4. 调整 PTFE 管上塑料尺的位置，以便测量注射过程中弯月面的移动。
   5. 使用立体定位操纵器将套管缓慢下放，记录其尖端接触表面（硬脑膜或软脑膜）时的深度。
   6. 将套管下放至注射轨迹中最深的注射位点。表面会出现凹陷。若注射表层皮质，应通过手术显微镜或放大镜目视确认套管已穿透表面。
   7. 为减少因组织压缩导致的定位偏差，可缓慢下放套管（1 mm/min），或快速下放（0.5 mm/s）并在最深处停留 1–5 分钟，或超过最深注射点 500 µm 后再回撤。
5. 注射
   1. 使用电动空气泵在 10–30 秒内注射 0.5 µL 病毒载体溶液。通过观察 PTFE 管中有色油与病毒载体溶液之间的弯月面移动来确认注射流速。
   2. 等待 1 分钟后，将套管回撤至轨迹中的下一个注射位点。
   3. 完成最后一次注射后，将套管留置原位 10 分钟，以防止病毒载体外流。
   4. 回撤套管，并将其丢弃至生物危害锐器容器中。
   5. 可选：在病毒载体注射位点附近注射少量荧光微珠（≤1 µL），以利于死后识别注射位点。
   6. 根据需要，在其他位置重复此操作以注射其他病毒载体溶液（图 2B）。
6. 手术关闭
   1. 缝合硬脑膜、肌肉和皮肤。
   2. 将猴从立体定位仪框架中取出，并移除所有监测电缆。
   3. 在吞咽反射恢复后，停止异氟烷麻醉并拔除气管插管。
   4. 提供术后治疗（美洛昔康 3–5 天，头孢氨苄 7–10 天）。至少每 10 分钟监测动物一次，直至其能够维持稳定的直坐姿势。

3. 清醒行为动物的手术及AAV载体注射（图1D）

注意：如以下所述，该技术的一种变体可用于对清醒且行为正常的猴子进行脑内注射。

1. 记录同时进行注射
   1. 为在注射位点记录电活动，将套管外侧用环氧树脂（底部约15 mm）和聚酰亚胺管（剩余长度）包裹。通过刮除套管尖端的环氧树脂暴露金属部分（Injectrode，图1F）²。或者，将套管与另一根独立的细胞外电极并排插入双通道引导管中（双通道引导管，图1E）。
2. 将套管插入目标脑区。
   1. 将猴子置于实验隔间内，固定其头部，并使用标准技术清洁颅骨上安装的记录室。
   2. 将引导管固定在微驱动装置上，将注射套管插入引导管中。
   3. 推进套管，直至其尖端从引导管中伸出。
   4. 将旋塞阀连接至电动气泵。使用气泵从尖端推出一滴载体溶液，观察油-载体溶液弯月面的移动，以确认系统功能正常。
   5. 将套管回撤约5 mm进入引导管内，以在引导管插入脑组织过程中保护套管尖端。随后将引导管插入脑内。
   6. 通过微驱动装置将套管推进至待注射位点。通过电生理记录（图2C）或刺激方法确定目标位点。

图 1：手术与装置设置。（A）注射套管。图中标识了套管的各个组成部分。右下角插图：套管尖端的放大图像，比例尺：500 µm。（B）麻醉状态下猴的手术设置。猴子被固定于立体定位仪中，并覆盖手术巾。呼吸机（V）、静脉输液管（IV）、血压监测仪（BP）和血氧饱和度监测仪（O₂）均连接至猴子。使用立体定位微操纵器将注射套管插入目标区域。通过与空气压缩机（左下角插图，蓝色）相连的电动气泵（左下角插图，棕色）注入载体溶液。在注射过程中，将塑料尺（顶部插图）粘贴至聚四氟乙烯（PTFE）管上，用于测量有色油（顶部插图，红色）与载体溶液（顶部插图，无色）之间弯月面的移动。（C）将载体溶液装入套管的装置设置。（D）猴子在实验隔间内接受载体溶液注射的情景。动物头部由三个稳定柱固定，眼球位置通过巩膜搜索线圈系统记录。使用微电极夹持器/驱动器固定并推进注射套管至目标深度。通过USB摄像头（插图）实时监测有色油与载体溶液之间的弯月面来控制注射过程。（E）双通道导管套管注射装置。双通道导管套管夹持器/驱动器同时固定注射套管和微电极（见插图）。（F）注射电极（Injectrode）。通过刮除环氧树脂涂层暴露套管尖端的金属部分，从而实现对神经元的电学记录（插图，比例尺：500 µm）。（G）激光刺激装置。双通道导管套管夹持器/驱动器同时固定一根光纤和一根微电极（见插图）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：AAV 注射位点示意图。（A）脑部 MRI 矢状切面图像，显示在食蟹猕猴（Macaca nemestrina）的初级运动皮层和初级视觉皮层中的注射位点。（B）对应图谱板的背侧视图，显示套管相对于中央沟（初级运动皮层）和初级视觉皮层的位置。（C）通过注射电极在上丘记录到的神经元放电活动。一个在注射前被分离出的神经元单位（右上图）在注射后消失（右下图）。（D）注射轨迹（白色箭头）。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 组织学用脑组织处理

1. 注射后等待 6-8 周，以最大化外源基因的表达。
   注意：最佳时间长度取决于实验中所使用的具体病毒载体。
2. 采用常规组织学技术处理脑组织，以评估转导效率和特异性^5,6,7。

结果

展示转基因表达 体内 使用此处所述手术注射方法向非人灵长类动物脑内进行立体定位注射，选取了两种载体，其含有可在不同神经元类型中驱动超级黄色荧光蛋白-2（SYFP2）表达的增强子^8,9病毒载体在 PHP.eB 衣壳中进行包装¹⁰，通过碘克沙醇离心纯化，然后浓缩至高滴度（>1E13 病毒基因组/mL），通过 qPCR 测定。沿皮层的十条轨迹，每条轨迹在十个不同深度各注射 0.5 µL，每条轨迹总注射体积为 5 µL。 图3A-C 通过在成年雄性小鼠初级视皮层注射PVALB亚类特异性AAV载体CN2045后113天，利用抗GFP免疫染色显示SYFP2表达 Macaca nemestrina在皮层各层中广泛分布的大量非锥体神经元可稳健检测到SYFP2转基因表达，且大多数表达SYFP2的神经元也对PVALB呈免疫阳性⁷. 图3D 显示在注射L5神经元亚类特异性AAV载体CN2251后64天，初级运动皮层中存在内源性SYFP2表达。所有SYFP2标记的神经元均具有清晰的锥体细胞形态，胞体局限于第5层，并具有典型的粗大顶树突。这些数据明确证明，通过立体定位注射细胞类型靶向的AAV载体，可在非人灵长类动物脑内新皮层神经元特定群体中实现转基因表达的精确调控。

图3：通过AAV载体注射到非人灵长类动物脑内介导的细胞类型特异性SYFP2表达示例。 （A）注射PVALB亚类特异性AAV载体后113天，恒河猴初级视皮层固定切片的落射荧光显微照片。比例尺：1 mm。（B,C）图A中框选区域的高倍放大图像。（B）抗GFP信号。（C）抗PVALB信号。比例尺：250 µm。（D）注射第5层投射至端脑外结构（extratelencephalic）亚类特异性AAV载体后64天，恒河猴初级运动皮层固定切片中天然SYFP2荧光的落射荧光显微照片。比例尺：500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了验证该注射技术在神经生理学和行为学光遗传学操控中的实用性，共进行了三项实验，每项实验使用一只不同的猕猴（Macaca mulatta）。在第一项实验中（图4A-D），将携带通道视紫红质-2转基因的腺相关病毒载体（AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry）注射至左侧上丘（SC）。注射在19个不同深度进行，每隔250 µm注射一次，总体积为12 µL。在第二项实验中（图4E-G），将3 µL的AAV1-hSyn-ArchT-EYFP溶液注射至脑桥被盖网状核（NRTP）。在第三项实验中（图4H-K），将24 µL的AAV9-L7-ChR2-mCherry溶液注射至小脑皮层⁶。每次注射后六至八周，通过双通道导管插入一根光纤和一根钨电极进入脑内（图1G）。

图4B 显示了一个SC神经元对蓝光（450 nm）的反应。在40 mW的连续光照（1.2 s）下，引发了一系列连续的动作电位（图4B，上图）。在40 mW时，持续1毫秒的光脉冲未能引发动作电位（图4B，中图），但在160 mW（唯一测试的其他功率水平）下可稳定引发动作电位，潜伏期为2.7 ± 0.6 ms（图4B，下图）。一串脉冲序列（160 mW，频率：300 Hz，占空比：15%，持续时间：300 ms）可一致地引发扫视眼动，平均潜伏期为97 ± 32 ms，平均幅度为10.4°，平均角度为47°（向上并向右；图4C）。

与通过丘脑下核（SC）亚阈值电刺激来调节眼跳增益的研究结果一致^11,12，在完成15°、18°和20°的向左下方（225°）眼跳后，对SC进行光刺激逐渐降低了眼跳增益（图4D）。增益的这种降低需要约250次试验（绿色圆圈）才能恢复至适应前的增益水平（黑色圆圈），证实其基于长期可塑性机制。

在第二次实验中（图4E），通过光学手段抑制了从后部网状核（NRTP）投射至小脑皮层眼动小叶（OMV）（小叶VIc和VII）的苔藓纤维投射。图4F 显示了在OMV中荧光标记的苔藓纤维及其终末膨大（插图）。将589 nm的黄色激光通过光纤传递至OMV，并使用邻近的钨电极记录浦肯野细胞的活动。图4G 展示了在光遗传学抑制NRTP投射之前（灰色）和之后（橙色）的简单峰电位活动（图4G，顶部）。在抑制前，该浦肯野细胞在12°向右扫视时表现出双峰爆发模式（图4G，中部，灰色）；而在抑制期间，其放电率下降，并转变为爆发-停顿模式（图4G，中部，橙色）。比较这两种反应模式表明，苔藓纤维对浦肯野细胞的输入通过驱动第二次爆发影响扫视的减速阶段（图4G，中部，绿色）。在光遗传学抑制期间，向右扫视的变异性降低，这与以下观点一致：扫视参数在试次间的一部分变异性来源于苔藓纤维所传递信号的变异性（图4G，底部，橙色）。

在第三次实验中（图4H），对OMV的小脑浦肯野细胞进行了光遗传学刺激（图4I）。一串短光脉冲（1.5毫秒脉冲，65毫瓦，50赫兹）增加了单个分离的浦肯野细胞的简单峰电位活动（图4J，上图）。单个1.5毫秒光脉冲常引发>1个简单峰电位（图4J，下图）。在眼跳期间进行光遗传学诱导的简单峰电位激活（10毫秒光脉冲，60毫瓦），可增加眼跳幅度（图4K），从而证实了浦肯野细胞对眼动爆发发生器具有去抑制作用。

图 4：在清醒猴中进行的三项光遗传学实验的总结。（A-D）实验 1，全神经元兴奋：在上丘进行病毒注射、激光刺激和单细胞记录（A）。（B）激光刺激诱发的代表性单细胞活动。（C）激光刺激诱发的眼动水平分量（上）和垂直分量（中），以及单细胞活动的点阵图（下）。（D）激光刺激诱导扫视适应的代表性实验会话。在每次扫视后 80 ms 施加刺激（100 次 0.5 ms 激光脉冲）（插图）。扫视增益（扫视幅度 / 目标幅度）在多次试验中逐渐降低。（E-G）实验 2，通路特异性抑制：将病毒载体注射至脑桥被盖网状核，激光刺激和单细胞记录在眼动小叶进行（E）。（F）眼动小叶的组织切片，显示标记的苔藓纤维（比例尺：1 mm）及其纤维末梢的玫瑰结结构（插图，比例尺：100 µm）。（G）浦肯野细胞活动（上：点阵图，中：平均放电率）以及有无激光刺激时视觉引导扫视的轨迹（下）。灰色：激光关闭试验，橙色：激光开启试验，绿色：灰色与橙色之间的差异。（H-K）实验 3，细胞类型特异性激活：在眼动小叶进行病毒注射、激光刺激和单细胞记录（H）。（I）眼动小叶的组织切片，显示标记的浦肯野细胞。比例尺：100 µm。（J）激光刺激诱发的浦肯野细胞简单峰电位活动。上图：14 次试验的点阵图。下图：一次代表性试验的电压轨迹。（K）有无激光刺激时视觉引导扫视的轨迹。扫视期间施加 10 ms 光脉冲可增加扫视幅度。激光开启试验中的单个扫视轨迹（青色）及其平均轨迹（蓝色）。激光关闭试验中的单个扫视轨迹（浅灰色）及其平均轨迹（深灰色）。实验 1 和实验 3 使用的光波长为 450 nm，实验 2 使用的光波长为 589 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

非人灵长类动物光遗传学技术的进步对精确、可靠的颅内注射方法提出了需求。本报告所述方法的优势在于成本低廉，使用可高温灭菌和一次性组件，并能够靶向任意深度的不同脑区。该方法还可通过调节空气阀门的控制速度，实现对注射速度和注射体积的精确控制。可通过短暂增加气压以清除堵塞，随后迅速降低压力，避免因持续加压导致的后续过量注射。一次性组件的使用降低了不同注射位点之间交叉污染的风险。

该注射方案的关键步骤包括制备高质量的导管、在装载过程中避免引入气泡，以及选择间距不过近的注射位点。通常情况下，相距≥1厘米的注射位点可转导非重叠区域，但该经验法则受病毒血清型、滴度、启动子、注射体积、靶标及检测方法的影响。选择不直接相连的注射位点，可避免视蛋白沿轴突运输以及轴突间传播倾向所带来的潜在干扰因素 某些AAV血清型可用于逆向转导。

该方法可用于在非人灵长类动物（NHP）麻醉状态下结合立体定位仪（图3）进行注射，也可在清醒且头部固定状态下进行注射（图4）。前者的优势在于可利用立体定位坐标精确靶向注射位点，并可通过急性硬脑膜切开术直观确认套管针的穿刺位置（在清醒猴中通过慢性颅骨开窗切开硬脑膜会增加感染风险）。后一种方法的优势在于减少了存活手术的次数，从而降低了动物的应激反应，同时可与行为过程中的电生理记录相兼容，并可使用与注射后实验中植入光纤所用的相同坐标系和仪器设备。在清醒猴中进行注射的技术还可通过使用人工硬脑膜进一步改进^13,14,15，这将带来额外优势，包括能够直接观察注射位点以及显示成功转导的组织荧光信号。

在非人灵长类动物（NHP）中已采用多种其他AAV注射技术。最近，已开发出一种多通道注射装置，可将AAV载体均匀递送至较大的NHP大脑皮层区域¹⁶。使用对流增强递送也可获得类似效果^17,18。这些方法旨在最大化转导范围，这是一个重要的目标 ，但与本方法所追求的空间精确性有所不同。

另一种替代方法是通过硼硅酸盐管注射AAV载体，该管一端研磨成尖锐的斜面，另一端连接至汉密尔顿注射器。^5,6该方法与本文所述方法具有诸多相似之处。病毒载体被置于一段导管中，导管内病毒后方的空间充满染色油，通过观察油-载体界面的移动来监测载体的流动情况。 弯月面。这种替代技术所需的设备和准备工作较少，但需要通过负压将油从斜面尖端吸入硼硅酸盐玻璃管中，并随后经由同一路径加载载体。这不可避免地会导致微量油被递送至脑组织。此外，根据我们的经验，硼硅酸盐玻璃管的直径需约为350 µm才能穿透硬脑膜，即使经过斜面处理，其造成的机械损伤仍大于本文所述的较细金属套管（图 2D使用30 G导管是因为其临界屈曲载荷足够高，能够实现硬脑膜穿透，即使长度在1–10 cm范围内也能保持稳定性，且与PTFE匹配 管路紧密且不易堵塞。33 G 管路 更容易堵塞和弯曲，且与PTFE管连接更困难。36 G管的刚性不足 穿透非人灵长类动物硬脑膜。

另一种替代注射技术是将气泵的输出端连接至装有载体的拉制玻璃微量移液管的尾部¹⁹。通过气泵提供的直接且间歇性的气压，将载体从移液管尖端推出，从而无需使用油介质。与上述单管法类似，弯月面与套管尖端之间不存在任何材料连接点，降低了泄漏风险。然而，玻璃移液管尖端的锐利锥形结构较为脆弱，无法穿透非人灵长类动物（NHP）的硬脑膜或靶向深层脑区结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>设备： 立体定位仪套装
<强>项目
内六角扳手	BONDHUS	10936	STERRAD
导管固定器	KOPF	1770	STERRAD
载体（操作器）	KOPF	1404	STERRAD
载体平台	KOPF	1430	NA
载体架	KOPF	1449	STERRAD
眼、耳、口部横杆	KOPF	1430	NA
立体定位基座	KOPF	1210	NA
<强>设备： 导管
<强>项目
1 mL 鲁尔锁式注射器	BD	309628	NA（已灭菌包装）
套管针*	（自制——见下文）	NA	蒸汽（高压灭菌器）
彩色油**	（自制——见下文）	NA	NA
试管架升降器	Cole-Parmer	UX-08057-10	STERRAD
滤尖	Genesee Scientific	23-404	NA（已灭菌包装）
荧光微珠	Lumafluor	R170	NA
P20 移液器	Gilson	FA10003M	NA
PCR管	奥林巴斯塑料公司	22-161	STERRAD
三通阀	Cole-Parmer	3060004	STERRAD
试管架	自制的	NA	STERRAD
载体溶液	（自制）	NA	NA
<强>设备： 电动空气泵套装
<强>项目
电动空气泵	World Precision Instruments	PV830	NA
脚踏板	World Precision Instruments	3260	NA
管盖	EZ Drape	A400-1000	NA（已灭菌包装）
<强>设备： 普通外科手术器械
<强>项目
烧杯	MEDLINE	azlon	STERRAD
毛刺	STRYKER	277-10-235	STERRAD
双头组织镊	Fine Science Tools	18067-11	STERRAD
铺巾	MEDLINE	DYNJP3004	NA（已灭菌包装）
持针器	Miltex	6-118	STERRAD
钻孔	STRYKER	Q9R-5400	NA
钻头	STRYKER	277-82-87	STERRAD
纱布	MEDLINE	NON26334	NA（已灭菌包装）
止血蚊式钳	Miltex	7-2, 7-4	STERRAD
光操控器	SKYTRON	Stellar XL	STERRAD
持针器	Miltex	8-2	STERRAD
骨膜剥离器	Miltex	18-1968	STERRAD
咬骨钳	Miltex	17-4800	STERRAD
生理盐水	BAXTER	2F7122	STERRAD
手术刀	巴德-帕克	372610	STERRAD
剪刀	Miltex	5-12, 5-114	STERRAD
Senn拉钩	Miltex	28065	STERRAD
无菌手套	MEDLINE	Triumph Micro	NA（已灭菌包装）
抽吸	medela	200-4869	NA
吸头	MEDLINE	DYNDFR12S	NA（已灭菌包装）
吸管	COVIDEN	8888301614	NA（已灭菌包装）
手术衣	MEDLINE	DYNJP2002S	NA（已灭菌包装）
外科手术笔 &和尺子	MEDLINE	DYNJSM03	NA（已灭菌包装）
缝合	COVIDEN	SL-635	NA（已灭菌包装）
组织镊	Miltex	6-114	STERRAD
毛巾钳	Miltex	7-504	STERRAD
木制拭子	MEDLINE	MDS202095	NA（已灭菌包装）
<强>设备： 套管针
<强>项目
皮下注射针头	EXELINT 国际公司	26437	NA（已灭菌包装）
不锈钢管	K-TUBE	K30R	NA
PTFE 管	ZEUS	216200	NA
<强>设备： 彩色油
<强>项目
液体蜡烛染料浓缩液	PremiumCraft	红色/粉红色	NA
矿物油	Vi-Jon	S0883	NA
	STERRAD：低温过氧化氢气体等离子体