通过真空辅助吸附剂提取从人类相关样品中捕获活性产生的微生物挥发性有机化合物

挥发性有机化合物（VOCs）在细菌检测和鉴定方面具有很大的前景，因为它们是从所有生物体中排放的，并且不同的微生物具有独特的VOC特征。挥发性分子已被用作检测各种呼吸道感染的非侵入性测量，包括慢性阻塞性肺病¹，尿^中的结核病²和呼吸机相关肺炎⁴，此外还区分囊性纤维化（CF）受试者和健康对照受试者^5，6。挥发性特征甚至已被用于区分CF中的特定病原体感染（金黄色葡萄球菌⁷，铜绿假单胞菌^8，9和金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌¹⁰）。然而，由于这种生物样品的复杂性，通常很难确定特定挥发性有机化合物的来源。

从多种感染微生物中分离挥发性特征的一种策略是对单培养和共培养¹¹中的微生物进行顶空分析。顶空分析检查排放到样品上方"顶空"中的分析物，而不是嵌入样品本身的分析物。微生物代谢物通常在单一培养物中表征，因为在复杂的临床样品中难以确定微生物代谢物的来源。通过分析来自细菌单培养物的挥发物，微生物 在体外 产生的挥发物类型可能代表其挥发性库的基线。结合细菌培养物， 例如，创建共培养物，并分析产生的挥发性分子可以揭示细菌¹²之间的相互作用或交叉喂养。

鉴定挥发性分子微生物来源的另一种策略是提供用稳定同位素标记的营养来源。稳定同位素是天然存在的，具有不同数量中子的原子的非放射性形式。自20世纪30年代初以来，一种用于追踪动物活性代谢的策略¹³中，微生物以标记的营养来源为食，并将稳定同位素纳入其代谢途径。最近，重水（D₂O）形式的稳定同位素已被用于鉴定临床CF痰液样本¹⁴中代谢活性的金黄色葡萄球菌。在另一个例子中，¹³个C标记的葡萄糖已被用于证明铜绿假单胞菌和Rothia mucilaginosa¹²的CF临床分离物之间代谢物的交叉喂养。

随着质谱技术的进步，检测挥发性线索的方法已经从定性观察转向更定量的测量。通过使用气相色谱质谱（GC-MS），大多数实验室或临床环境都能够处理生物样品。许多调查挥发性分子的方法已被用于分析样品，例如食品，细菌培养物和其他生物样品，以及空气和水以检测污染。然而，具有高通量的几种常见挥发性取样方法需要溶剂，并且不能以真空萃取提供的优点进行。此外，分析通常需要更大体积或数量（大于0.5 mL）的样品材料^{15，16，17，18，19}，尽管这是底物特异性的，需要针对每种样品类型和方法进行优化。

在这里，采用真空辅助吸附剂提取（VASE）然后在GC-MS上进行热解吸，以调查细菌单培养物和共培养物的挥发性分布，并鉴定来自人类粪便，唾液，污水和痰液样品的稳定同位素探测的活性挥发物（图1）。在样品量有限的情况下，从低至15μL的痰中提取VOCs。对人类样品的同位素探测实验需要添加稳定的同位素源，如 ¹³°C葡萄糖和培养基来培养微生物群落的生长。挥发物的活性生产被GC-MS确定为更重的分子。在静态真空下提取挥发性分子能够以更高的灵敏度检测挥发性分子^20，21，22。

1. 顶空吸附笔（HSP）和样品分析注意事项

注意:选择含有吸附剂Tenax TA的HSP是为了捕获各种挥发物。与其他吸附剂相比，Tenax对水的亲和力较低，这使其能够从高湿度样品中捕获更多的VOC。Tenax还具有低水平的杂质，可以调节以重复使用。在GC-MS中安装色谱柱时，还考虑了吸附剂的选择（参见 材料表）。

1. 通过提取具有与样品提取相同的条件提取培养基和/或样品空白来生成阴性对照。
2. 在分析提取的样品之前，在GC-MS上分析空白的HSP（先前确认为干净且没有显着的背景）。在样品类型之间运行空白（例如，细菌单次培养的三次重复，空白的细菌，细菌共培养的三次重复，空白等）。
3. 在样品提取和分析之前，限制使用芳香的个人护理用品或食用有气味的食物。理想情况下，在生物安全罩中制备样品，该罩子至少30分钟未被酒精或其他挥发性清洁剂清洁。在样品制备前，打开生物安全罩中的气流30-60分钟。
4. 将样品保存在冰上，以限制样品制备过程中的挥发性释放。

2. 单培养和共培养制备

1. 在生物安全罩中，在Todd Hewitt生长培养基中接种 鲍曼氏菌，金黄色葡萄球菌 和 铜绿假单胞菌 的培养物。在37°C下以200rpm搅拌孵育过夜。
2. 过夜孵育后，在生物安全罩中进行培养处理。在500nm处将每个培养物稀释至光密度0.05。
3. 将等份共培养物混合，并将200μL对照培养基，单孔或共培养物移液到96孔板的每个孔中，并置于37°C培养箱中24小时。准备第二个板进行48小时的孵育。
4. 在孵育期结束时，准备样品以进行第4节的提取。将液体培养物移液到微量离心管中并储存在-80°C。
   注意:此时，样品可以储存在-80°C，以便以后在需要时提取。

3. 生物样品制备中的稳定同位素探测

注意:粪便和唾液样本是由匿名捐赠者捐赠的，并得到加州大学欧文分校机构审查委员会（HS# 2017-3867）的批准。污水来自加利福尼亚州圣地亚哥。痰液样本是从囊性纤维化的受试者中收集的，作为密歇根大学医学院机构审查委员会（HUM00037056）批准的一项大型研究的一部分。

1. 在生物安全罩中执行所有生物样品制备。
   1. 为了制备粪便样品，在1.5 mL微量离心管中向100mg粪便中加入1mL去离子水并涡旋3分钟。不使用时放在冰上。
      1. 在15μL粪便和水混合物中，加入485μL脑心输注（BHI）培养基与20mM ¹³C葡萄糖，或BHI与30%氘（D₂O）。确保样品的最终体积为500μL，以技术三份制备样品。
   2. 为了制备污水样品，将500μL污水加入500μL BHI中，其中20mM ¹³C葡萄糖或BHI与30%D₂O，总体积为1mL。准备一式三份的样品。不使用时放在冰上。
   3. 为了制备唾液样品，将50μL唾液加入500μL BHI中，其中20mM ¹³C葡萄糖或BHI与30%D₂O，总体积为550μL。不使用时放在冰上。
   4. 为了制备痰液样品以比较培养前后样品中存在的挥发物，请用15μL痰进行第一次提取。准备一式三份的样品。不使用时放在冰上。进入第4部分进行样品提取，并在37°C下以200rpm搅拌提取18小时。
   5. 完成第一次提取未培养的痰液样本后，用痰保存小瓶。将500μL含有20mM ¹³C葡萄糖的BHI加入到痰液从3.5.1的小瓶中。不使用时放在冰上。
2. 继续第 4 部分进行样品提取。

4. 样品提取

1. 将空的挥发性有机分析（VOA）小瓶（20毫升）放在冷板上，并将冷板放在生物安全罩中的冰上。
2. 打开 5600 吸附笔提取装置 （SPEU），并根据每种方法的要求调整到所需的温度。
   注意:对于在37°C下的稳定同位素探测实验，达到设定点可能需要长达15分钟。对于70°C下的单培养和共培养实验，达到设定点可能需要长达60分钟。
3. 收集与制备的样品数量相等的干净 HSP，包括用于培养基或样品质控品的 HSP。
4. 根据需要根据样品、重复和 HSP ID 标记 20 mL VOA 样品瓶。使用抗水的标记，以防在冰上时小瓶外部形成冷凝。
5. 在生物安全罩内，拧下小瓶上的白色盖子，快速将样品移液到小瓶中，然后组装黑色盖子，盖子衬垫和HSP。
   注意:样品不应与HSP接触，样品量将取决于样品类型。
6. 将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。
7. 对每个样本重复步骤 4.5 和 4.6。对每个样品执行这些步骤，而不是一次全部执行，以防止样品升温，从而防止过早释放挥发性。
8. 一旦所有样品都在玻璃瓶中制备完毕，请在工作台上的生物安全罩外执行以下步骤。打开真空泵，将小瓶置于真空至30 mmHg的条件下，然后取出真空源。
   注意:真空应用完成后，小瓶不需要放在冷托盘上。
9. 使用压力表将所有样品置于真空下后，请仔细检查压力。如果小瓶有泄漏，请确保盖紧紧拧紧，并且HSP和盖子衬垫的白色O形圈正确到位。
   注意:与真空下的小瓶相比，密封受损会导致挥发性检测减少。
10. 将小瓶放入SPEU中以优化的时间和温度，并以200 rpm的速度搅拌。在70°C下提取培养1小时。 在37°C下用粪便，污水，唾液和痰液样品提取稳定同位素探测实验18小时。
11. 将冷板置于-80°C，以便在提取期完成后使用。
12. 提取完成后，将样品放在冷板上15分钟，以从HSP和小瓶顶部空间抽出水蒸气。
13. 将 HSP 转移到袖子上。
    注意:在室温下，实验可以在这里暂停长达约1周，然后从HSP中失去更高挥发性的化合物。

5. 在气相色谱-质谱仪（GC-MS）上分析样品

1. 使用以下 GC-MS（参见 材料表）设置:35 °C，保持 5 分钟，10 °C/min 斜坡至 170 °C，15 °C/min 斜坡至 230 °C，分流比为 20:1，总运行时间为 38 分钟。
2. 将解吸方法设定如下:2分钟，70°C预热;2分钟260°C解吸;34分钟，260°C烘烤;和2分钟，70°C后烘烤。
3. 设置样本序列，并根据检测开始运行。
   1. 要在Entech软件上设置序列，请打开该程序。在仪器下拉菜单右侧的选项中，选择 5800 |序列。
   2. 观察 Entech 软件中的序列表，类似于 GC-MS 软件中的序列表。根据"当前date_vial编号"命名"示例 ID"列。请记住，Name 类似于 GC-MS 序列表中的 Name，5800 Method 确定温度斜坡的速率、保持时间等（打开一个菜单以选择步骤 5.2 中生成的方法）。
   3. 请记住， 托盘 和 位置 列决定了样品制备导轨（SPR）将去哪里拾取HSP。
      1. 观察紧挨左侧各有30个斑点的两个托盘，布置为六列，每列有五个斑点。最左边和最靠近用户（前面）的托盘位置是位置 1，而最右边、最远的位置是位置 30。
      2. 请注意，这些托盘是 HSP A 或 B，其中 HSP B 是靠近 SPR（最内层托盘）的托盘，而 HSP B 后面的是 HSP 空白。将提取的样品放入托盘中，并相应地选择序列上的点。
   4. 保存序列表，选择左侧的" 运行 "，如果空白 HSP 位于解吸器中 （由黄色标签标记的 HSP 表示），则在解吸器中以空白开头。
4. 请注意，HSP将由SPR处理序列中的每个样品。让SPR预热，然后屏幕顶部会出现一条消息，以确认空白是否在解吸器中。单击" 跳过 "以确认触控笔已存在。允许SPR自动运行所有样品，GC-MS端的序列将自动将数据记录在单独的文件中。

6. 数据分析

1. GC-MS软件上的质量过滤器数据（材料表）。
   1. 查看色谱图上的每个峰，并注释与美国国家标准与技术研究院（NIST）库（或另一个可用库）匹配的峰。
   2. 将带注释的色谱图峰添加到处理方法中。设置选择峰的标准以包括概率大于75%的化合物，并确保化合物的每个识别离子的对齐位于峰的中心。
      1. 要向处理方法添加峰值，请选择校准|编辑复合|名称|在外部标准化合物下插入化合物。加上化合物的名称、保留时间、定量信号目标离子。添加三个最大的峰。要保存，请选择确定|方法|保存。
   3. 设置过程方法后，请继续定量 |计算和 查看|Q编辑定量结果。
   4. 检查每种化合物，以确保峰与其预期的保留时间一致，并且高于背景噪声。
   5. QEdit 完成后，选择" 退出|是的 ，保存 QEdits 并返回到主色谱图。通过打开左侧的文件导出区域集成。选择 定量|生成报告。
   6. 要导出文件以在 DExSI 中使用，请选择" 文件|将数据导出 为 AIA 格式|创建新目录，然后选择文件的位置或 "使用现有目录"。
   7. 观察打开的新窗口以选择要导出的文件。将文件移动到窗口的右侧，然后单击" 处理"。等待几秒钟到几分钟，具体取决于要转换的文件数。
2. 根据DExSI软件（https://github.com/DExSI/DExSI）的说明校正DExSI中的同位素丰度，并使用喜欢的软件或程序（例如R）进行分析。用于生成数字的脚本位于 https://github.com/joannlp/ VOC_SIP。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼氏菌的单一和共培养
单一培养和共培养物由细菌种类 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 和 鲍曼氏菌组成。这些是在人类伤口和慢性感染中发现的常见机会性病原体。为了鉴定单培养物和共培养物中存在的挥发性分子，在70°C下以200rpm搅拌进行短的1小时提取。从24小时和48 h时间点的单培养和共培养物中，检测到43个注释的挥发性分子（图2），其中包括醛，酮，醇，硫酸化合物，碳氢化合物，羧酸或酯以及芳烃。有少量挥发性分子仅在某些时间点在某些单一或共培养物中检测到。例如，仅在48小时的时间点在 金黄色葡萄球菌 培养物中检测到乙酰英和3-羟基-2-丁酮乙酸酯（图2）。

仅在铜绿假单胞 菌 和 鲍曼 氏菌共培养48小时时检测到挥发性1-丙醇2-甲基（图2）。乙酸乙酯在48小时时存在于 鲍曼氏杆菌 与 金黄色葡萄球菌 或 铜绿假单胞菌 共培养物中（图2）。代谢物庚烷，2，3-二甲基和戊烷，2-甲基仅在24小时时在 鲍曼氏 菌培养物中检测到（图2）。在24小时的时间点，乙醛和乙醇在鲍 曼氏金针 苜蓿和 金黄色葡萄球菌 共培养物中的相对丰度高于48 h和单独培养的任一菌株（图2）。在24小时或48小时的时间点，一些挥发物在培养物中更丰富。短链脂肪酸，包括乙酸，丁酸和丙酸，在48小时的培养物中相对丰度较高，但在24小时培养物中未检测到（图2）。与48小时相比，24小时TH对照中己烷的含量更高（图2）。

粪便、污水和唾液样本的稳定同位素标记
为了鉴定生物样品中挥发性分子的活性产生，添加了标记的营养来源，13C葡萄糖或D2O和培养基以支持微生物群落的生长。从粪便，污水和唾液样品的不同样品类型中分析一个独特的样品，一式三份。与氘掺入相比，13C掺入到完全标记的挥发性分子中（图3A-D）更多（图3E）。将13C掺入2-丁酮，3-羟基;2，3-丁二酮;乙酸;和所有粪便，污水和唾液样品的苯酚（图3A）。

在两种或一种样品类型中检测到其他标记的挥发物。例如，在唾液和污水中检测到丙酮，丁酸和丙酸标记（图3B）。标记的挥发物二甲基三硫化物和二硫化二甲基在粪便和唾液样品中均富集（图3C）。挥发物，1-丙醇，2-丁酮，二苯甲酮，乙醇和硫醇乙酸甲酯仅在污水中富集（图3D）。标记的挥发性2，3-戊烷酮在唾液中富集（图3D）。氘掺入挥发物中，乙酸;4-甲基苯甲醛;二甲基三硫醚;和苯酚，来自唾液或污水样本（图3E）。除了富含同位素的挥发物外，还检测到不含掺入稳定同位素的挥发物。例如，除吡嗪外，在粪便，污水和唾液样品中检测到吡嗪化合物，但未完全富集 13C（补充图S1）。

痰液样本的稳定同位素标记
实施稳定同位素标记策略，用于鉴定来自7名囊性纤维化人类受试者的痰液样本中活性产生的挥发物。将样品中的挥发物与使用稳定同位素标记培养的样品中产生的挥发物进行比较。对每个样品的每个挥发性成分进行两次分析:在用 13C葡萄糖和培养基探测稳定同位素之前和之后。从受试者身上采集的样本跨越三个不同的时间点或临床状态:基线、恶化和治疗23.与未培养痰液样本中未标记的挥发物相比，在培养的痰液样本中检测到的标记挥发物具有不同的相对丰度。在痰液的稳定同位素探测实验中的培养条件可能有利于某些微生物的生长，导致与未培养的痰液样本相比，挥发物的相对丰度存在差异。

例如，与未培养的痰液样品相比，培养的痰液样品中的乙酸，二甲基三硫化物，丙酮和丙醛，2-甲基的含量更高（图4）。检测 13种C标记的乙醇，其可以以可变量存在于背景室空气中，提供证据表明乙醇是由 13C葡萄糖的微生物代谢积极产生的。变异量由受试者解释，通过排列多元方差分析（PERMANOVA）评估，并且对于两个不同的易失性数据集也是不同的（表1 和 补充图S2）。对于 13个C标记的培养痰，51%的变化由受试者解释，而33%的变化由受试者从未培养的痰液样本中的挥发物中解释（表1）。通过7个受试者的16S rRNA扩增子测序确定的微生物组群组成对于每个受试者都是独一无二的（补充图S3），并且个体特征也反映在检测到的培养和未培养的痰挥发性分子中。

在培养的痰中，检测到23种挥发物，这些挥发物完全标有 13种碳。从痰液样本中检测到的富含同位素（活性）的挥发物对于每个受试者都是不同的。在所有7个受试者的痰液中检测到的同位素富集的挥发物为2，3-丁二酮;乙酸;丙酮;二甲基三硫醚;二硫化物，二甲基;和吡嗪，2，5-二甲基（图5）。虽然在所有受试者中都检测到这些挥发物，但每个受试者的同位素富集各不相同。与其他六名受试者相比，受试者7的样品具有更高的二硫化物二甲基同位素富集率（图5B）。丙酮在受试者4和6中更高（图5）。一些挥发物仅在某些受试者中富含 13C。例如，1-丁醇，3-甲基和丙酸，2-甲基仅在受试者2的样品子集中富集（图5）。除了富含同位素的挥发物外，还有来自同一培养的痰液中未标记的挥发物（补充图S4）。挥发物2-哌啶酮;4-甲基苯甲醛;苯并噻唑;3-甲基丁酸;己醛;己烷;异丙醇;苯酚;2-甲基丙酸;在痰液样品中检测到吡咯1，2-吡嗪-1，4-二酮，六氢，但未富集同位素（补充图S4）。

图1:协议原理图。 将生物样品放入玻璃小瓶中，并与盖子衬垫和顶空吸附笔组装。对小瓶施加真空，直到达到约30 mmHg的压力。取出真空源，并将小瓶放置在吸附剂笔式提取单元中，在加热，搅拌和时间的帮助下进行静态提取。提取后，将小瓶放在冷金属块上以从顶空和HSP中除去水。收集 HSP 并通过 GC-MS 上的热解吸运行。数据用ChemStation，DExSI和R.缩写:HSP = Headspace Sorbent Pen;GC-MS = 气相色谱-质谱。 请点击此处查看此图的大图。

图2:单一培养和共培养的热图。在 24 小时和 48 小时时间点从单培养和共培养物中检测到 VOC。共培养物是代表每种菌株的字母的组合。将所有样品在70°C下以200rpm搅拌提取1小时。热图强度值是列 Z 分数，由代谢物归一化。Z 得分的计算方法是:值与平均值的差值除以值的标准差。树状图是使用 R 的 pheatmap 函数中的 cluster_cols 选项生成的。树状图表示分层聚类，其中聚类在一起的代谢物在样本中具有更相似的Z评分。缩写: A = A. baumanii;P = 铜绿假单胞菌;S = 金黄色葡萄球菌; TH = 托德·休伊特媒体（控制）。请点击此处查看此图的大图。

图3:在同时孵育和提取的18小时内，粪便，唾液和污水样品中 13C转化为挥发性分子的百分比。 通过取完全标记化合物的质量（M + N）并将其除以（M + N）+未标记挥发性质量（M）的质量来计算完全标记化合物的%转化率，其中N是每个挥发性分子中可以标记的可能碳（在 A-D中）或氢（在 E中）的最大数量。当挥发性的所有碳被 13C取代时，化合物被认为是完全标记的。如果缺少数据，则不会检测到易失性。例如，在（D）中，在粪便或唾液样品中未检测到1-丙醇。每个样品的重复次数 = 3。（A） 在所有样本类型（粪便、唾液及污水）检出 的13种C标记挥发物。（二） 13种C标记挥发物仅在唾液和污水样本中检出。（C） 在粪便和唾液样本中检出 的13种C标记挥发物。（D） 在三种不同样品类型之一中检测到的 13种C标记挥发物。（E）氘标记的挥发性分子。 请点击此处查看此图的大图。

图4:来自培养痰的 13种C标记挥发物和从未培养的痰中检测到的挥发性分子的热图。 标记的挥发物来自稳定同位素探测实验，其中在提取步骤中将 13C葡萄糖和脑心输注培养基添加到痰中，以培养微生物生长并捕获活性挥发性产生。直接从痰液样品中检测到未标记的挥发性分子。热图强度是 Z 分数，如图 2 的标题中所述。然而，在每个实验中计算培养和未培养的痰液实验的Z评分。树状图如图 2所示生成。 请点击此处查看此图的大图。

图5:在同时孵育和提取的18小时内，来自七名囊性纤维化的受试者的痰液样品中 13C转化为挥发性分子的百分比。 转换率的计算方法如图 3 的标题中所述。样品中未检测到的挥发性表现为缺乏数据。N = 1-3。（A）在大多数痰液样本中以较高的转化率检测到 13种C标记挥发物。（B）在大多数痰液样本中以较低的转化率检测到 13种C标记的挥发物。（C）在少数痰液样本中以较低的转化率检测到 13种C标记的挥发物。缩写:B = 基线;E =恶化;T = 治疗。 请点击此处查看此图的大图。

表1:痰液样本方差（PERMANOVA）的排列多变量分析。 PERMANOVA是使用R中素食包装中的adonis函数生成的。

补充图S1:粪便，唾液和污水样品中标记（M + N（最大））和未标记（M + 0）挥发物的相对丰度。请点击此处下载此文件。

补充图 S2:培养痰的非公制多维缩放，具有稳定同位素探测和未培养的痰。 （A）以k=3维生成 13C葡萄糖和培养基培养痰的NMDS。应力值为 0.07。（B）未培养痰的NMDS在k=3维时产生。应力值为 0.13。缩写:NMDS = 非度量多维缩放;B = 基线;E =恶化;T = 治疗。 请点击此处下载此文件。

补充图S3:囊性纤维化受试者痰液样本的微生物群落组成。 通过16S rRNA扩增子测序作为更大研究的一部分进行评估，有关Carmody等人发现的方法的进一步信息 202019.来自囊性纤维化的受试者。每个堆叠条形图是不同的时间点。缩写:B =基线，E =恶化，T =治疗。 请点击此处下载此文件。

补充图S4:来自七个囊性纤维化受试者的痰液样本中标记（M + N（最大））和未标记（M + 0）挥发物的相对丰度。请点击此处下载此文件。

V. L. V和S. J.B. D.是Entech Instruments Inc.的前雇员，K. W.是Entech大学计划的成员。J. P.、J. K. 和 C. I. R. 没有利益冲突需要声明。