通过真空辅助吸附剂提取从人类相关样品中捕获活性产生的微生物挥发性有机化合物

Summary

该协议描述了使用真空辅助吸附剂提取方法从生物样品中提取挥发性有机化合物，使用Entech样品制备导轨进行气相色谱结合质谱分析以及数据分析。它还描述了生物样品的培养和稳定同位素探测。

Abstract

来自生物样品的挥发性有机化合物（VOC）来源不明。挥发性有机化合物可能来自宿主或宿主微生物群落内的不同生物体。为了解开微生物VOC的起源，对 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 和 鲍曼不动杆菌的细菌单培养物和共培养物进行了挥发性顶空分析，并在粪便、唾液、污水和痰液的生物样品中进行了稳定同位素探测。单培养和共培养用于鉴定单个细菌物种的挥发性产生，或与稳定同位素探测结合使用，以鉴定生物样品中微生物的活性代谢。

采用真空辅助吸附剂萃取（VASE）提取VOCs。VASE是一种易于使用，商业化，无溶剂的顶空提取方法，用于半挥发性和挥发性化合物。与其他提取选项（如 叔丁基化和固相微萃取）相比，提取过程中使用的溶剂和近真空条件使得开发方法相对容易和快速。此处描述的工作流程用于识别来自单一培养和共培养物的特定易失性特征。此外，对人类相关生物样品的稳定同位素探测的分析确定了通常或独特生产的VOC。本文结合活性微生物培养物的稳定同位素探测，提出了VASTE的一般工作流程和实验注意事项。

Introduction

挥发性有机化合物（VOCs）在细菌检测和鉴定方面具有很大的前景，因为它们是从所有生物体中排放的，并且不同的微生物具有独特的VOC特征。挥发性分子已被用作检测各种呼吸道感染的非侵入性测量，包括慢性阻塞性肺病¹，尿^中的结核病²和呼吸机相关肺炎⁴，此外还区分囊性纤维化（CF）受试者和健康对照受试者^5，6。挥发性特征甚至已被用于区分CF中的特定病原体感染（金黄色葡萄球菌⁷，铜绿假单胞菌^8，9和金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌¹⁰）。然而，由于这种生物样品的复杂性，通常很难确定特定挥发性有机化合物的来源。

从多种感染微生物中分离挥发性特征的一种策略是对单培养和共培养¹¹中的微生物进行顶空分析。顶空分析检查排放到样品上方"顶空"中的分析物，而不是嵌入样品本身的....

Protocol

1. 顶空吸附笔（HSP）和样品分析注意事项

注意:选择含有吸附剂Tenax TA的HSP是为了捕获各种挥发物。与其他吸附剂相比，Tenax对水的亲和力较低，这使其能够从高湿度样品中捕获更多的VOC。Tenax还具有低水平的杂质，可以调节以重复使用。在GC-MS中安装色谱柱时，还考虑了吸附剂的选择（参见 材料表）。

1. 通过提取具有与样品提取相同的条件提取培养基和/或样品空白来生成阴性对照。
2. 在分析提取的样品之前，在GC-MS上分析空白的HSP（先前确认为干净且没有显着的背景）。在样品类型之间运行空白（例如，细菌单次培养的三次重复，空白的细菌，细菌共培养的三次重复，空白等）。
3. 在样品提取和分析之前，限制使用芳香的个人护理用品或食用有气味的食物。理想情况下，在生物安全罩中制备样品，该罩子至少30分钟未被酒精或其他挥发性清洁剂清洁。在样品制备前，打开生物安全罩中的气流30-60分钟。
4. 将样品保存在冰上，以限制样品制备过程中的挥发性释放。

2. 单培养和共培养制备

1. 在生物安全罩中，在Todd Hewitt生长培养基中接种 鲍曼氏菌，金黄色葡萄球菌 和 铜绿假单胞菌 的培养物。在37°C下以200rpm搅拌孵育过夜。

Results

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼氏菌的单一和共培养
单一培养和共培养物由细菌种类 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 和 鲍曼氏菌组成。这些是在人类伤口和慢性感染中发现的常见机会性病原体。为了鉴定单培养物和共培养物中存在的挥发性分子，在70°C下以200rpm搅拌进行短的1小时提取。从24小时和48 h时间点的单培养和共培养物中，检测到43个注释的挥发性分子（图2），其中包括醛，酮，醇，硫酸化合物，碳氢化合物，羧酸或酯以及芳烃。有少量挥发性分子仅在某些时间点在某些单一或共培养物中检测到。例如，仅在48小时的时间点在 金黄色葡萄球菌 培养物中检测到乙酰英和3-羟基-2-丁酮乙酸酯（图2）。

Discussion

为了鉴定 体外 培养物和人相关样品中的挥发性产生，对 铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌 和 鲍曼氏 菌的单培养物和共培养物进行挥发性分析，并对不同生物样品进行稳定同位素探测。在单培养和共培养物的分析中，通过在70°C下进行短萃取1小时来检测挥发物。 对单一培养和共培养物的挥发性分析允许对单个物种及其与其他物种相互作用期间产生的化合物进行调查。不同文化类型和时间点的相对丰度存在差异。在稳定同位素探测实验中，生物样本包括健康受试者的粪便和唾液，污水和囊性纤维化受试者的痰液。稳定同位素分析通过在37°C下提取18小时来鉴定活性产生的挥发性分子。 在较低温度下的长提取时间使生物样品中存在的微生物的生长和代谢成为可能。比较 ¹³C葡萄糖和D₂O富集表明，标记的 ¹³C存在更广泛的同位素富集。

提取不同的样品类型时，在开始全面运行之前会采取初始优化步骤。首先，测试不同体积的样品作为试运行。对于某些样本类型，例如痰液，只有少量样本量可用。建议先从较低体积或较少量的样品开始，具体取决.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C 葡萄糖	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Diaph Pump	Entech Instruments	01-10-20030
20 mL VOA 样品瓶	Fisher Scientific	5719110
24 mm 黑色瓶盖，带孔，无隔垫	Entech Instruments	01-39-76044B	将盖子衬垫固定在样品瓶
24 mm 样品瓶衬垫上，用于吸附剂笔	Entech Instruments	SP-L024S	允许笔在小瓶顶部进行真空密封
5600 吸附笔提取装置 （SPEU）	Entech Instruments	5600-SPES	5600 吸附笔提取装置 -120 VAC
96 孔检测板	Genesee	25-224
脑心输液 （BHI） 介质	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Agilent
DB-624 色谱柱	Agilent	122-1364E	60 m，内径 0.25 mm，膜厚 1.40 μm，气相色谱-质谱仪
氧化氘	Sigma-Aldrich	151882-1L
Dexsi 软件	Dexsi（开源）
GC-MS（7890A 气相色谱仪和 5975C 惰性 XL MSD，带三轴检测器）	Agilent		7890A 气相色谱仪和 5975C 三轴惰性 XL MSD探测器
顶空套装 HS-B01,120VA	Entech Instruments	SP-HS-B01	中包含的用于运行顶空萃取的物品
- 空白	Entech Instruments	SP-HS-0
顶空吸附笔 （HSP） Tenax TA（35/60 目）	Entech Instruments	SP-HS-T3560
微量离心管 （2 mL）	VWR	53550-792
O 形圈	Entech Instruments	SP-OR-L024
样品制备导轨	Entech Instruments
吸附笔 热调节器	Entech Instruments	3801-SPTC
Todd Hewitt （TH） 媒体	Sigma	T1438-500G