本方案描述了使用Entech样品前处理平台，通过真空辅助吸附萃取法从生物样品中提取挥发性有机化合物，并结合气相色谱-质谱联用技术进行检测及数据分析的方法。同时，本方案还介绍了生物样品的培养以及稳定同位素探针技术的应用。
本方案描述了使用Entech样品前处理平台，通过真空辅助吸附萃取法从生物样品中提取挥发性有机化合物，并结合气相色谱-质谱联用技术进行检测及数据分析的方法。同时，本方案还介绍了生物样品的培养以及稳定同位素探针技术的应用。
生物样本中的挥发性有机化合物（VOCs）来源尚不明确。这些VOCs可能来源于宿主本身，也可能来源于宿主微生物群落中的不同生物体。为了厘清微生物来源的挥发性有机化合物的起源，需对细菌的单一培养及共培养体系进行顶空气相分析 金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 和 鲍曼不动杆菌对粪便、唾液、污水和痰液等生物样本进行了单培养和共培养，并结合稳定同位素探针技术，以鉴定单个细菌物种产生的挥发性物质，或通过稳定同位素探针技术识别生物样本中微生物的活跃代谢活动。
采用真空辅助吸附剂萃取法（Vacuum-assisted sorbent extraction, VASE）对挥发性有机化合物（VOCs）进行萃取。VASE 是一种易于使用、已实现商业化、无需溶剂的顶空萃取方法，适用于半挥发性和挥发性化合物。由于萃取过程中无需溶剂且采用近真空条件，与其它萃取方法相比，方法开发相对简便且快速，例如 叔丁基丁基化与固相微萃取。本文所述工作流程用于鉴定单一种类培养与共培养体系中的特异性挥发性特征物质。此外，通过对人体相关生物样本进行稳定同位素探针分析，鉴定出共有的或特异产生的挥发性有机化合物（VOCs）。本文介绍了挥发性代谢物分析（VASE）与活体微生物培养物稳定同位素探针技术联用的通用工作流程及实验注意事项。
挥发性有机化合物（VOCs）在细菌检测与鉴定方面具有巨大潜力，因为所有生物体均会释放挥发性有机物，而不同微生物具有独特的挥发性有机物特征。挥发性分子已被用作非侵入性检测手段，用于识别多种呼吸道感染，包括慢性阻塞性肺疾病1、结核病2（通过尿液检测3）以及呼吸机相关性肺炎4，此外还可用于区分囊性纤维化（CF）患者与健康对照者5,6。挥发性特征甚至已被用于区分囊性纤维化患者中特定病原体的感染（如Staphylococcus aureus7、Pseudomonas aeruginosa8,9，以及S. aureus与P. aeruginosa的鉴别10）。然而，由于此类生物样本成分复杂，通常难以精确定位特定挥发性有机物的来源。
分离多种感染性微生物挥发性特征的一种策略是对微生物在单培养和共培养条件下....
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1. 顶空固相萃取笔（HSP）及样品分析注意事项
注意：选择含有Tenax TA吸附剂的HSP，以捕获广泛范围的挥发性物质。与其他吸附剂相比，Tenax对水的亲和力较低，因此能够从含水量较高的样品中捕获更多的挥发性有机化合物（VOCs）。Tenax的杂质含量也较低，并可进行活化处理以便重复使用。吸附剂的选择还考虑了气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）中所安装的色谱柱（参见材料表）。
2. 单一培养与共培养的制备
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单培养与共培养 S. aureus, P. aeruginosa，以及 A. baumannii
单培养和共培养由以下细菌物种组成 金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 和 A. baumannii这些是常见的人类伤口及慢性感染中的机会性病原体。为鉴定单培养和共培养体系中存在的挥发性分子，采用200 rpm振荡、70 °C短时萃取1小时的方法进行提取。在24小时和48小时时间点的单培养和共培养样本中，共检测到43种已注释的挥发性分子（图2包括醛类、酮类、醇类、含硫化合物、烃类、羧酸或酯类以及芳香族化合物。有少量挥发性分子仅在特定时间点的某些单培养或共培养体系中被检测到。例如，乙偶姻和3-羟基-2-丁酮乙酸酯仅在 S. aureus 48小时时间点的培养物（
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为了鉴定体外培养物和人体相关样本中的挥发性物质产生情况，对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的单培养与共培养体系进行了挥发性物质分析，并对不同生物样本开展了稳定同位素示踪研究。在单培养与共培养的分析中，通过在70 °C下进行1小时的短时间提取来检测挥发性物质。该挥发性物质分析使得能够系统调查各单一菌种及其相互作用过程中产生的化合物。不同培养类型和时间点之间的相对丰度存在差异。在稳定同位素示踪实验中，所用生物样本包括健康个体的粪便和唾液、污水以及囊性纤维化患者痰液。通过在37 °C下进行18小时的提取，稳定同位素分析可识别出微生物活跃生成的挥发性分子。较长的提取时间结合较低的温度有利于生物样本中微生物的生长和代谢。比较13C标记葡萄糖与D2O的同位素富集情况发现，使用13C标记物时同位素富集更为显著。
在提取不同类型样品时，正式开展完整实验前需进行初步优化。首先，应以不同样品体积.......
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V. L. V 和 S. J. B. D. 曾是 Entech Instruments Inc. 的前员工，K. W. 是 Entech 大学项目的成员。J. P.、J. K. 和 C. I. R. 无任何利益冲突需要声明。
感谢Heather Maughan和Linda M. Kalikin对本文手稿的细致编辑。本研究由美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NIH NHLBI）资助（项目编号：5R01HL136647-04）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 13C 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph 泵 | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA 小瓶 | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 带孔 24 mm 黑色瓶盖（无隔垫） | Entech Instruments | 01-39-76044B | 用于固定小瓶上的衬垫 |
| 用于吸附笔的 24 mm 小瓶衬垫 | Entech Instruments | SP-L024S | 使吸附笔可在小瓶顶部形成真空密封 |
| 5600 吸附笔萃取单元（SPEU） | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 吸附笔萃取单元 -120 VAC |
| 96 孔检测板 | Genesee | 25-224 | |
| 脑心浸液（BHI）培养基 | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 色谱柱 | Agilent | 122-1364E | 60 m，0.25 mm 内径，1.40 微米膜厚，用于气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） |
| 重水 | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi 软件 | Dexsi（开源） | ||
| 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（7890A 气相色谱仪和带三轴检测器的 5975C 惰性 XL 质谱检测器） | Agilent | 7890A 气相色谱仪和带三轴检测器的 5975C 惰性 XL 质谱检测器 | |
| 顶空采样套装 HS-B01，120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | 套装中包含用于顶空萃取的组件 |
| 顶空吸附笔（HSP）- 空白 | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| 顶空吸附笔（HSP）Tenax TA（35/60 目） | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| 微量离心管（2 mL） | VWR | 53550-792 | |
| O 型圈 | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| 样品制备轨道 | Entech Instruments | ||
| 吸附笔热调节器 | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt（TH）培养基 | Sigma | T1438-500G |
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