利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

摘要

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA 双链断裂末端的切除过程。

摘要

DNA损伤应答（DDR）的研究是一个复杂且至关重要的领域，随着DDR靶向药物在癌症治疗中的应用，其重要性日益凸显。其中的靶点之一是多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs），该酶可启动多种DNA修复途径。通过使用PARP抑制剂（PARPi）抑制这些酶，可在因乳腺癌1型（BRCA1）、BRCA2或BRCA2的伴侣与定位蛋白（PALB2）发生突变而导致同源重组（HR）缺陷的细胞中产生合成致死效应，从而带来治疗上的脆弱性。

经PARP抑制剂（PARPi）处理的细胞会积累DNA双链断裂（DSBs）。这些断裂由DNA末端切除机制进行加工，导致单链（ss）DNA的形成，进而启动DNA修复。在BRCA1缺陷的背景下，通过突变DNA切除抑制因子（如53BP1和DYNLL1）重新激活DNA切除过程，会导致细胞对PARPi产生耐药性。因此，能够在细胞内（in cellulo）监测DNA切除对于更清晰地理解DNA修复通路以及开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光（IF）的技术可用于在DNA损伤后监测全基因组范围的DNA切除情况。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）对基因组DNA进行长时间脉冲标记。在DNA损伤及DNA末端切除发生后，所生成的单链DNA可在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外，还可结合细胞周期标志物来研究DNA切除，以区分细胞周期的不同阶段。处于S/G2期的细胞可用于研究同源重组（HR）过程中的末端切除，而G1期细胞则可用于研究非同源末端连接（NHEJ）。本文详细描述了该IF方法与细胞周期区分相结合的实验方案。

引言

DNA修复因子的调控是癌症治疗中一种不断发展的方法，尤其适用于DNA双链断裂（DSB）修复缺陷的肿瘤环境。抑制特定的修复因子是一种巧妙的策略，可使癌细胞对DNA损伤剂更加敏感。数十年的研究已发现多种DNA修复基因的突变可作为治疗策略选择的生物标志物¹。因此，DNA修复领域已成为药物开发的中心，旨在提供广泛的治疗方案，推动个体化医学的发展。

DSB 通过两条主要途径进行修复：NHEJ 和 HR²。NHEJ 途径具有易错性，能够快速连接两个 DNA 末端，几乎不进行 DNA 末端加工，该过程涉及蛋白激酶（DNA-PKcs）、Ku70/80 复合物、53BP1 和 RIF1 蛋白³。相比之下，HR 是一种精确的修复机制，由 BRCA1 启动⁴。HR 修复中的一个关键步骤是 DNA 末端切除过程，即断裂末端被降解，产生具有 3'-OH 末端的单链（ss）DNA。BRCA1 促进下游蛋白的招募，形成参与 5' 到 3' 方向 DNA 切除的切除体复合物 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1⁵。

初始的末端切除通过MRE11的核酸内切酶活性完成，从而允许DNA2和EXO1核酸酶进一步加工。生....

方案

1. 细胞培养、处理及盖玻片制备

注意：除照射外，所有细胞接种、转染和处理均应在无菌细胞培养罩内进行。

1. 第1天
   1. 在6孔板中，根据所需条件数量，每孔放置一个盖玻片。按需接种约150,000个HeLa细胞用于转染或药物处理。
      注意：若进行转染，建议在接种时进行反向转染，或在接种数小时后进行正向转染以允许细胞贴壁。反向转染是指在加入细胞前先将转染混合物加至盖玻片上，从而使转染在细胞开始贴壁前即启动。相比之下，正向转染则是在细胞贴壁后（通常在次日）加入转染混合物。然而，只要给予足够时间使细胞贴壁，也可在同一天内完成正向转染。
   2. 本方法使用4个孔：第1孔：siRNA对照（称为siCTRL）；第2孔：靶向PARP-1的siRNA（siPARP-1）；第3孔：未处理组；第4孔：在照射前1小时用5 µM BMN673处理的细胞。
      注意：在本实验方案中，所有测试均在照射条件下进行（见第1.3节）。
   3. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中过夜培养；尽管转染方案允许最长3天的培养时间。在BrdU处理前的培养时间取决于siRNA转染效率。若未进行转染，培养16小时已足够使细胞贴附于盖玻片并有一定生长。
      注意：培养箱条件可根据所用细胞系进行调整。
2. 第2天
   1. 在适当的....

结果

在本实验方案中，采用基于溴脱氧尿苷（BrdU）的检测方法，定量测定HeLa细胞对辐射诱导损伤的切除反应。经免疫荧光染色后，生成的单链DNA（ssDNA）轨迹表现为明显的焦点结构（图1A）。随后对识别出的焦点进行定量分析，并以细胞核内BrdU染色的总整合强度表示（图1B、补充图S1、补充图S2和补充图S3）。虽然也可测量焦点数量或平均焦点强度，但由于BrdU焦点的大小存在变异性，其可靠性通常低于总核强度。

为了区分由NHEJ导致的短片段切除与HR介导的长片段切除，使用抗PCNA抗体进行共染色，以鉴定处于S期的细胞（图1 和 补充图S4）。PCNA构成DNA滑动夹，作为DNA聚合酶的持续性因子，在DNA复制过程中至关重要。PCNA在细胞核中显著存在，并在细胞周期的S期达到最高表达水平。因此，在S期早期，PCN.......

讨论

本文介绍了一种利用免疫荧光染色（IF）在细胞内（in cellulo）检测DNA末端切除变化的方法。目前观察DNA切除效应的标准方法是通过RPA染色；然而，这是一种间接方法，可能受到DNA复制的干扰。此前已有基于BrdU掺入的DNA切除免疫荧光技术，用于对BrdU阳性与BrdU阴性细胞中的信号强度进行分类。但该方法可能因背景信号或线粒体染色导致非同源重组（HR）进行中的细胞被误判为阳性，从而产生较高的BrdU信号强度^14,15,16。本文所述方法的主要创新之处在于引入了PCNA染色，从而可特异性选择细胞周期的S期和G2期细胞，确保所检测到的BrdU信号源于DNA末端切除，进而反映同源定向修复过程。

本方案的关键步骤是预提取；若省略此步骤，BrdU 焦点将不可见，而操作不当则会导致细胞完全脱落。缓冲液配制不当会导致预提取不充分，例如细胞骨架部分残留或背景信号增强。必须严格控制在预提.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa 568 山羊抗兔	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Molecular probes	A11001	1:800
抗 PARP1 (F1-23)	自制		1:2500
抗 PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
抗 α-微管蛋白 (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
抗 BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
台式X射线辐照仪	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
溴脱氧尿苷 (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M 实验室封口膜 4英寸 / 250英尺	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM 高糖	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
胎牛血清	Gibco	12483-020
Fisherbrand 盖玻片：22 x 22 平方形	Fisher scientific	12 541B
荧光显微镜	Leica	DMI6000B	63x 浸油物镜
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 培养箱 CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
针头
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA 对照	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750-100G
蔗糖	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
镊子