该实验利用小鼠胚胎干细胞分化形成的类胚体，将其培养在三维胶原凝胶中，以在体外分析调控出芽型血管生成的生物学过程。in vitro。该技术可用于药物测试、疾病建模，以及研究在胚胎致死性缺失背景下特定基因的功能。
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本文内容
摘要
摘要
诱导多能干细胞（iPSC）和基因编辑技术的最新进展推动了基于人类细胞的新型疾病模型的发展，为表型药物发现（PDD）项目提供了有力支持。尽管这些新型模型能够更准确地预测研究性药物在人体中的安全性和有效性，但其向临床转化仍高度依赖哺乳动物数据，尤其是小鼠疾病模型的应用。与此同时，除人类类器官或器官芯片疾病模型外，相关模型的开发也正在推进 体外 因此，小鼠模型在评估跨物种间药物直接疗效和安全性比较方面仍存在未满足的需求 体内 和 体外 条件。本文描述了一种利用小鼠胚胎干细胞分化为类胚体（EBs）的血管出芽检测方法。将具有血管化的EBs培养于三维胶原凝胶中，可形成延伸扩展的新血管，该过程称为出芽性血管生成。该模型重现了 体内 出芽性血管生成——即从已存在的血管网络形成新血管的过程，包括内皮尖端细胞的选择、内皮细胞的迁移与增殖、细胞导向、管状结构形成以及壁细胞的招募。该模型适用于筛选调控血管生成的药物和基因，且与近期报道的基于人诱导多能干细胞（iPSC）技术的三维（3D）血管检测方法具有相似性。
引言
在过去三十年中，基于靶点的药物发现（TDD）已被制药行业广泛应用于新药研发。TDD 依赖于一个在疾病中起关键作用的明确分子靶点，并采用相对简单的细胞培养系统和药物筛选检测方法1。TDD 项目中常用的典型疾病模型大多包括传统细胞培养方法，例如在人工环境和非生理基质中培养的癌细胞或永生化细胞系。尽管这些模型中的许多已为识别成功的候选药物提供了有效的工具，但由于其与疾病的相关性较差，这类系统的应用仍存在疑问2。
对于大多数疾病而言，其潜在机制确实十分复杂，通常涉及多种细胞类型、独立的信号通路以及多组基因共同参与特定疾病表型的形成。即使是单基因突变作为主要病因的遗传性疾病，情况也是如此。随着近年来人类诱导多能干细胞（iPSC）技术与基因编辑工具的出现，现已能够构建三维类器官和器官芯片疾病模型，这些模型可更真实地模拟体内人类生理的复杂性3,4。此类技术的发展，重新激发了人们对表型药物发现（PDD）项目的兴趣1。PDD 可被视为一种经验性筛选方法，因其不依赖于对特定药物靶点身份的了解，也不依赖于对其在疾病中作用机制的假设。目前，PDD 策略被越来越广泛地认为在首创药物（first-in-class drugs）的....
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方案
1. mESC 培养基的制备与细胞培养
- 使用补充了1× Glasgow MEM（G-MEM BHK-21）培养基、10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、0.05 mM β-巯基乙醇、1× 非必需氨基酸（NEAA 1×）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM 丙酮酸钠的培养基制备条件培养基 +/-（CM+/-）。
- 在CM+/-培养基中添加白血病抑制因子（LIF）（1,500 U/mL）和0.1 mM β-巯基乙醇，制备条件培养基 +/+（CM+/+）。
- 在CM+/+培养基中加入两种抑制剂PD0325901（1 µM）和CHIR99021（3 µM），制备含两种抑制剂的条件培养基 +/+（CM+/+ 2i）。
- 将25 mL预热的2%明胶溶液加入500 mL不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）中，混匀，配制0.1%明胶溶液。
- 通过将胰蛋白酶（2.5%）与TVP 1×溶液（含9.5% 10× DPBS、1 mM EDTA、0.01%鸡血清、0.01%胰蛋白酶（2.5%）的H2O溶液）按1:10（体积比）混合，配制10×胰蛋白酶-Versene磷酸盐（TVP 10x）缓冲液。
注意：所有溶液均需经0.22 µm孔径滤器过滤。长期储存时，培养基应保存于-20 °C；其他试剂可在4 °C保存最多3周（参见材料表）。 - 用0.1%明胶溶液（每孔500 µL）....
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结果
血管出芽实验的操作流程概述见图1。将来自三个独立的129/Ola小鼠胚胎干细胞系（Z/Red、R1和E14）的9日龄胚胎小体（EBs）用胶原酶A消化为单细胞。细胞经PECAM-1染色后，按所述方法进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。所有细胞系均表现出强烈的内皮细胞分化能力，且在向内皮细胞分化的能力方面未观察到差异。所有细胞系产生的内皮细胞比例约为10.5% ± 1.3%（图2A）。同时定量分析了PECAM-1（+）细胞群体中泛内皮细胞标志物的相对表达水平。在不同细胞系及实验之间，所检测的全部标志物（Flk1、Flt1、Flt4、Eng、Tie2 和 Cdh5）的mRNA表达水平均具有可比性，证实了该分化方案的稳定性（图2B）。PECAM-1（+）细胞群体中动脉标志物（Notch1 和 Efnb2）或静脉标志物（
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讨论
本方案描述了一种无偏倚、稳健且可重复的基于三维胚胎体（3D EB）的血管出芽检测方法，适用于筛选调控血管生成的药物和基因。与广泛使用的二维（2D）内皮细胞培养检测方法（如利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）监测细胞迁移的侧向划痕实验或Boyden小室实验）相比，该方法具有多项优势。22,23 或细胞增殖（细胞计数、DNA合成检测、增殖标志物检测或代谢活性检测）24 因为它能独特地实现对内皮细胞和壁细胞分化及其组装成血管网络的研究，该网络可模拟出芽性血管生成的关键步骤。这些步骤包括内皮尖端细胞的选择、茎细胞的增殖、血管芽的空间定向与迁移，以及壁细胞向新生血管的募集25它还为许多三维血管生成模型提供了优势。纤维蛋白珠26,27 或胶原凝胶实验28,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了荷兰健康研究与医疗创新组织（ZonMW 446002501）、Health Holland（LSHM19057-H040）、Marie Skłodowska-Curie COFUND 领导学者计划以及 Rendu-Osler 疾病协会（AMRO）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | 密理博，默克 | 805740 | 生物危害：处理时应采取适当的安全防护措施 |
| Noble 琼脂 | Difco，BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 山羊抗大鼠 IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC标记的大鼠抗小鼠PECAM-1抗体（克隆MEC13.3） | BD 生物科学 | 551262 | |
| APC 大鼠 IgG2a κ 同型对照（克隆 R35-95 | BD 生物科学 | 553932 | |
| Axiovert 25 倒置相差组织培养显微镜 | ZEISS | ||
| 碱性成纤维细胞生长因子-2（bFGF） | Peprotech | 450-33 | |
| 台式离心机，Allegra X-15R | 贝克曼库尔特 | 392932 | |
| 生物安全柜 BioVanguard（Green Line） | Telstar | 133H401001 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 细胞计数板，Buerker 型，0.100 mm | Marienfeld | 640211 | |
| 细胞培养皿 60 x 15 mm | 康宁 | 353802 | |
| 细胞培养皿，35 × 10 毫米 | 康宁 | 353801 | |
| 12孔细胞培养板 | 康宁 | 3512 | |
| CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 1855196 | |
| 鸡血清 | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021（CT99021）HCl | Selleckchem | S2924 | |
| I型胶原蛋白，高浓度，大鼠尾部来源，100mg | 康宁 | 354249 | |
| 胶原酶A | 罗氏 | 10103586001 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜，TCS SP5 | 徕卡 | ||
| 盖玻片，24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?分泌酶抑制剂 | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 抗小鼠 VEGFR-2 克隆 | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 同型对照 大鼠 IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2438-5X | 生物危害：处理时应采取适当的安全防护措施 |
| DPBS（10倍浓度），无钙，无镁 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15575-038 | |
| 胚胎干细胞 胎牛血清 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 16141-079 | 应进行批次测试，以确保胚胎干细胞的最大存活率和生长状态。在60℃下加热灭活°C 并在 −20 °C，最长可保存1年 |
| Eppendorf 微型离心机 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| 促红细胞生成素，人源（hEPO），250 U（2.5 µg)（1 mL） | 罗氏 | 11120166001 | |
| ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白（10? 单位） 1 mL | 密理博，默克 | ESG1107 | |
| 15 mL Falcon管 | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 mL Falcon管 | Greiner Bio-One | 227270 | |
| 滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| 滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| 滤芯吸头，透明，无菌，F. Gilson，P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC 标记的抗-α 平滑肌肌动蛋白（SMA）（克隆 1A4） | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体（克隆号 30-F11） | Biolegend | 103107 | |
| FITC 大鼠 IgG2b， κ 同型对照抗体（克隆号 RTK4530） | Biolegend | 400605 | |
| 荧光封片剂 | DAKO | S3023 | |
| 气体压缩 | Cutisoft | 45846 | |
| 纱布 Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| 凝胶印迹纸，型号 GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| 明胶溶液，B型 | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| 格拉斯哥改良型最低基本培养基（GMEM） | Gibco，赛默飞世尔科技 | 21710082 | |
| IHC 锌固定液 | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 培养箱 | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| 白细胞介素-6，人（hIL-6） | 罗氏 | 11138600001 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Gibco，赛默飞世尔科技 | 25030-024 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩） | Gibco，赛默飞世尔科技 | 11140035 | |
| 显微镜载玻片盒 | Kartell Labware | 278 | |
| 显微镜载玻片，Starfrost | 克尼特尔玻璃 | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect 引物检测 | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒 | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒 | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect 引物检测 | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect 引物检测 | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect 引物检测 | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect 引物检测试剂盒 | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒 | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect 引物 | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect 引物检测试剂盒 | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect 引物 | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect 引物试剂盒 | Qiagen | QT00114576 | |
| 小鼠（ICR）失活胚胎成纤维细胞 (2 M) | Gibco，赛默飞世尔科技 | A24903 | 将小瓶存放在液氮中（195.79 °C）无限期 |
| 小鼠胚胎干细胞系 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | 由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号，西奈山医院，山姆·卢嫩菲尔德研究所，A. Nagy博士生成。[Hadjantonakis, A. K., 等，发育机制。76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| 小鼠胚胎干细胞系 Acvrl1 +/- 和 Acvrl1 +/+ | 在莱顿大学医学中心生成 [Thalgott, J.H. 等. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| 小鼠胚胎干细胞系 E14 | 由 M Letarte 实验室提供，根据 Cho S. K. 等人发表于《血液》98 卷 13 期 3635 页的方法制备–3642 (2001). | ||
| 小鼠胚胎干细胞系 R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | 由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号西奈山医院山姆·卢嫩菲尔德研究所A·纳吉博士（Dr A Nagy）制备。[Nagy, A., 等. 美国国家科学院院刊. 90 (18), 8424]–8428 (1993)]. |
| 小鼠胚胎干细胞系 Z/Red（品系 129/Ola） | 由加拿大安大略省多伦多市大学大道600号西奈山医院山姆·卢嫩菲尔德研究所A. Nagy博士团队构建 [Vintersten, K., 等. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB，重组人源 | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 抗体，大鼠抗小鼠 | BD 生物科学 | 550274 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 培养皿，聚苯乙烯材质，94/16 毫米，标准型，带通气孔，无菌 | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G 多通道移液器 P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G 初学者套装，4 支移液器套装，P2G，P20G，P200G，P1000G | Gilson | F167360 | |
| 重组人BMP-4蛋白 | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini试剂盒 | QIAGEN | 74134 | |
| 10 mL 血清移液管 | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| 25 mL 血清移液管 | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| 5 mL 血清移液管 | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | 默克 | 106498 | |
| 100 mM 丙酮酸钠 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 11360039 | |
| 5 ml 圆底试管，带细胞滤网盖 | 康宁 | 352235 | |
| 热循环仪，T100 | 伯乐（Bio-Rad） | 1861096 | |
| Triton X-100（BioXtra） | Sigma Aldrich | T9284 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| 胰蛋白酶（2.5%） | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15090046 | |
| 真空过滤/储存瓶系统，500 mL | 康宁 | 430758 | |
| VEGFA165 ，重组小鼠 | Peprotech | 450-32 | |
| 无菌水 | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| 水浴锅，Lab-Line 数字式 | 赛默飞世尔科技 | 18052A |
参考文献
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out ....
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