方法文章

体外 使用小鼠胚胎干细胞进行血管疾病建模和药物测试的血管生成的三维发芽测定

DOI：

10.3791/62554

⸱

2021年5月11日

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该测定利用分化成在3D胶原蛋白凝胶中培养的拟胚体的小鼠胚胎干细胞来分析体 外控制发芽血管生成的生物学过程。该技术可用于测试药物，模拟疾病以及在胚胎致命的缺失背景下研究特定基因。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诱导多能干细胞（iPSC）和基因编辑技术的最新进展使得为表型药物发现（PDD）程序开发了基于人类细胞的新型疾病模型。尽管这些新型设备可以更准确地预测研究药物在人类中的安全性和有效性，但它们的开发仍然强烈依赖于哺乳动物数据，特别是小鼠疾病模型的使用。因此，与人类类器官或器官芯片疾病模型并行，相关 体 外小鼠模型的开发对于评估物种与 体内 和 体外 条件之间的直接药物疗效和安全性比较的需求尚未得到满足。在这里，描述了利用分化成拟胚体（EB）的小鼠胚胎干细胞的血管发芽测定。培养到3D胶原凝胶上的血管化EB可形成扩张的新血管，这一过程称为发芽血管生成。该模型概括了 体内 萌芽血管生成的关键特征 - 从预先存在的血管网络形成血管 - 包括内皮尖端细胞选择，内皮细胞迁移和增殖，细胞引导，管形成和壁细胞募集。它适用于筛选调节血管生成的药物和基因，并与最近描述的基于人类 iPSC 技术的三维 （3D） 血管测定有相似之处。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的三十年中，基于靶点的药物发现（TDD）已被制药行业广泛用于药物发现。TDD包含明确的分子靶标，在疾病中起重要作用，并依赖于相对简单的细胞培养系统的开发以及用于药物筛选的读数1。TDD项目中使用的大多数典型疾病模型包括传统的细胞培养方法，例如癌细胞或在人工环境中生长的永生化细胞系和非生理基质。尽管其中许多模型为识别成功的候选药物提供了可行的工具，但由于其疾病相关性差，使用此类系统可能值得怀疑2。

对于大多数疾病，潜在的机制确实是复杂的，并且经常发现各种细胞类型，独立的信号通路和多组基因有助于特定的疾病表型。对于遗传性疾病也是如此，其中主要原因是单个基因的突变。随着最近人类诱导多能干细胞（iPSC）技术和基因编辑工具的出现，现在可以生成3D类器官和器官芯片疾病模型，可以更好地概括体内人类的复杂性3，4。这些技术的发展与对表型药物发现（PDD）计划的兴趣重新抬头有关1。PDD可以与经验性筛查进行比较，因为它们不依赖于对特定药物靶标身份的了解或关于其在疾病中的作用的假设。PDD方法现在越来越被公认为对发现一流药物做出了巨大贡献5。由于人类类器官和器官芯片技术的发展仍处于起步阶段，预计iPSC模型（辅以创新的成像和机器学习工具6，7）将在不久的将来提供多种新型的基于复杂细胞的疾病模型，用于药物筛选和相关PDD程序，以克服TDD方法的低生产率8，9.

虽然人类类器官和器官芯片模型可以为疾病复杂性和新药的鉴定提供重要的见解，但将药物带入新的临床实践也强烈依赖动物模型的数据来评估其疗效和安全性。其中，转基因小鼠无疑是哺乳动物最青睐的模型。它们具有许多优点，因为它们对哺乳动物的生成时间相对较短，具有许多与人类疾病相似的表型，并且可以很容易地进行遗传操作。因此，它们被广泛用于药物发现计划10。然而，弥合小鼠和人类之间的差距仍然是一个重要的挑战11。开发相当于人类类器官和器官芯片模型的 体 外小鼠模型可以至少部分填补这一空白，因为它将允许在 体内 小鼠和 体外 人类数据之间进行直接的药物疗效和安全性比较。

在这里，描述了小鼠拟胚体（EB）中的血管萌芽测定。血管由内皮细胞（血管壁内壁）、壁细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）组成12。该协议基于小鼠胚胎干细胞（mESCs）的分化为血管化EB，使用悬挂液滴概括 从头 内皮细胞和壁细胞分化13，14。小鼠ESC可以很容易地在具有不同遗传背景的小鼠囊胚的分离第3.5天培养物中建立15。它们还为克隆分析、谱系追踪提供了可能性，并且可以很容易地进行基因操作以生成疾病模型13，16。

由于血管滋养所有器官，因此许多疾病（如果不是全部）与微脉管系统的变化有关也就不足为奇了。在病理条件下，内皮细胞可以采用活化状态或功能障碍，导致壁细胞死亡或从血管迁移。这些可导致血管生成过多或血管稀疏，可诱发异常血流和血管屏障缺陷，导致免疫细胞外渗和炎症12，17，18，19。因此，开发调节血管的药物的研究很高，并且已经确定了用于治疗靶向的多个分子参与者和概念。在这种情况下，所描述的方案特别适用于构建疾病模型和药物测试，因为它概括了体内发芽血管生成的关键特征，包括内皮尖端和茎细胞选择、内皮细胞迁移和增殖、内皮细胞引导、管形成和壁细胞募集。它还显示出与最近描述的基于人类iPSC技术的3D血管测定的相似之处20。

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方案

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1. mESC的培养基制备与培养

  1. 使用补充剂 1x 格拉斯哥 MEM （G-MEM BHK-21） 培养基与 10%（体积/体积）热灭活胎牛血清 （FBS）、0.05 mM β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸 （NEAA 1x）、2 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠制备条件培养基 +/- （CM+/-）。
  2. 使用含有白血病抑制因子 （LIF） （1，500 U/mL） 和 0.1 mM β-巯基乙醇的补充剂 CM+/+ （CM+/+） 制备条件培养基 +/+ （CM+/+）。
  3. 使用含有1μM PD0325901和3μM CHIR99021的补充剂CM + / +培养基在两种抑制剂（CM + / + 2i）存在下制备条件培养基+ / +。
  4. 通过将 25 mL 预热的 2% 明胶溶液与不含钙和镁 （DPBS） 的 500 mL 磷酸盐缓冲盐水中混合来制备 0.1% 明胶溶液。
  5. 通过将胰蛋白酶 （2.5%） 与 TVP 1x（9.5% 10x DPBS、1 mM EDTA、0.01% 鸡血清、0.01% 胰蛋白酶 （2.5%） 在 H2O 中混合来制备 10x 胰蛋白酶磷酸 （TVP 10x） 缓冲液（1:10 比例，体积/体积）。
    注意:通过0.22μm孔过滤器过滤所有溶液。将培养基长期储存在-20°C，并将其他试剂在4°C下保存长达3周（参见 材料表）。
  6. 用0.1%明胶溶液（每孔500μL）包覆两个12孔细胞培养板，并在CO 2培养箱（37°C，5%CO2，潮湿气氛）中孵育30分钟。
  7. 用PBS清洗明胶包被的板，并加入500μL CM + / -培养基。
  8. 在37°C下解冻两瓶1 x 106 冷冻保存的辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），并将细胞悬液转移到装有5mL CM + / -培养基的锥形管中。
  9. 在室温（RT）下以200× g 离心细胞5分钟。吸出培养基并将细胞沉淀轻轻重悬于12 mL CM + / -培养基中，浓度为1.67 x 105 个细胞/mL。
  10. 在 12 孔细胞培养板（2.4 x 105 个细胞/cm 2）中接种 500 μL MEF 悬浮液，并将板在 CO2 培养箱中孵育过夜 （o/n）。
  11. 在CM + / + 2i培养基中解冻一瓶冷冻保存的mESC （1 x 106）。
  12. 将 mESC 悬浮液接种在 1 mL CM + / + 2i 培养基中带有 MEF 的预洗 12 孔板上，并将板转移到 CO2 培养箱中。每天刷新介质。
  13. 在70%汇合时，用DPBS洗涤mESC菌落。加入 150 μL 温热的 10x TVP 缓冲液，并在室温下孵育 30 秒以启动酶解离。
  14. 小心地取出 TVP 缓冲液，将细胞重悬于 1 mL CM+/+ 2i 培养基中，并通过轻柔移液将菌落解离成单个细胞。
  15. 通过将细胞转移到带有MEF的新12孔细胞培养板（分裂比:1:3-1:5）来传代细胞。轻轻混合以分散细胞并在CO2 培养箱中孵育。
  16. 刷新培养基（2-3 mL）并每天观察细胞生长/形态。每 2 天以 70% 汇合度重复连续传代。在开始细胞分化之前切换到CM + / +培养基两次传代。

2. 吊坠液中的EB形成

  1. 通过补充碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（50 ng·mL-1）和骨形态发生蛋白4（BMP-4）（5 ng·mL-1）的CM + / -培养基来制备新鲜中胚层分化培养基，并保持在4°C直至使用。
  2. 用 500 μL 0.1% 明胶溶液涂覆 6 孔细胞培养板的一个孔，并将其置于 CO2 培养箱中 30 分钟。
  3. 用PBS清洗明胶包被的板，并加入500μL CM + / -培养基。
  4. 为了获得纯的mESC群体，在室温下用10x TVP缓冲液胰蛋白酶消化细胞培养板30秒，将细胞重悬于1mL中胚层分化培养基中，然后将它们转移到明胶包被的6孔板中30分钟，允许MEF附着，同时mESC保持悬浮状态。
  5. 将细胞悬液收集在 50 mL 锥形管中，并使用 Neubauer 血细胞计数器和台盼蓝染料对细胞进行活/死细胞排除。
  6. 在室温下以200× g 离心细胞5分钟。 除去上清液并将细胞沉淀重悬于中胚层分化培养基中，以达到每毫升4.55 x 104 个细胞。
  7. 用 15 mL 无菌水填充 94 mm 低附着聚苯乙烯培养皿的底部。
    注意:使用3D发芽血管生成测定法测试一种特定条件时，需要四个含有悬挂液滴的培养皿（3.52 mL培养基中的1.6 x 105 个细胞）。
  8. 将细胞悬液转移到无菌塑料储液槽中，并在多通道移液器的四个位置上样，每通道 22 μL 细胞悬液（每 22 μL 液滴 1 x 103 个细胞）。
  9. 提起并倒置 94 毫米培养皿的盖子，并将其放在流动柜的干净表面上，内侧朝上。
  10. 在每个盖子的内表面上沉积40滴细胞悬液。小心地将盖子倒置，不要受到干扰，然后将其放回盘子上，使水滴面向水。
  11. 将培养皿在CO2 培养箱中孵育。将此视为分化第 0 天。将板保持4天以形成EB。

3. 尖端细胞位置的竞争测定

  1. 如前所述培养一种荧光和一种非荧光mESC系13。例如，使用标记为黄色和R1 mESC的7ACS/EYFP mESC。
  2. 通过混合等量的两条mESC线（1:1比例）来制备马赛克EB，并按照步骤2中所述在CO2 培养箱中孵育悬挂式滴式培养皿。

4. 用于血管分化的浮动EBs培养

  1. 在从悬挂液滴中收集EB之前，请准备以下内容。
    1. 在H2O中制备5%琼脂溶液，并通过高压灭菌（在120°C下20分钟）灭菌。
    2. 使用温热的 5% 琼脂溶液制备含有 1% 琼脂的 G-MEM BHK-21 培养基，并快速将 3 mL 倒入其中一个 60 mm 聚苯乙烯培养皿中。让琼脂在室温下凝固1小时。 将培养皿储存在4°C直至使用。
  2. 通过在CM+/-培养基中补充bFGF （100 ng·mL-1）和VEGF-A （50 ng·mL-1）来制备新鲜的2x血管分化培养基。将培养基储存在4°C直至使用。
  3. 使用 P1000 移液管将悬挂液滴收集在 15 mL 锥形管中，并在 EB 沉降几分钟后除去上清液。
  4. 将EB重悬于3 mL的2x血管分化培养基中，将EB悬浮液转移到一个琼脂包被的培养皿中，均匀分布EB以避免聚集。
  5. 在 CO2 培养箱中孵育培养皿，并在 bFGF （50 ng·mL-1） 和 VEGF-A （25 ng·mL-1） 存在下使用 1x 血管分化培养基每 2 天刷新培养基，直到第 9 天。
  6. 或者，在血管分化培养基中加入血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）（第4天10 ng·mL-1，第6天和第8天5 ng·mL-1）以促进壁细胞分化。

5. 流式细胞术分析

  1. 使用 P1000 移液管将 9 天大的 EB 收集在 15 mL 锥形管中，并用温热的 PBS 清洗一次。
  2. 加入含有0.2mg·mL-1胶原酶A的1mL G-MEM BHK-21培养基，将细胞在CO2 培养箱中孵育5分钟。
  3. 用 P1000 移液器轻轻上下移液，解离 EB。
  4. 通过加入 1 mL 含有 10% FBS 的冷 G-MEM BHK-21 培养基来停止胶原酶活性。
  5. 在室温下以200× g 离心细胞5分钟。
  6. 将细胞重悬于含有 2% FBS 的 500 μL PBS 中。
  7. 使用Neubauer血细胞计数器计数细胞。
  8. 将 400，000 个细胞重悬于 100 μL PBS 中，每个染色条件含有 2% FBS。
  9. 将细胞在4°C下与以下抗体孵育45分钟:APC偶联大鼠抗小鼠PECAM-1抗体（克隆MEC13.3）和FITC偶联大鼠抗小鼠CD45（克隆30-F11）或同种型对照抗体。
  10. 用含有 1% FBS 的 1 mL PBS 洗涤细胞两次。
  11. 重悬细胞以达到每毫升 5 x 106 个 细胞的终浓度。
  12. 使用带有细胞过滤器卡扣盖的圆底聚苯乙烯试管过滤细胞。
  13. 通过流式细胞术分析 20，000 个 PECAM-1 （+） 事件。

6.3D 发芽血管生成测定和免疫荧光染色

  1. 在第9天，通过加入10%FBS（体积/体积）、bFGF（50 ng·mL-1）、VEGF-A（25 ng·mL-1）、人重组促红细胞生成素（hEPO）（20 ng·mL-1）、人白细胞介素-6（IL-6）（10 ng·mL-1）、0.05 mM β-巯基乙醇、NEAA（1x）、L-谷氨酰胺（1x）、丙酮酸钠（1x）、I.型大鼠尾部胶原蛋白（1.25 mg·mL-1）、制备发芽培养基， 和氢氧化钠（3.1 mM）至GMEM BHK-1培养基。
  2. 为避免胶原蛋白凝胶化，请在使用前将发芽培养基保持在冰上。
  3. 为了评估促/抗血管生成分子的作用，将选定的药物或载体以选定的浓度添加到发芽培养基中。
  4. 从 15 mL 锥形管（相当于一种条件）中的一个 60 mm 琼脂培养皿中收集 9 天大的 EB，并在沉降几分钟后除去上清液。
  5. 用1mL发芽培养基覆盖35mm培养皿的底部，并在37°C下孵育5分钟以诱导凝胶化。
  6. 将 EB 重悬于 2 mL 冷发芽培养基中。
  7. 将悬浮液转移到涂有第一层发芽培养基的35mm培养皿中。
  8. 将EB分布在整个板上，并确保它们彼此之间的距离相等。将培养皿在CO2 培养箱中孵育。第一个发芽形成发生在24-48小时内。
  9. 在第12天，使用刮刀将含有EB的胶原蛋白凝胶小心地转移到载玻片（75 x 26 mm）上。
  10. 使用移液管（P1000）除去多余的液体，并通过在凝胶顶部放置尼龙亚麻纱布片和吸收性滤纸（凝胶吸墨纸）来脱水凝胶。通过放置重物（250克）2分钟来施加压力。小心地取出尼龙/滤纸，让载玻片在室温下风干30分钟。
  11. 用PBS在室温下洗涤载玻片三次5分钟。
  12. 使用锌溶液（见 材料表）在4°C下固定EB。 或者，在黑暗中用多聚甲醛（PFA）（4%）o / n在4°C下固定马赛克荧光EB。
  13. 取出固定剂。用PBS在室温下清洗载玻片五次5分钟。
  14. 在室温下透化含有0.1%Triton-X100的PBS中的EB15分钟。
  15. 取出透化溶液。用PBS清洗载玻片五次5分钟。
  16. 将EB在封闭缓冲液（PBS与2%牛血清白蛋白，BSA）中在室温下孵育1小时。
  17. 为了染色内皮芽，在4°C的封闭缓冲液o / n中使用大鼠抗小鼠抗PECAM-1一抗（1:100稀释）。
  18. 用PBS清洗载玻片五次5分钟。
  19. 将载玻片与山羊抗大鼠Alexa 555二抗在封闭缓冲液（1:250稀释）中孵育，并在需要时在封闭缓冲液（1:250稀释）中与FITC偶联的抗α-SMA抗体一起在黑暗中的RT下染色壁细胞2小时。
  20. 在安装之前，用PBS清洗载玻片三次5分钟，用H20清洗一次。

7. EB内皮芽的共聚焦成像、形态测量和定量分析

  1. 通过使用共聚焦显微镜通过焦平面合并（z 堆叠）获取免疫染色 EB 的高分辨率图像。使用10倍放大物镜对整个EB进行成像。
  2. 分析使用 ImageJ 获取的图像，以评估形态并根据既定的定量方法13，14，21 量化 PECAM-1 阳性内皮芽的特征。
    1. 通过手动计算每个EB的总芽数来计算每个EB的平均内皮芽数。
    2. 使用 ImageJ 绘图工具测量各个芽的长度。从EB核心区域开始定义内皮芽的底部，并手动绘制一条线，直到芽尖结束。
    3. 通过手动计算每个芽芽的尖端细胞数来计算每个芽的尖端细胞数，然后计算每个EB的平均值。
    4. 通过手动确定亲本芽的轴来计算丝状伪足方向，并使用 ImageJ 软件角度工具测量它们之间的锐角。计算方向>50°的芽芽数，并将其除以感兴趣的EB的芽总数。
      注意:角度始终在 0° 到 90° 之间。
  3. 使用共聚焦显微镜获取免疫染色EB的高分辨率图像。使用40倍放大物镜实现单个内皮芽的高分辨率图像。
  4. 使用 ImageJ 软件量化被 α-SMA 阳性 MC 包围的 PECAM-1 阳性 EC 芽的血管覆盖率。
    1. 将合并的图像拆分为单独的红色和绿色通道。
    2. 将图像转换为其二进制形式。
    3. 测量由PECAM-1（红色标记的内皮细胞）和α-SMA（绿色标记的壁细胞）阳性细胞分别占据的芽的总细胞面积。
    4. 使用图像计算器函数和 AND 运算符生成合并的图像。测量图像的总蜂窝面积。要计算覆盖范围，请将共定位图像的面积除以 PECAM-1 二值图像的面积。
  5. 为了分析由镶嵌EB开发的芽的内皮尖端/茎细胞位置的细胞竞争，手动评分尖端细胞的数量并根据荧光信号标记其基因型来源。计算每个EB的平均值。

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结果

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血管发芽测定的方案概述如图1所示。使用胶原酶A将来自三个独立的129 / Ola mESC系（Z / Red，R1和E14）的9天大的EB酶解散成单个细胞.对细胞进行PECAM-1染色并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分析。所有细胞系均表现出强大的内皮分化，并且未观察到其分化为内皮细胞的能力存在差异。所有细胞系产生约10.5%±1.3%的内皮细胞（图2A）。还定量了PECAM-1（+）细胞群中PAN内层细胞标志物的相对表达水平。所有分析的标记物（Flk1、Flt1、Flt4、Eng、Tie2 和 Cdh5）的 mRNA 表达水平在细胞系和实验之间相当，证实了分化方案的稳健性（图 2B）。 PECAM-1（+）细胞群仅表达非常低的动脉（Notch1和Efnb2）或静脉（Couptf2和Ephb4）标...

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讨论

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该协议描述了一种无偏倚，稳健且可重复的基于3D EB的血管发芽测定，该测定适用于筛选调节血管生成的药物和基因。与许多广泛使用的二维 （2D） 测定相比，该方法具有优势，使用内皮细胞培养物（例如人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）来监测迁移（横向划痕测定或 Boyden 室测定）22，23 或增殖（计数细胞数量、DNA 合成检测、增殖标志物检测或代谢测定）24因为它独特地允许研究内皮细胞和壁细胞分化及其组织成模拟发芽血管生成关键步骤的血管网络。这些步骤包括内皮尖端细胞的选择，茎细胞的增殖，血管芽的空间取向和迁移，以及壁细胞募集到新生血管25。它还为许多3D血管生成模型提供了优势。模拟肾小管生成的纤维蛋白珠26，27或胶原凝胶测定28，...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了荷兰组织（ZonMW 446002501），荷兰卫生（LSHM19057-H040），主要研究员计划Marie Skłodowska-Curie联合基金和Maladie de Rendu-Osler协会（AMRO）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Milipore， Merck805740生物危害：处理
脂 NobleDifco， BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 山羊抗大鼠 IgGLife technologiesA21434
APC 偶联大鼠抗小鼠 PECAM-1 抗体（克隆 MEC13.3）BD Biosciences551262
APC 大鼠 IgG2a 和 kappa;同型对照 （克隆 R35-95）BD Biosciences553932
Axiovert 25 倒置相差组织培养显微镜
碱性成纤维细胞生长因子-2 （bFGF）Peprotech450-33
台式离心机，Allegra X-15R贝克曼库尔特392932
生物安全柜 BioVanguard（绿线）Telstar133H401001
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma-AldrichA9418
细胞计数室，Buerker，0.100 mmMarienfeld640211
细胞培养皿 60 x 15 mm康宁353802
细胞培养皿，35 x 10 mm康宁353801
细胞培养板 12 孔Corning3512
CFX96 Touch 实时 PCR 检测系统Biorad1855196
鸡血清Sigma-AldrichC5405
CHIR-99021 （CT99021） HClSelleckchemS2924
胶原蛋白 I，高浓度，鼠尾，100mg康宁354249
胶原蛋白酶 A罗氏10103586001
共聚焦激光扫描显微镜， TCS SP5徕卡
盖板眼镜， 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ？分泌酶抑制剂Sigma AldrichD5942
DC101 抗小鼠 VEGFR-2 克隆BioXcellBP0060
DC101 同种型大鼠 IgG1BioXcellBP0290
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD2438-5X时应遵循适当的安全说明
，无钙、无镁Gibco、Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco，Thermofisher scientific15575-038
胚胎干细胞胎牛血清Gibco，Thermofisher scientific16141-079应进行批次测试，以确保最大 ES 细胞活力和生长。在 60°C 时加热灭活;C 并存储在 −20 >C 长达 1 年
Eppendorf 微量离心机 5415REppendorf AG 
人促红细胞生成素 （hEPO），250 U （2.5 µg） （1 mL）Roche11120166001
ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白 （10 单位  1 mL）Milipore， MerckESG1107
Falcon 管 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon 管 50 mLGreiner Bio-0ne227270
滤芯吸头，透明，无菌 F.Gilson，P-200Greiner Bio-One739288
滤芯吸头，透明，无菌 F.Gilson，P10Greiner Bio-One771288
滤嘴，透明，无菌 F.Gilson，P1000Greiner Bio-One740288
FITC 偶联抗 α;平滑肌肌动蛋白 （SMA）（克隆 1A4）Sigma AldrichF3777
FITC 偶联大鼠抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）Biolegend103107
FITC 大鼠 IgG2b，κ同型控制抗体（克隆 RTK4530）Biolegend400605
荧光封固剂DAKOS3023
GascompressCutisoft45846
纱布 Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
凝胶印迹纸，GB003 级WhatmanWHA10547922
明胶溶液，B型Sigma-AldrichG1393-100 ml
格拉斯哥的 MEM （GMEM）Gibco，Thermofisher scientific21710082
IHC 锌固定剂BD 药原550523
IncuSafe CO2 培养箱PHCBiMCO-170AICUV-PE
白细胞介素-6，人 （hIL-6）罗氏11138600001
L-谷氨酰胺 200 mMGibco，Thermofisher scientific25030-024
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）Gibco，Thermofisher scientific11140035
显微镜载玻片盒Kartell Labware278
显微镜载玻片，StarfrostKnittel 玻璃VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect 引物测定QiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQT00156982 Mm_Nr2f2_1_SG
QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect 引物检测QiagenQT00114576
小鼠 （ICR） 灭活胚胎成纤维细胞 （2 米）Gibco，Thermofisher scientificA24903将样品瓶储存在液氮 （195.79 °C） 无限期
小鼠胚胎干细胞系 7AC5/EYFP （ATCC SCRC-1033）ATCCSCRC-1033由西奈山医院塞缪尔·卢嫩菲尔德研究所的 A Nagy 博士生成，地址为安大略省多伦多大学大道 600 号，M5G 1X5，加拿大。[Hadjantonakis， A. K.， et al. 发展机制。76 （1–2）， 79–90 （1998）]。
小鼠胚胎干细胞系 Acvrl1 +/- 和 Acvrl1 +/+在莱顿大学医学中心生成 [Thalgott， J.H. et al. Circulation. 138 （23）， 2698–2712 （2018）]。
小鼠胚胎干细胞系 E14由 M Letarte 实验室提供，并根据 Cho， S. K. 等人生成。血液。98 （13）， 3635–3642 （2001 年）。
小鼠胚胎干细胞系 R1 （ATCC SCRC-1011）ATCCSCRC-1011大略省多伦多大学大道 600 号西奈山医院塞缪尔·卢嫩菲尔德研究所的 A Nagy 博士生成，M5G 1X5。[Nagy， A.， et al. 美国国家科学院院刊。90 （18）， 8424–8428 （1993）]。
小鼠胚胎干细胞系 Z/Red（菌株 129/Ola）由西奈山医院塞缪尔·卢嫩菲尔德研究所的 A Nagy 博士生成，地址：安大略省多伦多大学大道 600 号，M5G 1X5，加拿大 [Vintersten， K. 等人。创世纪。40 （4）， 241–246 （2004）]。
NanoDrop 1000 紫外可见分光光度计Thermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB，重组人Peprotech100-14B
Pecam-1 抗体，大鼠抗小鼠BD Biosciences550274
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）Gibco，Thermofisher scientific
皿，PS，94/16 mm，标准，带通风口，无菌Greiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G 多通道 P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G 入门套装，4 个移液器套装，P2G、P20G、P200G、P1000GGilsonF167360
重组人 BMP-4蛋白质研发D Systems314-BP
RNeasy Plus 迷你套件QIAGEN74134
血清移液器，10 mLGreiner Bio-One607 180
血清移液器，25 mLGreiner Bio-One760 180
血清移液器，5 mLGreiner Bio-One606 180
氢氧化钠 （NaOH）Merck106498
丙酮酸钠 100 mMGibco，Thermofisher scientific11360039
试管 5 ml 圆底，带细胞过滤器盖Corning352235
热循环仪，T100Biorad1861096
Triton X-100 （BioXtra）Sigma AldrichT9284
台盼蓝溶液，0.4%Gibco，Thermofisher scientific
胰蛋白酶 （2.5%）Gibco，Thermofisher scientific15090046
真空过滤器/储存瓶系统，500 mL康宁430758
VEGFA165，重组小鼠Peprotech450-32
水，无菌Fresenius-KabiB230531
水浴，Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
琼蔡司 生物危害：处理 DPBS （10x） Z605212QT00099064 由加拿大安15140122培养15250061

参考文献

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