小鼠卒中模型构建：经由颈外动脉进行短暂性大脑中动脉阻塞

摘要

在实验性脑卒中研究中，采用多种大脑中动脉阻塞（MCAo）模型。本文描述了一种通过颈外动脉（ECA）实现的短暂性MCAo实验性脑卒中模型，旨在模拟人类脑卒中情况下因自发性血栓溶解或治疗干预导致脑血管血栓被清除的情形。

摘要

脑卒中是发达国家中导致死亡的第三大常见原因，也是成人获得性残疾的首要原因。迄今为止，仅有少数脑卒中患者在发病后的最初几小时内能够接受有限的治疗选择。目前，研究人员正在广泛探索新的治疗策略，特别是旨在延长治疗时间窗的方法。这些研究包括对脑卒中后重要病理生理通路的深入分析，例如卒中后炎症反应、血管生成、神经元可塑性以及再生过程。在过去十年中，不同独立研究团队之间实验结果和科学发现的可重复性差的问题日益引起关注。为应对所谓的“可重复性危机”，迫切需要建立所有实验操作的详细标准化模型。作为“ImmunoStroke”研究联盟（https://immunostroke.de/）的一项努力，本文提出了一种标准化的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（MCAo）模型。该模型在撤除栓线后可实现血流的完全恢复，模拟了在大多数人类脑卒中患者中发生的治疗性或自发性血栓溶解过程。随附视频展示了该“栓线法”脑卒中模型的手术操作步骤及其功能分析工具。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的最常见原因之一。尽管脑卒中主要分为缺血性和出血性两种类型，但所有脑卒中病例中约有80–85%为缺血性脑卒中¹。目前，针对缺血性脑卒中患者仅有两种可用的治疗方法：使用重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）进行药物溶栓治疗，或实施机械取栓术。然而，由于治疗时间窗狭窄以及存在多种排除标准，仅有少数患者能够从这些特定治疗中获益。在过去二十年中，临床前及转化脑卒中研究主要集中于神经保护策略的探索。然而，迄今为止，所有进入临床试验的神经保护药物均未能显示出对患者的明显疗效²。 

由于体外（in vitro）模型无法准确再现脑卒中所有的脑内相互作用及病理生理机制，动物模型在脑卒中临床前研究中至关重要。然而，单一动物模型难以完全模拟人类缺血性脑卒中的所有特征，因为缺血性脑卒中是一种高度复杂且异质性的疾病。因此，针对不同物种已陆续开发出多种缺血性脑卒中模型。其中，脑皮层小动脉的光化学血栓模型或大脑中动脉远端永久性阻塞模型常用于诱导新皮层内小范围且定位明确的病灶^3,4。除此之外，目前最常用的脑卒中模型可能是所谓的“线栓模型”，该模型通过暂时性阻塞大脑中动脉（MCA）实现。该模型通过将缝合线栓短暂插入至MCA起始处，导致脑血流急....

方案

本视频中报道的实验遵循国家关于实验动物使用的规定，并已获得德国政府委员会（德国慕尼黑上巴伐利亚行政区政府）的批准。实验使用10周龄雄性C57Bl/6J小鼠，在受控温度（22 ± 2 °C）条件下饲养，光照-黑暗周期为12小时，可自由摄取颗粒饲料和饮水ad libitum。

1. 材料与仪器的准备

1. 连接加热毯，以在麻醉期间维持手术区域及小鼠体温在 37 °C。
2. 将剪刀和镊子进行高压灭菌，准备 70% 乙醇溶液，并备好泛醇眼膏、若干棉片以及 5-0 涂层编织聚酯缝合线以供使用。准备一支 1 mL 注射器，内含 0.9% 生理盐水溶液（不带针头），用于保持动物切口部位湿润。准备麻醉气体（100% O₂ + 异氟烷）。
3. 通过截取 10 µL 移液器吸头的尖端（3–5 mm 长度）制作用于固定激光多普勒探头的支架。
   注意：所有器械均使用热珠灭菌器进行灭菌。手术前后均使用微生物消毒喷雾对表面进行消毒。术前使用伤口消毒喷雾对小鼠头部和胸部周围区域进行消毒。

2. 激光多普勒仪的准备

1. 手术前30分钟向小鼠注射镇痛剂（卡洛芬4 mg/kg，布托啡诺0.1 mg/kg，腹腔注射）。
2. 将小鼠置于诱导室中，以4%异氟烷气流麻醉，直至其自发身体运动和触须活动停止。
....

结果

本文所述模型是对常用的“线栓”脑卒中模型的一种改良，该模型通过将一根硅化处理的线栓从颈外动脉（ECA）插入，暂时阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部（图1）。在撤出线栓后，仅颈外动脉的血流被永久性阻断，而颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）可实现完全再通。这使得脑组织获得充分的再灌注（图2），类似于临床上人类患者在接受成功的药物溶栓或机械取栓治疗后所观察到的情况。此外，本研究还描述了一种通过将连接激光多普勒探头的导管固定于颅骨上MCA供血区域，从而在阻塞和再灌注过程中连续监测脑血流量的方法。

该手术的总体死亡率为 <5%（由经过培训的外科医生操作时）。在MCAo术后早期，动物通常表现出严重的姿势和运动功能障碍、全身性虚弱以及体重下降。¹³这些严重缺陷是暂时性的，动物在大约1周后活动能力有所改善；因此，这些缺陷更特异于局灶性神经症状。

大脑中动脉闭塞后的行为缺.......

讨论

本方案描述了一种基于德国多中心研究联盟（“ImmunoStroke”）共识的实验性脑卒中模型，旨在建立标准化的短暂性大脑中动脉阻塞（MCAo）模型。该短暂性MCAo模型通过将一根硅胶包被的细丝从颈外动脉（ECA）插入至大脑中动脉（MCA）起始处，实现限定时间的动脉阻断后血流再通，是目前应用最广泛的脑卒中模型之一。因此，该方法可被视为具有转化相关性的脑卒中模型。

视频中介绍的“线栓模型”相较于其他既往描述的脑卒中模型具有一些优势，例如无需开颅，并可实现短暂闭塞血管的完全再灌注。然而，该手术操作的复杂性也可被视为一种局限性，因其涉及侵入性手术，并需对靠近气管和迷走神经的多条动脉进行精确操作。动物长时间暴露于麻醉剂下也可能是需要考虑的重要因素，因为麻醉剂对神经保护作用及脑卒中预后的影响已有充分报道¹⁶。最后，尽管该手术过程较为复杂，但由经过训练的外科医生操作时，大约可在20分钟内完成。

与先前描述的“线栓”卒中模型¹⁷相比，本文所述方法还.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
45° 斜坡	H&S Kunststofftechnik		高度：18 cm
5/0 缝合线	Pearsalls	10C103000
5 mL 注射器	Braun
乙酸	Sigma Life Science	695092
异氟烷麻醉系统	Drager
Bepanthen 软膏	Bayer
C57Bl/6J 小鼠	Charles River	000664
夹子	FST	12500-12
夹钳	FST	18055-04
夹钳 holder	FST	18057-14
棉球	NOBA Verbondmitel Danz	974116
焦油紫	Sigma Life Science	C5042-10G
冷冻切片机	Thermo Scientific CryoStarNX70
70% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
96% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
99% 乙醇	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
丝线	Doccol	602112PK5Re
精细45°角镊子	FST	11251-35
精细镊子	FST	11252-23
精细剪刀	FST	14094-11
胶水	Orechseln	BSI-112
胶水固化剂	Drechseln & Mehr	BSI-151
加热垫	FHC DC Temperature Controller
异氟烷	Abbot	B506
异戊烷	Fluka	59070
氯胺酮	Inresa Arzneimittel GmbH
激光多普勒仪	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
激光多普勒探头	Perimed	91-00123
磷酸盐缓冲液 pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
恢复室	Mediheat
Roti-Histokit 封片介质	Roth	6638.1
生理盐水溶液	Braun	131321
手术刀	Feather	02.001.30.011
硅涂层丝线	Doccol	602112PK5Re
体视显微镜	Leica	M80
Superfrost Plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas 弹簧剪刀	FST	15000-00
赛拉嗪	Albrecht