抑郁症的动物模型 - 慢性绝望模型（CDM）

情感障碍，如重性抑郁障碍，是最常见和最具挑战性的精神疾病之一，与高个人痛苦¹，自杀风险增加²有关，并给社会带来相当大的社会经济负担³。尽管具有影响，但治疗选择有限，迫切需要开发新的抗抑郁干预措施，特别是由于过去几十年来精神药理学的创新危机。为了了解抑郁症的病理生理学并测试潜在的新药剂，迫切需要合理有效的动物模型⁴。近半个世纪以来，最初由Porsolt5描述的经典强制游泳测试（FST）被用作诱导和读出，用于筛选潜在的新型抗抑郁药。它包括在第1天强制游泳5-15分钟，随后的一次性药物应用，以及评估小鼠在第二天的另一个游泳期间在水中不动的部分。不动时间被认为代表了缺失的自然逃逸行为，并被认为与小鼠抑郁样状态的程度相关⁵。

经典的FST不仅在科学界受到严厉批评^6，7，8 ，而且在公共媒体^{上也受到严厉批评8}。围绕FST的大多数争议都是由于经典范式中只有1天的诱导和治疗期短。有人认为，FST代表了一种急性创伤模型，而不是一种可与人类抑郁症相媲美的状态。此外，Porsolt测试可能适合作为潜在抗抑郁药的筛查工具，但它忽略了许多抗抑郁药作用的延迟发作。

慢性绝望模型（CDM）^{9，10，11，12，13}，^14，15，源自原始的FST，代表了更适合抑郁症的动物模型。在清洁发展机制中，连续5天反复游泳压力可避免急性创伤性影响。由于未能从反复和持续的压力情况中逃脱，老鼠被认为会发展出一种无助，投降并最终绝望的状态。这种范式更类似于当前人类抑郁症发展的心理学理论，而不是在创伤后应激障碍发作时通常经历的单一急性创伤。CDM中由此产生的抑郁样状态稳定长达4周⁹，因此为更长的治疗期开辟了可能性，这与临床疾病相比更好，其中抗抑郁药通常需要2-4周才能显示出益处¹⁶。

然后，对抑郁样状态的评估应该是多维的。不动时间的测量（如经典的 FST）很有用，但不应用作唯一的结果参数。下面描述的各种方法应该能够根据抑郁症患者通常发现的症状绘制抑郁状态的不同维度。合适的读出评估可能包括逃逸行为（不动时间^9，10，17），尾部悬架测试（TST）⁹，快感缺乏（经典蔗糖偏好测试（SPT）¹⁸），以动机为导向的行为（鼻子戳蔗糖偏好测试（NPSPT）¹⁰），期望/探索行为（对模糊信号的反应¹⁹;Y-maze ^test9），电生理学（长期可塑性的测量（长期增强，LTP;长期抑郁，LTD）²⁰），分子评估（即时早期基因（IEG）的激活模式;进一步的应激模式²¹）。

从理论上讲，重复的游泳测试可用于诱导抑郁状态，而无需对不动时间进行任何评估。但是，强烈建议至少提供具有不动时间的概念验证实验系列。此外，CDM代表了一个合适的模型，通过测量诱导阶段的不动时间来评估抑郁样状态的发展。可以评估游泳前治疗的特定小鼠品系或小鼠对压力的弹性或脆弱性以及行为绝望的诱导。

所有实验均按照欧洲指南（EU 2010/63）和德国动物保护法（TierSchG），FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php），国家动物福利机构GV-SOLAS（www.gv-solas.de/index.html）指南进行，用于护理和使用实验动物，并得到弗莱堡大学动物福利委员会和斯特拉斯堡动物实验协会（CREMEAS， CEEA35），以及地方当局。将年龄为10-14周（产后70-98天，PND）的C57Bl6N野生型小鼠的两性用于野生型（WT）指示的实验。作为应激弹性系，使用前脑神经元CaMKII启动子下腺苷_A1 受体表达增强的转基因小鼠系^9，15。实验结束后，小鼠因颈椎脱位而处死。

1. 准备工作

1. 获得动物研究许可证，包括全面的实验计划。
2. 到达:抵达后，在动物设施中饲养动物以进行CDM。如果动物是从外部供应商处购买的，请允许它们至少2周来适应新环境。
3. 住房:要容纳动物，请确保笼子没有被最大数量的动物占用，以避免额外的压力。保证住房条件符合国际建议的鼠标住房（有关更多信息，请参阅²²），并始终保持它们。
   注意:最重要的标准外壳条件包括每小时换气25-120次的独立通风笼，12小时光暗循环，温度尽可能稳定（至少恒定在20-24°C之间），湿度尽可能稳定（至少45%-65%），啃咬材料和庇护所存在，没有单独的外壳。
4. 时间点:在一天中的同一时间执行所有实验。
   注:尚未进行直接评估来验证白天对CDM的影响，但大多数评估抑郁样状态的行为测试都显示根据一天中的时间而变化^23，24，25，并且白天也极有可能影响CDM。
5. 套料材料:将套料减少到最低限度。确保保持架中没有运行轮等。
   注意:丰富的环境可防止抑郁状态的诱导。
6. 组组成:在整个实验过程中，让动物保持在同一组中。将雌性小鼠分组在一起，甚至来自不同的幼崽;将雄性小鼠与产仔的雄性动物分组在一起。由于即将到来的攻击性，特别是男性的攻击性，咬人和理发可能会成为一个问题，因此特别强调群体组成。避免单身住房，因为剥夺是一个主要的额外压力源。
7. 动物:使用不同的小鼠品系，即使已经观察到特定的差异^9，10。常用的小鼠品系是C57Bl6N.标记小鼠以进行配对统计分析（见步骤3.2.4）。
8. 动物性别:平均使用雄性和雌性小鼠。
9. 动物年龄:确保动物至少10周（70 PND）大。不要使用年幼的动物，因为游泳引起的疲惫。
10. 设备:使用容量至少为2 L，直径为24-26厘米，最小高度为30厘米的透明玻璃圆筒/烧杯。其他要求包括用于检查水温的温度计，纸巾，红光加热灯/加热垫或类似的加热源，计时器，秒表，安静的环境。对游泳课程进行录像，以便离线分析和记录。确保日期和时间在磁带/文件上连续可见，并带有单个动物的识别码。存储文件以供以后分析和进一步参考。薄膜从玻璃圆筒的侧面，而不是从上面，以方便分析。

2. 感应阶段

1. 开始之前
   1. 目视观察动物的异常情况，包括咬人或理发的迹象。如果动物表现出任何轻微的伤害，则从实验系列中排除整个笼子。确保兽医随时可用，因为受伤在实验过程中会恶化，并且会阻止继续，因为小鼠在压力的影响下变得更加具有侵略性。
   2. 在开始实验之前，获得每只动物的体重。确保经常观察到的体重减轻不超过初始体重的20%。排除体重减轻超过20%的动物，并立即对它们实施安乐死，因为假设它们遭受了高度的痛苦。
   3. 在室温（22-23°C）下将烧杯或圆筒装满水，使其距离底部至少20厘米，在水面和容器上缘之间留下至少10厘米。
2. 性能
   1. 轻轻地将动物转移到水中。在游泳阶段，保持动物持续观察以防止溺水。从动物看不到实验者的位置观察（例如，从隔壁房间的视频观察）。
   2. 在实验开始时设置一个计时器。10分钟后，只需抓住动物的尾巴，即可将其从水中取出。用纸巾轻轻擦干，然后将其放在加热灯下或加热垫上。
   3. 一次只评估一只动物。确保动物不能看到彼此（例如，通过房间隔板将笼子与实验装置分开）。
   4. 连续5天每天进行10分钟的强制游泳训练。
3. 整理
   1. 在五次游泳后，将动物移回家笼，并让它们休息至少2天。随后开始具体的治疗干预。

3. 抗抑郁治疗的评估

1. 时间课程
   1. 评估CDM的急性和亚慢性治疗。根据科学问题，调整诱导阶段和读数之间的休息时间。
   2. 为了评估氯胺酮的急性和速效效力，选择清洁发展机制诱导期后的短暂休息期（几天）。应用治疗（即腹膜内注射），然后在不久之后进行评估（额外的游泳会话或不同的评估方法）。
   3. 为了评估亚慢性治疗的效果，将治疗期延长至4周（没有关于更长治疗期的数据）。例如，在诱导阶段后4周内用丙咪嗪对动物进行口服治疗，并在此后进行评估。
   4. 在治疗期结束后立即开始评估抑郁状态，例如第二天。始终为控制和实验条件选择相同的时间段。
2. 不动时间
   1. 概念验证
      1. 要使用不动时间作为读出方法，请评估诱导阶段的每一天和测试日，以提供概念验证（见 图1）。对于进一步的实验系列，将评估减少到第1天，第5天和测试日（见 图1C）。
      2. 每个实验都录下来。允许两名训练有素的观察者对实验条件视而不见，独立执行分析。视频分析使实验者能够从不同的房间观察行为，从而最大限度地减少对测试的干扰（例如，请参阅 补充材料中的视频文件）。
   2. 条件:在游泳测试期间观察和识别三种不同的行为条件:挣扎，游泳和不动。大多数研究人员专注于不动;进一步区分挣扎和游泳很少有用，并且大大增加了分析的复杂性和持续时间。
      1. 挣扎:动物积极地试图逃离危险的情况。这包括爪子的侧面，头部朝向墙壁和所有四肢的运动。水面通常略微湍急。
      2. 游泳:动物至少移动两只后爪，并在水中移动一段距离。它积极寻找出路，但没有试图克服船只的玻璃墙。游泳不涉及将爪子举到水面以上，身体通常与圆柱体壁平行。在这种情况下，动物经常转身或转圈。
      3. 不动:动物保持静止，处于冰冻状位置，根本不移动或仅移动尾巴或前爪以保持头部高于水面。除了被动漂浮外，没有主动移动的距离，也没有观察到前爪的定向运动。
   3. 跟踪
      1. 使用离线视频录制执行评估。使用由两名独立且经验丰富的审查员进行盲法评分，并计算两个评分之间的平均值。
      2. 如果两个评分器的结果差异高于先前确定的范围，则重复评分。持续观察小鼠，因为不同的条件经常在挣扎，游泳和不动之间变化。
      3. 使用秒表测量鼠标在水中停留10分钟内在聚焦阶段（通常不动）所花费的总时间。在更改正在进行的时间测量值之前，请考虑大约一秒钟的短暂延迟（例如，如果动物在不动状态下保持20秒，并且只移动一次不到一秒钟，然后又恢复到不动状态10秒，则总不动时间为30秒）。
   4. 统计:由于个体间标准偏差相对较高（可能是由等级相关的行为从笼子转移到游泳测试引起的），标记或标记动物以执行配对（而不是不成对）的参数测试。评估正态分布，并根据具体问题，使用事后 t 检验或配对 t 检验执行方差分析 （ANOVA） 以比较不同组。使用静止时间的绝对值或归一化值执行分析。
      1. 绝对值:给出从第1天到第5天的不动时间的平均值，以及测试日±SEM的平均值（见 图1A）。比较第 1 天和第 5 天的平均值，最好使用配对 的 t 检验来验证抑郁状态的诱导。如果第 1 天和第 5 天之间存在显著差异，请将第 5 天的平均值与测试日的平均结果进行比较。确保一个实验中的典型群体规模在6到10只动物之间，并期望野生型动物的基线和诱导后不动时间之间存在显着差异。如果由于基线差异而使用绝对值，则很难将不同组与不成对的 t检验进行比较;因此，请使用规范化值。
      2. 相对/归一化值:通过归一化将不同的治疗效果与第5天的单个结果进行比较，然后将值表示为第5天的百分比（见 图1B）。
   5. 对照实验
      注意:游泳表现可能与运动有关。导致运动过度的物质可诱发假阳性结果（即不动时间减少）;以及镇静剂可以人为地增加不动时间。
      1. 在执行游泳分析之前，评估未知物质的运动变化。在单独的一组动物中使用开放现场测试（OFT）至少10分钟。
      2. 在OFT中选择与CDM相同的观察时间（10分钟），以检测被测化合物的非特异性超机车效应，这些效应可能通过测量具有高有效性的不动时间来影响CDM的读数。
      3. 在显著的超机车效应的情况下，不要评估游泳过程以评估抗抑郁效力，而是使用不同的读出方法（例如，蔗糖偏好，尾部悬架测试等）。

4. 评估抑郁样状态的发展

1. 为了评估抑郁症的发展，评估诱导阶段的每一天，以测量不动时间。
   注意:在这种情况下，每天不动时间的轻微增加描述了弹性，而与未经治疗或野生型动物相比，更强和更早的增加代表了对压力引起的绝望的脆弱性增强。通过在游泳事件发生前对小鼠进行治疗，可以评估有关行为绝望发展的预防性干预或转基因小鼠品系。

在CDM诱导阶段的第一次游泳中，小鼠通常表现出190秒至230秒之间的平均不动时间，该时间随着每次额外的游泳而不断上升（图1A）。这种增加在前3天更为明显，并在过去2-3天内达到平台状阶段。第5天测量的不动时间在长达4周的时间内保持稳定，表明行为绝望稳定。干预的抗抑郁药效力可以通过在诱导阶段的最后一天和测试日之间治疗动物来评估。请注意，游泳期间的绝对得分时间非常主观，取决于实验者，年龄，性别和使用的小鼠线。但是，会话之间的相对差异相当稳定，只有很小的内侧差异。

在 图1中，显示了几种具有代表性的治疗方法。丙咪嗪、睡眠剥夺和氯胺酮显著减少了不动时间，而睡眠剥夺与恢复睡眠相结合，没有显示出抑郁样表型的显著变化。这些结果与所应用治疗的抗抑郁效力一致，并且类似于在人类患者中观察到的效果。治疗包括通过饮用水摄入丙咪嗪20mg / kg /天3周，测试前24小时通过单次腹膜注射摄入3mg / kg氯胺酮，并在测试前剥夺睡眠6小时。

根据研究问题，可能会显示各种表示形式。绝对值的表示可以提供真实的数据概述，并允许对诱导阶段和单次治疗进行良好的评估（图1A，D）。但是，各种治疗方法的差异无法直接比较;因此，每个治疗组在第5天具有不同的不动时间平均值。因此，在这种情况下，建议使用归一化平均值的表示（图1B）。由于空间限制，可以选择简化的表示（图1C）。请注意，必须至少显示第 1 天、第 5 天和考试当天的结果。

图 1:成功生成绝对值和规范化值。 （A）可以观察到在30只小鼠中成功诱导抑郁样状态。每个点代表一只动物在特定日期的不动时间，条形表示被测试动物的平均值。不动时间表示诱导阶段的每一天（第1天至第5天）和测试日（虚线后），有或没有治疗。请注意，在此样本中，在第 1 天和第 2 天之间可以观察到显著增加。在某些情况下，显著性水平首先在第 1 天和第 3 天之间达到。对于实验的继续，在第 1 天和第 5 天之间必须有统计学意义的增加。请注意典型的天花板效应（第 1 天、第 2 天和第 3 天之间增加，而第 4 天和第 5 天之间的差异）。在第5天和测试日之间，动物被安置在家庭笼子里4周，要么没有进一步治疗（CDM），要么用丙咪嗪（Imip.）处理;睡眠剥夺（ SD）;睡眠剥夺和恢复睡眠（RS）和氯胺酮（Ket）。（B）每天给出个体动物表现的示范性时间过程。（C）图1A中已经显示的相同结果的归一化表示。每只动物和每一天的不动时间归一化为第5天的相应不动时间，并以百分比表示。使用这种方法可以更好地显示和比较不同组的治疗后值。（D） 表示第 1 天、第 5 天和测试日 （CDM） 的归一化值。在成功进行概念验证研究后，评估时间点可能会减少到第一天，第五天和测试日。这些时间点是必需的，因为第1天和第5天之间的显着增加对于证明成功诱导是必要的，并且需要将第5天与测试日进行比较以给出治疗效果的声明。（E）比较三种不同小鼠系的不动时间:野生型（WT）显示成功诱导;示范性弹性线（RL）显示，在前三天和测试当天，抑郁样行为显着降低。使用 Bonferroni 事后检验的单因素方差分析:∗/#p < 0.05，∗∗/##p < 0.01，∗∗∗/###p < 0.001，∗∗∗∗/####p < 0.0001。（#表示与第 1 天的平均值的差异，∗表示与图 1A、C 中的第 5 天的平均值和图 1E 中的 WT 鼠标线的差异）。数据以SEM±表示，请单击此处查看此图的放大版本。

如果所有5天内的不动时间保持不变（图2），则施加的压力无法相关地改变行为，并且无法评估治疗效果;动物需要牺牲，不得进一步使用。

图 2:失败的结果。 无效归纳的表示形式如图所示。请注意，第 1 天和第 5 天之间的不动时间没有显著增加。因此，没有达到继续实验的标准，并且没有进一步的延长是合理的（在这种情况下，仅测试雄性小鼠，经过回顾性调查，发现它们不是产仔）。 请点击此处查看此图的放大版本。

必须使用进一步的读出方法来描述对动物行为绝望的更广泛观点。提供各种行为测试，电生理学测量和压力诱导变化的分子评估。 图3给出了尾部悬浮试验（TST）的示例结果，包括CDM，丙咪嗪和氯胺酮处理，鼻子戳 - 蔗糖偏好试验（NPSPT）以及使用膜片钳技术的长期增强评估。这些结果鼓励使用CDM诱导阶段作为诱导行为绝望的一般工具。关于所用技术的进一步详情（TST、NPSPT、LTP评估），见9，10，17，20。

图3:CDM小鼠的其他结果。 （A）清洁发展机制在尾部悬浮试验中效果的示例性表示。小鼠被尾巴悬挂，并记录不动所花费的时间（有关方法学细节，请参见9）。每个点代表单个动物的静止时间，条形表示测试动物的平均值。具有 Bonferroni 事后 检验的单因子方差分析: ∗∗∗p < 0.001。（B）最近建立的在CDM小鼠中鼻子戳蔗糖偏好测试的代表性结果表示为SEM±手段。在这项任务中，通过逐渐增加的努力来测量蔗糖的偏好，以达到蔗糖瓶（鼻塞次数）（有关方法学细节，请参阅10）。请注意，CDM中蔗糖的偏好降低，并且CDM和对照组小鼠之间的差异随着努力（每天的鼻子戳平均值表示为Nspk1-7）小鼠必须应用以饮用甜溶液而逐渐增加。具有 Bonferroni 事后 检验的双向方差分析: ∗∗p < 0.01， ∗∗∗p < 0.001。（C）CDM依赖性长期突触可塑性的变化表现为在WT小鼠的海马脑切片中应用关联LTP诱导方案后EPSP平均值的变化。 ±数据是通过刺激CA3-CA1突触获得的（有关详细信息，请参阅17，20）。未配对 的 t 检验 ，∗∗p < 0.01，数据表示为 SEM ±均 值。

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